專利名稱：產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因工程菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌 的基因工程菌及其制備方法和所用的重組載體和轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
柔紅霉素以及以其為原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(印irubicin)是 目前臨床上十分重要的抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素。表阿霉素的心臟毒性和骨髓毒性比阿霉素更 低，而抗腫瘤的效果相當(dāng)或更高。表柔紅霉素(印i-daimorubicin)是工業(yè)生產(chǎn)表阿霉素的 重要前體，其與柔紅霉素的差別僅在于分子中脫氧糖C4位羥基構(gòu)型不同。由化學(xué)合成法 從柔紅霉素到表柔紅霉素需要經(jīng)過多步條件要求苛刻的反應(yīng)過程，并會造成環(huán)境污染。如 果采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)將會大大節(jié)約成本，提高效率。若要柔紅霉素的產(chǎn)生菌改 造成可以直接在體內(nèi)合成表柔紅霉素的菌株，需要改變TDP-L-柔紅糖胺的生物合成過程 中的一個步驟。其中dnmV為TDP-6-脫氧糖C4酮基還原酶，它決定了菌株分子中脫氧糖 C4位羥基構(gòu)型反應(yīng)，使其生成柔紅霉素。阿韋菌素酮基還原酶即ave BIV的與dnmV的立 體選擇性正好相反。威斯康辛大學(xué)的Hutchinson教授將aveBIV基因，導(dǎo)入柔紅霉素產(chǎn)生 菌(波賽鏈霉菌)，并中斷柔紅糖胺的產(chǎn)生，構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生表柔紅霉素(Krishnamurthy Madduri，Jonathan Kennedy，Giovanni Rivola,et al. Production of the antitumor drug epirubicin(4 ' _epidoxorubicin)and its precursorby a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius [J]. NatureBiotechnology, 1998,16 :69_74)。而本申 請人之前在產(chǎn)柔紅霉素天藍(lán)色鏈霉菌SIPI-1482中，中斷了柔紅糖胺生物合成基因dnmV， 插入了 aveBIV基因和阿伯拉霉素(又名安普霉素)的抗性基因，構(gòu)建了表柔紅霉素產(chǎn)生菌 (中國專利申請200610146614. 6)。這種方法構(gòu)建的工程菌產(chǎn)表柔紅霉素產(chǎn)量較低，經(jīng)過我 們驗證其發(fā)酵產(chǎn)量不超過20mg/L，且不穩(wěn)定，連續(xù)傳代2次以上發(fā)酵單位就有明顯的降低。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉 菌的基因工程菌表柔紅霉素產(chǎn)量不高，遺傳穩(wěn)定性低的不足，提供一種改良的生產(chǎn)表柔紅 霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因工程菌，該菌表柔紅霉素產(chǎn)量大大高于現(xiàn)有的表柔紅霉素生產(chǎn) 菌，并且傳代非常穩(wěn)定。本發(fā)明還提供該生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌 的制備方法和所用的重組載體和轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)研究和反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基 因工程菌中的外來插入基因包括抗生素抗性基因和aveBIV基因?？股乜剐曰蛴?kb的 長度，是篩選標(biāo)記，aveBIV基因是使天藍(lán)淡紅鏈霉菌產(chǎn)生表柔紅霉素的基因，外來插入基因 片段過大，影響了工程菌的遺傳穩(wěn)定性和表柔紅霉素的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明人將外來基因改 變?yōu)閮H由aveBIV基因及其啟動子組成，沒有加入抗生素抗性基因，大大減小外來基因的長 度。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入含有啟動子和aveBIV基因的整合質(zhì)粒，使紅霉素啟動子和aveBIV基因隨機(jī)整合到整個基因組上，倍增了紅霉素啟動子和aveBIV 基因，從而可以篩選到表柔紅霉素產(chǎn)量進(jìn)一步增高的突變菌株。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在基因工 程菌的制備中增加同源重組雙交換的交換臂長度可以大大增加雙交換的頻率，篩選雙交換 子的工作量大大減小，從而快速的完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán) 淡紅鏈霉菌的基因工程菌，其是一種在天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者 置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達(dá)aveBIV(阿維菌素酮 基還原酶)的基因工程菌，其中，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的 第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。根據(jù)本發(fā)明，所述的啟動子較佳的是紅霉素啟動子，更佳的所述的啟動子的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列。所述的aveBIV基 因又稱阿維菌素酮基還原酶基因。所述的aveBIV基因的核苷酸序列較佳的是如序列表中 SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。所述的dnmV基因又稱胸腺嘧啶核苷二磷酸_6_脫 氧糖C4酮基還原酶基因。根據(jù)本發(fā)明，所述的第一外源基因插入于天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因 中，或者與dnmV基因中的DNA片段置換。所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因序列 被外來基因置換的部分最大長度可以是整個dnmV基因，較佳的是dnmV基因的第273位 675位之間的核苷酸片段被置換掉。因此，dnmV基因被阻斷而不能表達(dá)。而插入的第一外 源基因，即啟動子和aveBIV基因的連鎖片段可以表達(dá)，從而使該被改造了的天藍(lán)淡紅鏈霉 菌可以產(chǎn)生表柔紅霉素。根據(jù)本發(fā)明，所述的第二外源基因整合于本發(fā)明的天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因工程菌的 基因組中。在基因組中的整合位置是在基因組的任何位置，只要不影響菌株本身的生物合 成，能夠高產(chǎn)表柔紅霉素的情況，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株較佳的選用國內(nèi)工業(yè)用菌株——天 藍(lán)淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發(fā)明先構(gòu)建了一種重組穿梭質(zhì)粒，其含有由在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV 基因連鎖的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、啟動子、aveBIV基因、dnmV基因3’端 片段、以及在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV基因連鎖的上游基因或其片段依次連鎖組 成的DNA片段。在野生型天藍(lán)淡紅鏈霉菌中，基因dnmZ、dnmU、dnmV、dnmj和dnml依次連 鎖表達(dá)，dnmZ和dnmU在dnmV的上游，dnmj和dnml在dnmV的下游，該連鎖基因的核苷酸 序列已公開(GenBank登錄號AF006633)。本發(fā)明的重組穿梭載體中含有的重組片段較佳 的則是在上述連鎖序列的dnmV基因序列中插入或者由部分dnmV基因序列置換成啟動子 和aveBIV基因的序列。dnmV基因中被置換序列的長度最大可以是整個dnmV基因，較佳的 是dnmV基因中間的核苷酸序列。也就是說，本發(fā)明的重組穿梭載體含有的重組DNA序列較 佳的是由dnmZ基因或其片段、dnmU基因、在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmU基因連鎖的 dnmV基因片段、啟動子、aveBIV基因、在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmj基因連鎖的dnmV 基因片段、dnmj基因和dnml基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。本發(fā)明中所述的啟 動子較佳的是紅霉素啟動子。較佳的，所述的重組穿梭載體中含有的重組片段，即所述的依 次連鎖組成的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。其中第1 617位核苷酸序列是所述的dnmZ基因片段；第618 1251位核苷酸序列是所述的dnmU基因；第 1252 1524位核苷酸序列是所述的在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmU基因連鎖的dnmV 基因片段；第1525 2198位核苷酸序列是所述的紅霉素啟動子；第2199 3492位核苷 酸序列是所述的aveBIV基因；第3493 3741位核苷酸是所述的在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因 組中與dnmj基因連鎖的dnmV基因片段；第3742 4855位核苷酸是所述的dnmj基因；第 4856 5028位核苷酸是所述的dnml基因。本發(fā)明構(gòu)建的重組穿梭質(zhì)粒可用于與天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組發(fā)生同源雙交換，從 而得到生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌。其中，在該重組穿梭載體中，所述 的dnmZ、dnmU和與dnmU連鎖的dnmV片段的部分是發(fā)生同源重組雙交換的左臂；與dnmj連 鎖的dnmV片段、dnmj和dnml的部分是發(fā)生同源重組雙交換的右臂。啟動子和aveBIV基 因的部分是發(fā)生重組雙交換時導(dǎo)入的外來基因。所述的左臂的長度可以是500 2000bp， 較佳的是1525bp，即序列表中SEQ ID NO. 1第1 1524位所示的序列。所述的右臂的長度 可以是500 2000bp，較佳的是1536bp，即序列表中SEQ IDN0. 1第3293 5028位所示的 序列。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組穿梭質(zhì)粒的骨架較佳的是質(zhì)粒pKC1139。將所述的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化子。所述的宿主細(xì)胞較佳的是大 腸桿菌ET12567。將該轉(zhuǎn)化子和天藍(lán)淡紅鏈霉菌接合，挑選同源雙交換接合子。所述的天藍(lán) 淡紅鏈霉菌較佳的是天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482。該同源雙交換接合子即dnmV基因中插入 了 aveBIV基因的天藍(lán)淡紅鏈霉菌突變株。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種重組載體，其含有啟 動子和aveBIV基因的連鎖片段。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體的載體骨架較佳的是質(zhì)粒 PSET152。所述的啟動子較佳的是紅霉素啟動子(ErmP)。所述的啟動子和aveBIV基因的連 鎖片段的核苷酸序列較佳的如序列表中SEQ ID NO. 1第1525 3492位所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是一種轉(zhuǎn)化子，其含有所述的 重組載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞較佳的是大腸桿菌ET12567。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之四是一種制備生產(chǎn)表柔紅霉素的 天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌的方法，其中，包括將如上所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)表柔紅霉素的 天藍(lán)淡紅鏈霉菌接合，挑選接合子。用阿伯拉霉素篩選，能長出的就是質(zhì)粒已經(jīng)整合在基因 組上的接合子。根據(jù)本發(fā)明，所述的產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌較佳的是基因組中的 dnmV基因中插入了 aveBIV基因的天藍(lán)淡紅鏈霉菌突變株。所得的接合子即本發(fā)明的生產(chǎn) 表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌，其基因組中整合著2個外源基因，這兩個外 源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。所述的產(chǎn)柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌較佳 的是天藍(lán)淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發(fā)明所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌可用于生產(chǎn)表柔紅霉素。因此，本發(fā) 明還提供一種制備表柔紅霉素的的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明上述天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程 菌，從培養(yǎng)物中獲得表柔紅霉素。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明將產(chǎn)柔紅霉素的天藍(lán)色淡紅鏈 霉菌進(jìn)行改造，一方面敲除了其中的部分dnmV基因，置換入aveBIV基因，通過基因置換法得到了生產(chǎn)的表柔紅霉素的工程菌；另一方面，通過隨機(jī)互補(bǔ)法，將另一個aveBIV基因整 合入基因組中，從而在最低限度影響菌株本身生物合成的情況下2次轉(zhuǎn)入aveBIV基因，從 而使得表柔紅霉素的產(chǎn)量又有了很大的一個提高。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，不含有任何抗 性標(biāo)記，很方便用于進(jìn)一步的基因工程改造。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，表柔紅霉素產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn) 大于現(xiàn)有的方法，最好可達(dá)70mg/L。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，通過連續(xù)傳代，表柔紅霉素產(chǎn) 量非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。在本發(fā)明的制備方法中，增加了雙交換雙臂的長度。中國專利申請 200610146614. 6公開的方法中，交換雙臂的長度是700bp，本發(fā)明的優(yōu)選方案中交換雙臂 的長度是1500bp，增大了雙交換發(fā)生的幾率，加快雙交換接合子的篩選。本發(fā)明采用PCR來 篩選突變株，解決了插入抗性基因作為篩選標(biāo)記(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外來基 因片段過大所帶來的影響上下游基因的轉(zhuǎn)錄的問題，從而保持剩下的dnmV基因的兩端的 堿基和編碼氨基酸不變，最大限度的減少中斷dnmV和插入aveBIV基因?qū)ι舷掠蔚幕虻?影響，大大增加了菌株的穩(wěn)定性，提高了表柔紅霉素產(chǎn)量。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是含aveBIV基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖2是定點(diǎn)插入質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3是表柔紅霉素生產(chǎn)菌的構(gòu)建策略示意圖。圖4是PCR驗證的電泳圖。M，marker ;1，雙交換基因型；2，回復(fù)基因型。圖5是產(chǎn)表柔紅霉素的工程菌的發(fā)酵液的HPLC分析圖譜。圖 6 是 PCR 驗證的電泳圖。M，marker ； 1，ErmP+aveBIV。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述 的“室溫”是指進(jìn)行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。所使用的工具酶和DNA分子量標(biāo)記均購自寶生物公司(Takara)，具體的反應(yīng)條件 和使用的方法均參考商品說明書所使用的膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，使用方法 參考商品說明書。大腸桿菌E. coli DH5a、ET12567，購自上海鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482可從上海醫(yī)藥工業(yè)研究院取得。實(shí)施例1雙交換左右臂與aveBIV序列的克隆在天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482中，dnmZ和dnmU依次在dnmV的上游，dnmj和dnml 依次在dnmV的下游，本發(fā)明取dnmZ、dmnU加一部分dmnV作為雙交換的左臂，dnml、dnmj加 一部分dmnV作為雙交換的右臂來構(gòu)建雙交換質(zhì)粒。首先根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的天藍(lán)淡紅鏈霉菌 SIPI-1482相應(yīng)序列(GenBank登錄號AF006633)設(shè)計引物左臂上游引物為5，-AAAAAGCTTCTGGGACGGAATGGGC-3，，左臂下游引物為5，-AAATTCGAATCGCACCAGTCGCAGATG-3，；
右臂上游引物為5，-AAATCTAGAGGGCTGGTCGTCAACATC-3，，右臂下游引物為5，-AAAGGATCCCATCAAACTCCGCAAGACAT-3，。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482的 總基因組為模板。使用寶生物公司的primer star高保真DNA聚合酶來進(jìn)行片段的克隆。 PCR條件為98°C，10s、66°C，15s、72°C，2min。PCR產(chǎn)物上樣電泳后，回收目的條帶?；厥?的片段與質(zhì)粒進(jìn)行連接，左臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì)粒PSP72 (購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司)，接入位點(diǎn)Hindlll和Xbal，命名為pSL-02-3-1并測序；右臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì) 粒pSP72，接入位點(diǎn)Xbal和EcoRV，命名為pSL_R15，并測序。左臂序列與GenBank登錄號 AF006633中的相應(yīng)序列比對為97. 4%的同源性，右臂序列與編號AF006633中的相應(yīng)序列 比對為99. 3%的同源性。在PubMed上查到aveBIV的基因序列，設(shè)計相應(yīng)的引物上游引物5’-AAAAGATCT GCACGGGTCAACGGGTAA-3，，下游引物5，-AAAAGATCTTGATGTCGAGCGGCTACG-3，。以阿維鏈霉 菌S. avermitilis (購自ATCC公司)的總DNA為模板，用primer star高保真DNA聚合酶 擴(kuò)增得到aveBIV的基因。aveBIV基因連入質(zhì)粒pSP72，連接位點(diǎn)Bglll和Bglll，得到質(zhì)粒 pSL-02-20-l。以紅霉素生產(chǎn)菌株S. erythraea HL 3168E3 (購自ATCC公司)的基因組為模板，上 游引物 5，-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3，，下游引物 5，-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3，， 進(jìn)行PCR，所得PCR產(chǎn)物純化后連接在質(zhì)粒pGEM-3zf (購自上海生工)上，得到質(zhì)粒 pSL-HM-312,即含有紅霉素啟動子的重組載體。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI從質(zhì)粒 pSL-HM-312切得紅霉素啟動子，把紅霉素啟動子連入質(zhì)粒pSET152(購自上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司)得到pSL-02-18-1，接入位點(diǎn)為EcoRI和BamHI。用Bglll從 pSL-02-20-1切的aveBIV基因正向連入pSL-02-18-1，此質(zhì)粒即為插入紅霉素啟動子和 aveBIV結(jié)構(gòu)基因的pSET152隨機(jī)整合質(zhì)粒，命名為pSL-02-22_l。設(shè)計并合成PCR引物，上 游引物為 5，-AAATCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3，，下游引物為 5，-AAATCTAGATGATGTCGAG CGGCTACG-3，。以質(zhì)粒pSL-02-22-l為模板，擴(kuò)增出紅霉素啟動子和aveBIV基因連鎖的DNA 片段(ErmEP+aveBIV基因)，聯(lián)入質(zhì)粒pSP72，接入位點(diǎn)Xbal和Xbal，得到重組質(zhì)粒，命名 為pSL-02-26-1，測序，所得aveBIV基因的核苷酸序列見序列表中SEQ ID NO. 1第2199 3492位所示，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的的aveBIV基因序列(序列登錄號AB032523)比對的同源 性為100%，質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖1。實(shí)施例2雙交換定點(diǎn)插入質(zhì)粒的構(gòu)建、接合轉(zhuǎn)移實(shí)施例1中的右臂聯(lián)入質(zhì)粒pKC1139(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司公司)，接入位點(diǎn)Xbal和EcoRV，得到質(zhì)粒，命名為pSL-02-7-1。左臂正向聯(lián)入質(zhì)粒 pSL-02-7-1，接入位點(diǎn)Hindi 11和Xbal，得到質(zhì)粒，命名為pSL-02-12-l。采用限制性內(nèi)切酶 Xbal從實(shí)施例1中的pSL-02-26-1質(zhì)粒中切出ErmEP+aveBIV基因正向聯(lián)入pSL-02_12_l 中，此質(zhì)粒即為雙交換敲除dmnV，同時定點(diǎn)插入aveBIV的表柔紅霉素表達(dá)整合質(zhì)粒。用此 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸DH5 a，調(diào)取轉(zhuǎn)化子在LB中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR驗證，最終構(gòu)建成 雙交換定點(diǎn)插入質(zhì)粒，命名為pSL-02-30-1。構(gòu)建策略見圖2。從天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482斜面挑取適量菌體于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)56小 時左右達(dá)到對數(shù)生長期，(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時左右使菌體達(dá)到對數(shù)生長后期，離心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體培養(yǎng)基洗滌2次 (4000rpm, IOmin, 4°C )，最后重懸于20ml LB培養(yǎng)基中，待用。用pSL-02-30-l轉(zhuǎn)化感受態(tài) 大腸桿菌ET12567，挑轉(zhuǎn)化子至裝有4ml LB培養(yǎng)基[含阿伯拉霉素(Am) 100 μ g/ml、卡那霉 素(Kn)25yg/ml、氯霉素(Cm) 100 μ g/ml]的小試管中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時。大腸桿菌 ET12567接種于裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)4小時左右，使菌液 OD值在0. 4 0. 6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm, IOmin, 4°C )， 倒去上清，菌體用20mlLB培養(yǎng)基洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重懸于1 2ml LB 培養(yǎng)基中。將該大腸菌液與之前待用的天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482菌絲體以1 1(重懸 液體積比)于EP管中混勻。將混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30°C恒溫箱培 養(yǎng)。培養(yǎng)20小時后，取出平板，涂抗生素，用量為每10個平板涂IOml雙蒸水、100 μ 1 Am和 400μ1萘啶酸(NC)的混合液，再于30°C恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后出現(xiàn)接合子。表柔紅霉 素產(chǎn)生菌的構(gòu)建過程見圖3。實(shí)施例3雙交換工程菌的篩選挑取實(shí)施例2所得的接合子于裝有4ml TSB培養(yǎng)基的小試管中(含Am50 μ g/ml、 試管中加入2 3粒直徑2 5毫米的玻璃珠)，30°C振蕩培養(yǎng)。菌液搖濃后，取1 μ 1菌液 稀釋于Iml無菌水中，混勻后取100 μ 1涂含Am 50 μ g/ml的高氏一號平板，37°C培養(yǎng)。因 為PKC1139質(zhì)粒是溫敏型質(zhì)粒，只有整合到染色體上才能存活，所有出來的整合子已經(jīng)發(fā) 生過同源重組交換。4至5天后，挑取整合子于無抗生素的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代， 促使其發(fā)生雙交換。取第3代菌液1 μ 1，稀釋于IOml的無菌水中，混勻后取100 μ 1涂高 氏一號平板(無抗性)，30°C培養(yǎng)。4至5天后，出現(xiàn)單菌落，挑取同一個單菌落分別在有抗 性與無抗性的平板上培養(yǎng)，篩選無抗性平板生長，而抗性平板不生長的菌落，得到30個菌 落。在無抗性平板生長而在抗性平板不生長的克隆就是發(fā)生雙交換或者回復(fù)的克隆。挑取 菌落在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后抽提其總DNA。在左右臂上設(shè)計相應(yīng)的引物，上游引物 5，-ACGGGTGGGACGTGCAC-3，，下游引物5，-CACATGCTGTGGACGGAG-3，，進(jìn)行 PCR 驗證。PCR 產(chǎn) 物的電泳圖見圖4。擴(kuò)增出SOObp的片段的是回復(fù)型的野生菌株基因組，擴(kuò)增出2400bp的 片段的是雙交換突變株基因組。我們從30個菌落中篩選到6個雙交換突變株，雙交換發(fā)生 幾率很高。實(shí)施例4產(chǎn)表柔紅霉素的工程菌的發(fā)酵驗證挑取實(shí)施例3中能擴(kuò)增出2400bp片段的雙交換突變株于高氏一號斜面30°C培養(yǎng)， 培養(yǎng)15天后，接種于種子培養(yǎng)液(淀粉2. O,玉米粉2. O,葡萄糖1. 0，麩皮1. 0，麩質(zhì)粉1. 0， MgSO4O. 1，K2HP040. l(g/100ml))。種子培養(yǎng)液培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉7.0，葡 萄糖 1. 0，麩皮 1. 0，麩質(zhì)粉0. 75，K2HPO4O. 01，(NH4)2SO4O. 1)，接種量 10% (v/v)。30°C，220r/ m培養(yǎng)5天后放瓶，發(fā)酵液用草酸調(diào)pH值至5左右，再加2倍體積的丙酮混勻浸泡5小時以 上，離心后取上清做HPLC分析。HPLC條件，流動相0. (ν/ν)甲酸的乙腈0.1% (ν/ ν)甲酸的水溶液=72 28，流速lml/min，柱溫35°C，檢測波長254nm，進(jìn)樣量5μ 1，分 析柱Agilent ClS0 HPLC分析結(jié)果見圖5，可見通過雙交換定點(diǎn)插入的工程菌，發(fā)酵產(chǎn)物 中已經(jīng)不存在柔紅霉素組分，而表柔紅霉素的濃度在45mg/L左右。實(shí)施例5aveBIV整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入aveBIV置換dnmV的表柔突變株(1)用隨機(jī)整合質(zhì)粒pSL-02-22-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567感受態(tài)細(xì)胞，挑轉(zhuǎn)化子至4ml LB (AmlOO u g/ml, Kn25 u g/ml, CmlOO u g/ml)的小試管中 37°C振蕩培養(yǎng) 12 小時，然后 按2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于50ml LB的250ml三角瓶，37°C振蕩培養(yǎng)4小時左右，使菌液 0D值在0. 4 0. 6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm, lOmin, 4°C )， 倒去上清，菌體用20ml LB洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重懸于1 2ml LB中，備用。(2)挑取實(shí)施例3中所得的能擴(kuò)增出2400bp片段的雙交換突變株于高氏一號斜 面，30°C培養(yǎng)15天后，從斜面挑取適量菌體于50ml TSB中培養(yǎng)56小時左右達(dá)到對數(shù)生長 期，按(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于50ml TSB培養(yǎng)48小時左右使菌液達(dá)到對數(shù)生長后期，離 心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體洗滌2次(4000rpm，lOmin, 4°C )，最后重 懸于20ml LB，備用。(3)將步驟(1)中所得備用的大腸菌液與步驟(2)中所得備用的菌絲體按重懸液 體積比1 1于EP管中混勻。將混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30°C恒溫箱培 養(yǎng)。培養(yǎng)20小時后，取出平板，涂抗生素仏11150118/111(奈啶酸)50118/1111)，再于301 恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后長出的菌落即為接合子。NC是抗大腸桿菌的，所以所得菌落不可 能是質(zhì)粒pSL-02-22-1隨機(jī)整合大腸桿菌的轉(zhuǎn)化子，而雙交換突變株是不能在Am抗性下存 活的，所以經(jīng)過Am和NC的篩選就得到了目的接合子。實(shí)施例6突變株總DNA的抽提以及基因型的驗證挑取接合子于液體TSB培養(yǎng)中(Am 50 u g/ml)進(jìn)行抗性驗證，30°C，220r/m培養(yǎng)2 天后篩選出可以生長的菌株。取上述可以在抗性TSB中培養(yǎng)的菌液1.5ml，離心倒去上清， 用500 ill 31￡重懸菌絲體后，800017/!^11離心2111111，倒掉上清后重復(fù)洗滌一次。500111 STE 懸浮菌絲體，加入溶菌酶，終濃度為2mg/L (溶菌酶為固體，可以先加入STE中，配成2mg/L)， 37°C，水浴30min。然后加入250 yl，2% (w/v)的SDS振勻。加入250 yl的酚氯仿(體 積比1 1)振勻，15000r/min，10min，取上清(分界處有白色變性蛋白質(zhì)，由于整個上清 比較黏稠，需要連著變性蛋白質(zhì)一起吸入)。重復(fù)上一步驟7 8次至上清無明顯黏稠現(xiàn) 象。接著用與上清等體積的氯仿抽提酚，移取上清，加入1/10體積的3M NaAC，加等體積異 丙醇，來回顛倒混勻，室溫放置30min，12000r/min離心5min。最后用70% (v/v)乙醇洗滌 一次，于室溫?fù)]干，得到的白色固體即總DNA，將其溶于50 yl的雙蒸水。以此總 DNA 作為模板，利用通用引物 M13-47 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ 和 RV-M:5' -GAGCGGATMCMTTTCACACAGG-3 ‘進(jìn)行 PCR。PCR 程序95 °C，3min ;94°C，lmin ； 55°C，lmin ；72°C，lmin (步驟二到步驟四30個循環(huán))；最后72°C，2min。PCR產(chǎn)物電泳圖見圖 6?？梢奝CR產(chǎn)物是大約2KB左右的片段，就是ErmP+aveBIV的大小，表明ErmP+aveBIV已經(jīng) 轉(zhuǎn)入整合質(zhì)粒。實(shí)施例7產(chǎn)表柔紅霉素的工程菌的發(fā)酵驗證挑取接合子于含有50mg/L阿伯拉霉素的高氏一號斜面，30°C培養(yǎng)15天后，挑取適 量菌體于種子液中培養(yǎng)，30°C，220r/m培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220r/m培養(yǎng)5 天后放瓶，發(fā)酵液用草酸調(diào)PH值至pH5，再加2倍體積的丙酮混勻浸泡5小時，離心后取上 清做HPLC分析。HPLC條件，流動相0. (v/v)甲酸的乙腈0.1% (v/v)甲酸的水溶 液=72 28，流速:lml/min，柱溫:35°C，檢測波長:254nm，進(jìn)樣量:5iil，分析柱:Agilent C18。HPLC分析結(jié)果顯示所有通過雙交換定點(diǎn)插入以及倍增aveBIV的工程菌單菌落發(fā)酵產(chǎn)物中都已經(jīng)沒有柔紅霉素，而表柔紅霉素的濃度都有所提高，最高達(dá)70mg/L左右。序列表<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院<120>產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因工程菌及其制備方法<130>P4-091166C<160>1<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>5028<212>DNA<213>Artificial<220><223> 重組 DNA<220><221>misc_feature<222>(62). . (62)<223>n is a, c, g, or t<220><221>promoter<222> (1525) (2198)<223>紅霉素啟動子<220><221>gene<222> (2199) (3492)<223>aveBIV 基因<400>1ctgggacggagntggaccggcgccgggcaggaggatcgccggtggccgagcaccgccgacgatgacgccccgactgcctggtaccgcgatctacctgagcggagtcggagagccggaggttcacggccgc
10
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1權(quán)利要求
一種生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌，其是一種在天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達(dá)aveBIV的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的啟動子的核苷酸序列是序列 表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列，所述的aveBIV基因的核苷酸序 列是如序列表中SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的 dnmV基因的第273位 675位之間的核苷酸片段被所述的第一外源基因置換掉。
4.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的第二外源基因在基因組中的 整合位置是在基因組的任何位置。
5.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株是 天藍(lán)淡紅鏈霉菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482。
6.一種重組載體，其含有啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。
7.如權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體的載體骨架是質(zhì)粒 PSET152，所述的啟動子和aveBIV基因的連鎖片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 第1525 3492位所示。
8.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，其含有權(quán)利要求6 7任一項所述的重組載體。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞是大腸桿菌 ET12567。
10.一種制備生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌的方法，其特征在于，包 括將如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌接合，挑選接合子。
11.一種制備表柔紅霉素的的方法，其特征在于，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1 5任一項所 述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得表柔紅霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌，其是一種在天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達(dá)aveBIV(阿維菌素酮基還原酶)的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程菌，不含有任何抗性標(biāo)記，很方便用于進(jìn)一步的基因工程改造；表柔紅霉素產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于已有方法，最好可達(dá)70mg/L；通過連續(xù)傳代，表柔紅霉素產(chǎn)量非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。
文檔編號C12N1/21GK101892185SQ200910051619
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者景蘭, 李繼安, 邵雷, 陳代杰, 黃佳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院