專利名稱：產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌 的基因工程菌及其制備方法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
柔紅霉素以及以其為原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(印irubicin)是 目前臨床上十分重要的抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素。表阿霉素的心臟毒性和骨髓毒性比阿霉素更 低，而抗腫瘤的效果相當(dāng)或更高。表柔紅霉素(印i-daimorubicin)是工業(yè)生產(chǎn)表阿霉素的 重要前體，其與柔紅霉素的差別僅在于分子中脫氧糖C4位羥基構(gòu)型不同。由化學(xué)合成法 從柔紅霉素到表柔紅霉素需要經(jīng)過多步條件要求苛刻的反應(yīng)過程，并會造成環(huán)境污染。如 果采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)將會大大節(jié)約成本，提高效率。若要柔紅霉素的產(chǎn)生菌改 造成可以直接在體內(nèi)合成表柔紅霉素的菌株，需要改變TDP-L-柔紅糖胺的生物合成過程 中的一個(gè)步驟。其中dnmV為TDP-6-脫氧糖C4酮基還原酶，它決定了菌株分子中脫氧糖 C4位羥基構(gòu)型反應(yīng)，使其生成柔紅霉素。阿韋菌素酮基還原酶即ave BIV的與dnmV的立 體選擇性正好相反。威斯康辛大學(xué)的Hutchinson教授將aveBIV基因，導(dǎo)入柔紅霉素產(chǎn)生 菌(波賽鏈霉菌)，并中斷柔紅糖胺的產(chǎn)生，構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生表柔紅霉素(Krishnamurthy Madduri,Jonathan Kennedy,Giovanni Rivola,et al. Production of the antitumor drug epirubicin(4 ' -epidoxorubicin)and its precursorby a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius [J]. NatureBiotechnology, 1998,16 :69_74)。而本申 請人之前在產(chǎn)柔紅霉素天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482中，中 斷了柔紅糖胺生物合成基因dnmV，插入了 aveBIV基因和阿伯拉霉素(又名安普霉素)的抗 性基因，構(gòu)建了表柔紅霉素產(chǎn)生菌(中國專利申請200610146614. 6)。這種方法構(gòu)建的工程 菌產(chǎn)表柔紅霉素產(chǎn)量較低，經(jīng)過我們驗(yàn)證其發(fā)酵產(chǎn)量不超過20mg/L，且不穩(wěn)定，連續(xù)傳代2 次以上發(fā)酵單位就有明顯的降低。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉 菌的dnmV基因阻斷工程菌產(chǎn)量不高，遺傳穩(wěn)定性低的不足，提供一種改良的天藍(lán)淡紅鏈霉 菌的dnmV基因阻斷工程菌，該菌表柔紅霉素產(chǎn)量大大高于現(xiàn)有的表柔紅霉素生產(chǎn)菌，并且 傳代非常穩(wěn)定。本發(fā)明還提供該生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌的制備方 法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)研究和反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的 dnmV基因阻斷工程菌中的外來插入基因片段過大，影響了工程菌的遺傳穩(wěn)定性和表柔紅霉 素的產(chǎn)量，其中的外來基因包括抗生素抗性基因和aveBIV基因?？股乜剐曰蛴?kb的 長度，是篩選標(biāo)記，aveBIV基因是使天藍(lán)淡紅鏈霉菌產(chǎn)生表柔紅霉素的基因。因此，本發(fā)明人將外來基因改變?yōu)閮H由aveBIV基因及其啟動子組成，沒有加入抗生素抗性基因，大大減 小外來基因的長度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在基因阻斷工程菌的制備中增加同源重組雙交換的交 換臂長度可以大大增加雙交換的頻率，篩選雙交換子的工作量大大減小，從而完成了本發(fā) 明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種生產(chǎn)表柔紅霉素 的天藍(lán)淡紅鏈霉菌(Str印tomyces coeruleorubidus)的基因工程菌，其是一種在天藍(lán)淡紅 鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為外來基因，使dnmV基因被阻斷的基因阻斷 工程菌，所述的外來基因中包含aveBIV基因使該基因阻斷工程菌表達(dá)aveBIV (阿維菌素酮 基還原酶)，其中，所述的外來基因是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。根據(jù)本發(fā)明，所述的啟動子較佳的是紅霉素啟動子，更佳的所述的啟動子的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列。所述的aveBIV基 因又稱阿維菌素酮基還原酶基因。所述的aveBIV基因的核苷酸序列較佳的是如序列表中 SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。所述的dnmV基因又稱胸腺嘧啶核苷二磷酸_6_脫 氧糖C4酮基還原酶基因。根據(jù)本發(fā)明，所述的外來基因插入于天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中，或 者與dnmV基因中的DNA片段置換。所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因序列被外 來基因置換的部分最大長度可以是整個(gè)dnmV基因，較佳的是dnmV基因的第273位 675 位之間的核苷酸片段被置換掉。因此，dnmV基因被阻斷而不能表達(dá)。而插入的外來基因， 即啟動子和aveBIV基因的連鎖DNA片段可以表達(dá)，從而使該被改造了的天藍(lán)淡紅鏈霉菌可 以產(chǎn)生表柔紅霉素。根據(jù)本發(fā)明，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株較佳的選用國內(nèi)工業(yè)用菌株——天 藍(lán)淡紅鏈霉菌(Str印tomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種重組穿梭載體，其含有 由在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV基因連鎖的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、 啟動子、aveBIV基因、dnmV基因3’端片段、以及在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV基因連 鎖的上游基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。在野生型天藍(lán)淡紅鏈霉菌中，基因dnmZ、dnmU、dnmV、dnmj和dnml依次連鎖表達(dá)， dnmZ和dnmU在dnmV的上游，dnmj和dnml在dnmV的下游，該連鎖基因的核苷酸序列已公 開(GenBank登錄號AF006633)。本發(fā)明的重組穿梭載體中含有的重組片段較佳的則是在 上述連鎖序列的dnmV基因序列中插入或者由部分dnmV基因序列置換成啟動子和aveBIV 基因的序列。dnmV基因中被置換序列的長度最大可以是整個(gè)dnmV基因，較佳的是dnmV基 因中間的核苷酸序列。也就是說，本發(fā)明的重組穿梭載體含有的重組DNA序列較佳的是由 dnmZ基因或其片段、dnmU基因、在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmU基因連鎖的dnmV基因 片段、啟動子、aveBIV基因、在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmj基因連鎖的dnmV基因片段、 dnmj基因和dnml基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。本發(fā)明中所述的啟動子較佳的 是紅霉素啟動子。較佳的，所述的重組穿梭載體中含有的重組片段，即所述的依次連鎖組成 的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。其中第1 617位核苷酸序列是 所述的dnmZ基因片段；第618 1251位核苷酸序列是所述的dnmU基因；第1252 1524 位核苷酸序列是所述的在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmU基因連鎖的dnmV基因片段；第1525 2198位核苷酸序列是所述的紅霉素啟動子 ’第2199 3492位核苷酸序列是所述 的aveBIV基因；第3493 3741位核苷酸是所述的在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmj基 因連鎖的dnmV基因片段；第3742 4855位核苷酸是所述的dnmj基因；第4856 5028位 核苷酸是所述的dnml基因。該重組穿梭載體可用于與天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組發(fā)生同源雙交換，從而得到生產(chǎn) 表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變的工程菌。其中，在該重組穿梭載體中，所述 的dnmZ、dnmU和與dnmU連鎖的dnmV片段的部分是發(fā)生同源重組雙交換的左臂；與dnmj連 鎖的dnmV片段、dnmj和dnml的部分是發(fā)生同源重組雙交換的右臂。啟動子和aveBIV基 因的部分是發(fā)生重組雙交換時(shí)導(dǎo)入的外來基因。所述的左臂的長度可以是500 2000bp，較 佳的是1525bp，即序列表中SEQ ID NO. 1第1 1524位所示的序列。所述的右臂的長度可以 是500 2000bp，較佳的是1536bp,即序列表中SEQ IDN0. 1第3293 5028位所示的序列。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組穿梭載體的骨架較佳的是質(zhì)粒pKC1139。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是一種轉(zhuǎn)化子，其含有所述的 重組穿梭載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞較佳的是大腸桿菌ET12567。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之四是一種制備生產(chǎn)表柔紅霉素的 天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌的方法，其中，包括將如上所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)柔紅霉素的天 藍(lán)淡紅鏈霉菌接合，挑選同源雙交換接合子。根據(jù)本發(fā)明，所述的產(chǎn)柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌較佳的選用國內(nèi)工業(yè)用菌 株-天藍(lán)淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發(fā)明所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌可用于生產(chǎn)表柔紅霉素。因此，本發(fā) 明還提供一種制備表柔紅霉素的的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明上述天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程 菌，從培養(yǎng)物中獲得表柔紅霉素。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明將產(chǎn)柔紅霉素的天藍(lán)色淡紅鏈 霉菌進(jìn)行改造，主要是敲除了其中的部分dnmV基因，置換入aveBIV基因，通過基因置換法 得到了生產(chǎn)的表柔紅霉素的工程菌。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，不含有任何抗性標(biāo)記，很方便 用于進(jìn)一步的基因工程改造。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，表柔紅霉素產(chǎn)量大于用已有方法，最 好可達(dá)45mg/L。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，通過連續(xù)傳代，表柔紅霉素產(chǎn)量非常穩(wěn)定，重復(fù)性 好。在本發(fā)明的制備方法中，增加了雙交換雙臂的長度。在中國專利申請200610146614. 6 公開的方法中，交換雙臂的長度是700bp，本發(fā)明的優(yōu)選方案中交換雙臂的長度是1500bp， 增大了雙交換發(fā)生的幾率，加快雙交換接合子的篩選。本發(fā)明采用PCR來篩選突變株，解決 了插入抗性基因作為篩選標(biāo)記(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外來基因片段過大所帶 來的影響上下游基因的轉(zhuǎn)錄的問題，從而保持剩下的dnmV基因的兩端的堿基和編碼氨基 酸不變，最大限度的減少中斷dnmV和插入aveBIV基因?qū)ι舷掠蔚幕虻挠绊懀蟠笤黾恿?菌株的穩(wěn)定性，提高了表柔紅霉素產(chǎn)量。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果
圖1是含aveBIV基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖2是定點(diǎn)插入質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3是表柔紅霉素生產(chǎn)菌的構(gòu)建策略示意圖。圖4是PCR驗(yàn)證的電泳圖。M，marker ;1，雙交換基因型；2，回復(fù)基因型。圖5是產(chǎn)表柔紅霉素的工程菌的發(fā)酵液的HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。所使用的工具酶和DNA分子量標(biāo)記均購自寶生物公司(Takara)，具體的反應(yīng)條件 和使用的方法均參考商品說明書所使用的膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，使用方法 參考商品說明書。大腸桿菌E. coli DH5a、ET12567，購自上海鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482可從上海醫(yī)藥工業(yè)研究院取得。實(shí)施例1雙交換左右臂與aveBIV序列的克隆在天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482中，dnmZ和dnmU依次在dnmV的上游，dnmj和dnml 依次在dnmV的下游，本發(fā)明取dnmZ、dmnU加一部分dmnV作為雙交換的左臂，dnml、dnmj加 一部分dmnV作為雙交換的右臂來構(gòu)建雙交換質(zhì)粒。首先根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的天藍(lán)淡紅鏈霉菌 SIPI-1482相應(yīng)序列(GenBank登錄號AF006633)設(shè)計(jì)引物左臂上游引物為5，-AAAAAGCTTCTGGGACGGAATGGGC-3，，左臂下游引物為5，-AAATTCGAATCGCACCAGTCGCAGATG-3，；右臂上游引物為5，-AAATCTAGAGGGCTGGTCGTCAACATC-3，，右臂下游引物為5，-AAAGGATCCCATCAAACTCCGCAAGACAT-3，。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482的 總基因組為模板。使用寶生物公司的primer star高保真DNA聚合酶來進(jìn)行片段的克隆。 PCR條件為98°C，10s、66°C，15s、72°C，2min。PCR產(chǎn)物上樣電泳后，回收目的條帶?；厥?的片段與質(zhì)粒進(jìn)行連接，左臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì)粒PSP72 (購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司)，接入位點(diǎn)HindIII和Xbal，命名為pSL-02-3_l并測序；右臂PCR產(chǎn)物聯(lián)入質(zhì) 粒pSP72，接入位點(diǎn)XbaI和EcoRV，命名為pSL_R15，并測序。左臂序列與GenBank登錄號 AF006633中的相應(yīng)序列比對為97. 4%的同源性，右臂序列與編號AF006633中的相應(yīng)序列 比對為99. 3%的同源性。在PubMed上查到aveBIV的基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物上游引物5’-AAAAGATCT GCACGGGTCAACGGGTAA-3，，下游引物5，-AAAAGATCTTGATGTCGAGCGGCTACG-3，。以阿維鏈霉 菌S. avermitilis (購自ATCC公司)的總DNA為模板，用primer star高保真DNA聚合酶 擴(kuò)增得到aveBIV的基因。aveBIV基因連入質(zhì)粒pSP72，連接位點(diǎn)BglII和BglII，得到質(zhì)粒 pSL-02-20-l。以紅霉素生產(chǎn)菌株S. erythraea HL 3168E3 (購自ATCC公司)的基因組為模板，上 游引物 5，-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3，，下游引物 5，-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3，，進(jìn)行PCR，所得PCR產(chǎn)物純化后連接在質(zhì)粒pGEM-3zf (購自上海生工)上，得到質(zhì)粒 pSL-HM-312,即含有紅霉素啟動子的重組載體。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI從質(zhì)粒 pSL-HM-312切得紅霉素啟動子，把紅霉素啟動子連入質(zhì)粒pSET152(購自上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司)得到pSL-02-18-1，接入位點(diǎn)為EcoRI和BamHI。用BglII從 pSL-02-20-1切的aveBIV基因正向連入pSL-02-18-1，此質(zhì)粒即為插入紅霉素啟動子和 aveBIV結(jié)構(gòu)基因的pSET152隨機(jī)整合質(zhì)粒，命名為pSL-02-22_l。設(shè)計(jì)并合成PCR引物，上 游引物為 5，-AAATCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3，，下游引物為 5，-AAATCTAGATGATGTCGAG CGGCTACG-3，。以質(zhì)粒pSL-02-22-l為模板，擴(kuò)增出紅霉素啟動子和aveBIV基因連鎖的DNA 片段(ErmEP+aveBIV基因)，聯(lián)入質(zhì)粒pSP72，接入位點(diǎn)XbaI和Xbal，得到重組質(zhì)粒，命名 為pSL-02-26-1，測序，所得aveBIV基因的核苷酸序列見序列表中SEQ ID NO. 1第2199 3492位所示，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的的aveBIV基因序列(序列登錄號AB032523)比對的同源 性為100%，質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖1。實(shí)施例2雙交換定點(diǎn)插入質(zhì)粒的構(gòu)建、接合轉(zhuǎn)移實(shí)施例1中的右臂聯(lián)入質(zhì)粒pKC1139(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司公司)，接入位點(diǎn)XbaI和EcoRV，得到質(zhì)粒，命名為pSL-02-7_l。左臂正向聯(lián)入質(zhì)粒 pSL-02-7-1，接入位點(diǎn)Hindi11和XbaI，得到質(zhì)粒，命名為pSL-02-12-l。采用限制性內(nèi)切酶 XbaI從實(shí)施例1中的pSL-02-26-1質(zhì)粒中切出ErmEP+aveBIV基因正向聯(lián)入pSL-02_12_l 中，此質(zhì)粒即為雙交換敲除dmnV，同時(shí)定點(diǎn)插入aveBIV的表柔紅霉素表達(dá)整合質(zhì)粒。用此 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸DH5 α，調(diào)取轉(zhuǎn)化子在LB中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR驗(yàn)證，最終構(gòu)建成 雙交換定點(diǎn)插入質(zhì)粒，命名為pSL-02-30-1。構(gòu)建策略見圖2。從天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482斜面挑取適量菌體于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)56小 時(shí)左右達(dá)到對數(shù)生長期，(ν/ν)接種量轉(zhuǎn)接于50ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)左右使菌 體達(dá)到對數(shù)生長后期，離心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體培養(yǎng)基洗滌2次 (4000rpm, IOmin, 4°C )，最后重懸于20ml LB培養(yǎng)基中，待用。用pSL-02-30-l轉(zhuǎn)化感受態(tài) 大腸桿菌ET12567，挑轉(zhuǎn)化子至裝有4ml LB培養(yǎng)基[含阿伯拉霉素(Am) 100 μ g/ml、卡那霉 素(Kn)25yg/ml、氯霉素(Cm) 100 μ g/ml]的小試管中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。大腸桿菌 ET12567接種于裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)4小時(shí)左右，使菌液 OD值在0. 4 0. 6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm, IOmin, 4°C )， 倒去上清，菌體用20mlLB培養(yǎng)基洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重懸于1 2ml LB 培養(yǎng)基中。將該大腸菌液與之前的天藍(lán)淡紅鏈霉菌SIPI-1482菌絲體以1 1(重懸液體 積比)于EP管中混勻。將混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30°C恒溫箱培養(yǎng)。培 養(yǎng)20小時(shí)后，取出平板，涂抗生素，用量為每10個(gè)平板涂IOml雙蒸水、100 μ 1 Am和400 μ 1 萘啶酸(NC)的混合液，再于30°C恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后出現(xiàn)接合子。表柔紅霉素產(chǎn)生菌 的構(gòu)建過程見圖3。實(shí)施例3雙交換工程菌的篩選挑取實(shí)施例2所得的接合子于裝有4ml TSB培養(yǎng)基的小試管中(含Am50 μ g/ml、 試管中加入2 3粒直徑2 5毫米的玻璃珠)，30°C振蕩培養(yǎng)。菌液搖濃后，取1 μ 1菌液 稀釋于Iml無菌水中，混勻后取100 μ 1涂含Am 50 μ g/ml的高氏一號平板，37°C培養(yǎng)。因 為PKC1139質(zhì)粒是溫敏型質(zhì)粒，只有整合到染色體上才能存活，所有出來的整合子已經(jīng)發(fā)生過同源重組交換。4至5天后，挑取整合子于無抗生素的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代， 促使其發(fā)生雙交換。取第3代菌液1 μ 1，稀釋于IOml的無菌水中，混勻后取100 μ 1涂高 氏一號平板(無抗性)，30°C培養(yǎng)。4至5天后，出現(xiàn)單菌落，挑取同一個(gè)單菌落分別在有抗 性與無抗性的平板上培養(yǎng)，篩選無抗性平板生長，而抗性平板不生長的菌落，得到30個(gè)菌 落。在無抗性平板生長而在抗性平板不生長的克隆就是發(fā)生雙交換或者回復(fù)的克隆。挑取 菌落在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后抽提其總DNA。在左右臂上設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，上游引物 5，-ACGGGTGGGACGTGCAC-3，，下游引物5，-CACATGCTGTGGACGGAG-3，，進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。PCR 產(chǎn) 物的電泳圖見圖4。擴(kuò)增出SOObp的片段的是回復(fù)型的野生菌株基因組，擴(kuò)增出2400bp的 片段的是雙交換突變株基因組。我們從30個(gè)菌落中篩選到6個(gè)雙交換突變株，雙交換發(fā)生 幾率很高。實(shí)施例4產(chǎn)表柔紅霉素的工程菌的發(fā)酵驗(yàn)證挑取實(shí)施例3中能擴(kuò)增出2400bp片段的雙交換突變株于高氏一號斜面30°C培養(yǎng)， 培養(yǎng)15天后，接種于種子培養(yǎng)液(淀粉2. 0,玉米粉2. 0,葡萄糖1. 0，麩皮1. 0，麩質(zhì)粉1. 0， MgSO4O. 1，K2HPO4O. 1 (g/100ml))。種子培養(yǎng)液培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉7. 0， 葡萄糖 1.0，麩皮 1.0，麩質(zhì)粉 0.75，K2HPO4O. 01，(NH4)2SO4O. 1 (g/100ml))，接種量 10% (ν/ ν)。30°C，220r/m培養(yǎng)5天后放瓶，發(fā)酵液用草酸調(diào)pH值至5左右，再加2倍體積的丙酮混 勻浸泡5小時(shí)以上，離心后取上清做HPLC分析。HPLC條件，流動相0. (ν/ν)甲酸的乙 腈0. 1% (ν/ν)甲酸的水溶液=72 28，流速lml/min，柱溫35°C，檢測波長254nm， 進(jìn)樣量5 μ 1，分析柱=Agilent ClS0 HPLC分析結(jié)果見圖5，可見通過雙交換定點(diǎn)插入的 工程菌，發(fā)酵產(chǎn)物中已經(jīng)不存在柔紅霉素組分，而表柔紅霉素的濃度在45mg/L左右。序列表
<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
<120>產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌及其制備方法
<130>P4-091165C
<160>1
<170>PatentIn version 3. 4
<210>1
<211>5028
<212>DNA
<213>Artificial (人工序列)
<220>
<223> 重組 DNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(62). . (62)
<223>n is a, c, g, or t
<220>
<221>Promoter
<222>(1525).. (2198)0066
0067
0068
0069
0070
0071
<223>紅霉素啟動子
<220>
<221>gene
<222>(2199). . (3492) <223>aveBIV 基因 <400>1
0072]ctgggacggaatgggcatgcggtcgtcggg cagtgtggac atcgtcttcg acggctgtcc600073]gntggaccgggaccgggtgctgccgcgacg gcgagccggg cgtcgcgacg acgcggcgct1200074]cgccgggcagacgtcagctcgtacgcatgc tggctatcac tcggctacgc cgaggcgctc1800075]gaggatcgccctcacggaactgcgcaggcg cggcggggcg ccggccgggg tgcggaccac2400076]ggtggccgagatagacgcccggctgttcgcgctgcacacggcggtggcgagcgcgttgac3000077]caccgccgaccggctcgccgacgacctcagcggcgacctcgccgcccgcggccgcgccat3600078]gatgacgcccttccagtacgccaagctgctcgtcaaccggcactcggtgggcgtggtgga4200079]cgactgcctgatgctcgtgggaggggccggatacagcaactcccacccgctggcgcgcct4800080]gtaccgcgatgtccgggcgggcgggttcatgcatccatacaacttcacggacggcgtcga5400081]ctacctgagcgaagtggcgttgggccgatgagcggcgggcgacgcgggaccgggatccct6000082]ggagtcggaggacgtggatgaaggcgcgggaactggcggtgcagggggcgtacacgttcg6600083]agccggaggtgtttccggacgagcgggggctgttcgtctcaccgttccgggaggatgcgt7200084]tcacggccgcggtcggccaccccctcttcccggtgcggcagacgaatcacagccggtcgc7800085]ggcgcggggtggtgcggggcgtgcactacaccgtgacgccgccgggctcggccaagtacg8400086]tgtactgcgcccgtggcaggtcgctggacatcgtcgtcgaCgtgCgggtCggctccccga9000087]cgtacggccggtgggacgccgtcgagctggagccgcgtgagttccgggcggtgtacttcc9600088]CggtCggggtggggcacgccttcgtggccctggaggacgacaccgtcatgtcgtacatgc10200089]tgtccggggagtacgtgcaggccaacgaactcgccgtgtcggtgctggacccggccctcg10800090]ggctgcccgtgccgggtgacctggagcctctgctgtccggccgggaccgggctgcaccgc11400091]ccctggagcaggcccgggccgccgggacccttccggagtacgccgcatgcCgggCggtCg12000092]agtcggagctgtggccgccggccgggtcacgcggagacgggtgaggcggacatgcgggtc12600093]gtggttctgggggcgacgggcagcgtcggtcggcaggtgtgtgcggcgtaccaggcgcac13200094]gggtgggacgtgcacggggtggcccgccgcCCggCgCCgCacctgagcgggtgcgggttc13800095]acggagctggacctcgcggcCgCCgCgCCtgggcggatcgccacggtgctgggtgatctt14400096]ccggcggacgtcgtggtcaaCgCggCgggCggctggggcgacaccgaggaggagatgacg15000097]tactcgcatctgcgactggtgcgagaattcggtaccagcccgacccgagcacgcgccggc15600098]acgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaagggga16200099]cgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcgg cttgcgcccg atgctagtcg cggttgatcg16800100]gcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttga cggctggcga gaggtgcggg gaggatctga17400101]ccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatg ctgttgtggg cacaatcgtg ccggttggta18000102]ggatctgcagccaagctctggaccgcccccgactcctgaccgccggccatccgtgaccac18600103]cgctcagcacgaaggagaacagaccgtggc agccgccgcc aagatcgcca tgtccagtgt19200104]ggcgcccagtcaccggcaggggggcagcacccgcgccctg ctgacgccgtCgtCggtggg1980
9
tgcgacctccggagagctcggtacccggggatctgcacgggtcaacgggtaaagccgaga2040
gccggttccccccgcgagcacgattcccttcatgtcggactccccgcagtcgacgttata2100
tatctctgccgtctgcccgacggtaccaagtggcggaaaacgcaccaggaattcgagcgc2160
cgctagggggaagggctcaagaagataggggccaccagatggggcggttttcggtgtgcc2220
CgCCCCggCCgaccggaatactgaagagcatgctgacgactgggatgtgcgaccgaccgc2280
tggtcgtcgtactcggagcctccggctatatcgggtcggccgtcgcggcggaactcgccc2340
ggtggccggtcctgttgcggctggtggcccggcgaccgggcgtcgttccgCCgggCggCg2400
ccgcggagaccgagacgcgtacggccgacctgacggcggcgagcgaggtcgccctcgccg2460
tgacggacgccgacgtggtgatccacctggtcgcgcgcctcacccagggagcggcatggc2520
gggcggcggagagcgatccggtggccgagcgggtgaacgtcggggtgatgcacgacgtcg2580
tcgcggccctgcggtccgggCgCCgCgCCgggccgcccccggtggtggtgttcgccgggt2640
cggtctaccaggtgggccgcccgggtcgggtcgacggcagtgagccggacgagcccgtga2700
cggcctatgcccgtcagaaactcgacgccgaacggacgttgaagtccgccacggtcgagg2760
gtgtcctgcgggggatctcgctgcggctgcccaccgtctaCggCgCggggCCgggCCCgC2820
agggcaacggcgtcgtgcaggcgatggtgctccgggcgctcgccgacgaggccctcaccg2880
tgtggaacggaagcgtggtggagcgtgacctggtgcatgtggaggatgtcgcgcaggcct2940
tcgtgagctgcctggcgcacgcggatgcgctcgccgggcggcactggctgctcggcagcg3000
gtcgtcctgtgaccgtcccgcacctcttcggtgccatcgcCgCCggCgtgtccgcccgca3060
CCgggCgCCCCgCggtgCCCgtgaccgcggtggaccctccggcgatggcgacggcggcgg3120
acttccacgggaccgtcgtcgactcctcggcgttccgcgcggtcaccgggtggcggccgc3180
ggctgtcgcttcaggagggcctggaccacatggtggcggcttacgtgtagCgCCggggtg3240
gcggccgggcCCgggCggtgacggcccggatccgggtcggccgtcacagcttctcgtcga3300
gggcgcggctcgcgcggtactccggcaacatgccgcgtcgcagggcctgctggagagtcg3360
gcgcgcgccggtcgcgctcggagaggatcggtgcccgcccgaggtggtggccgaggggca3420
gggcgaggtccggatcctcgggcgagagggcgtgttcgttctgcggaacgtagccgctcg3480
acatcaagatctgggctggtcgtcaacatcgggcgcggggacgccgtgccgatcggtgat3540
ctggtcggctggctgctggaggccgccgccttcccggaggaccgggtcgaccgccgggag3600
gcgccggtgcggagcaagggcggcgactggacccggctggacatcgggcgggcccggcgg3660
ttgctgtcctgggcgccgcgcatcggcctgcgggactccgtccacagcatgtggcggacc3720
gcgcacggcgccccggcctagctcacaggcttccgacgacctcccgcaccgcgtcgatca3780
ccttctcctgcgcgtcgggacgcagcgaggggtacatcggcagggagaagatctcgccgg3840
ccagccgttcggtcaccggcaggtcgccggggccgtagccgaggtgggcgaatccgctca3900
tggtgtggacgggccaggggtagctgatgttgagatggatgtcgtaggcggtgagcgcct3960
ccaggatgcggtcgcgttcggggtgacgcaccacgtacacgtagtagacgtggtcgttgc4020
cctcggcgatcgtgggcagcaccaggccgtcgaggtcaccgagtccctcctcgtagcggc4080
gggcgacggcCCggCggCCCtcgacataggcgtcgaggcggcgcagtttccggcgcagga4140
tctcggcctgcacctcgtcgagcctgctgttgtgcccgggggtgtccacgacgtagtagc4200
gctcccccatgccgtagtagcgcaaccgccgcagccgccggtcgacttccgcgtccggcg4260
tgacgacggcgccgccgtcaccgtaggcaccgaggaccttggtcgggtagaaggagaagg4320
10
ccgccgcatgcccctgggtgccgaccagccgtccgtgacggcgggcaccg tgggcctggg4380
cgcagtcctccagcaccttcaggtcgtgctcggcggcgagttcgagcacg ggggtcatgt4440
ccacgctctgtccgtagaggtggacgggcagcaggcaccgggtgcgcggg ccgatcaccg4500
accggagccggccggtgtccatgaggtagttctcctcgtgcacgtcgacg aagacggggg4560
tggcgcccacggcgtcgatggccaccacggtgggggccgcggtgttggag accgtcacga4620
cctcgtcccccgggccgatgccgagcgcccgcaggccgaggaccagcgcg ttggtgccgt4680
tgtcgacgcccgtgcagtacggcagtccgtgataagcggcgaactcctcc tcgaaagagc4740
ggacgctggtcccgagaataagctggccggactcgaatacggtttccacc gcatcgagaa4800
tgtcggcgcgttcttcccggtattcattgaggtattgccagacgtaggtg gacacgtgac4860
tccttgtcggggcgcggtcaggcaagcgcgacggacgcggctgccgggac ttccggaccg4920
ttccggtcgatgccggggtcggcccgcagaatcgcgtgctggaggtgctg gagacgggcg4980
gacggttccacccccagctcgttcaccaatgtcttgcggagtttgatg5028
權(quán)利要求
一種產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌，其是一種在天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為外來基因，使dnmV基因被阻斷的基因阻斷工程菌，所述的外來基因中包含aveBIV基因使該基因阻斷工程菌表達(dá)aveBIV，其特征在于，所述的外來基因是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的啟動子的核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示，所述的aveBIV基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株是 天藍(lán)淡紅鏈霉菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482。
4.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的 dnmV基因的第273位 675位之間的核苷酸片段被置換掉。
5.一種重組穿梭載體，其特征在于，含有由在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV基因連 鎖的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、啟動子、aveBIV基因、dnmV基因3’端片段、以 及在天藍(lán)淡紅鏈霉菌基因組中與dnmV基因連鎖的上游基因或其片段依次連鎖組成的DNA 片段。
6.如權(quán)利要求5所述的重組穿梭載體，其特征在于，所述的依次連鎖組成的DNA片段的 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
7.如權(quán)利要求5所述的重組穿梭載體，其特征在于，所述的重組穿梭載體的骨架是質(zhì) 粒 pKC1139。
8.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，其含有權(quán)利要求5 7任一項(xiàng)所述的重組穿梭載體。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞是大腸桿菌 ET12567。
10.一種制備如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌的方 法，其特征在于，包括將權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌接合，挑 選同源雙交換接合子。
11.一種制備表柔紅霉素的的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的天藍(lán)淡紅 鏈霉菌的基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得表柔紅霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)表柔紅霉素的天藍(lán)淡紅鏈霉菌的基因工程菌及其制備方法和所用的重組穿梭載體和轉(zhuǎn)化體。該工程菌是一種在天藍(lán)淡紅鏈霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為外來基因，使dnmV基因被阻斷的基因阻斷工程菌，所述的外來基因中包含aveBIV基因使該基因阻斷工程菌表達(dá)aveBIV，其特征在于，所述的外來基因是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，不含有任何抗性標(biāo)記，很方便用于進(jìn)一步的基因工程改造；表柔紅霉素產(chǎn)量大于用已有方法，最好可達(dá)45mg/L；通過連續(xù)傳代，表柔紅霉素產(chǎn)量非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。
文檔編號C12N1/21GK101892186SQ200910051620
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者景蘭, 李繼安, 邵雷, 陳代杰, 黃佳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院