專利名稱：一種伊枯草菌素a生物殺菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備方法，尤其是涉及一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
2000 年前后，美國環(huán)保局(EPA)相繼批準(zhǔn) 了 Agraquest, Taensa, Gustafson, Microbio等公司枯草芽孢桿菌的農(nóng)藥登記。使用的菌株有:QST713、GB03、MBI600(httD:// www, epa. Rov/pesticides/biopesticides/inRredients/index, htm)、FZB240 在日本禾口我 國臺(tái)灣，枯草芽孢桿菌亦已商品化，商品名為Botokiller和〃臺(tái)灣寶〃。2003年12月 2004年6月，國內(nèi)也有昆明沃霖生物公司、云南星耀生物制品廠、江蘇蘇科農(nóng)化公司、武漢 天惠生物公司、浙江浙豐種衣劑公司5家公司完成了藥證臨時(shí)登記，用于三七根腐病、煙草 黑脛病、水稻紋枯病、草莓灰霉病等病害防治。國內(nèi)外部分學(xué)者認(rèn)為，枯草芽孢桿菌殺菌防病的重要機(jī)理是制劑中的活芽孢噴灑 在作物上后，芽孢在植株上定殖，與病原菌爭奪營養(yǎng)并激活植物自身防衛(wèi)機(jī)制達(dá)到病原菌 消亡。該種意見得到了我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所的支持。因此，國內(nèi)目前通過農(nóng)藥證臨時(shí)登 記的制劑以活芽孢數(shù)為主要重量標(biāo)準(zhǔn)?？茖W(xué)家們對枯草芽孢桿菌防病殺菌機(jī)理深入研究表明，該菌種中某些菌株能分泌 脂肽類殺真菌代謝物。1965年，Delcambe等首次報(bào)道了伊枯草菌素是主要的活性物質(zhì)。伊 枯草菌素是一類小分子脂肽類物質(zhì)(分子量為1000多道爾頓)，由7個(gè)氨基酸和1個(gè)β-氨 基脂肪酸組成，其中包括伊枯草菌素Α、B、C、D、E和芽孢菌素D、F、L等(Besson F，Michel G,Isolation and characterization of new iturins :iturin D and iturin E,Journal ofAntibiotics, 1987，40 :437_442.)。某些菌株會(huì)產(chǎn)生多種伊枯草菌素，其中以伊枯草菌素 A分泌量大，抗真菌活性最強(qiáng)，它直接破壞真菌菌絲細(xì)胞壁，使菌絲斷裂。Peypoux等于1978 年公布了伊枯草菌素A化學(xué)式=C48H74N12O14，其分子量為1042道爾頓(Peypoux，F(xiàn).，Guinand， Μ. , Michel, G. ,Delcambe, L. et al Structure of iturinA, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis. Biochemistry 17:3992-3996,1978·)。伊枯草菌素A化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 其中Asn為天冬酰胺；Tyr為酪氨酸；Gln為谷氨酸；Pro為脯氨酸；Ser為絲氨酸。枯草芽孢桿菌菌株某些菌株還產(chǎn)生另一種小分子量環(huán)脂肽類物質(zhì)，即生物表面活 性素。它與伊枯草菌素的主要差別在于羥基脂肪酸取代了 氨基脂肪酸。它無直接 殺真菌菌絲能力，但可以加強(qiáng)伊枯草菌素的抗真菌能力(Thimon L, Peypoux F5Maget-DanaR, et al. Interactions of bioactive lipopeptides iturin A and surfactin from Bacillus subtilis, Biotechnol. App1. Biochem. , 1992,16 144-151.)上海農(nóng)科院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所自1997年開始開展了芽孢桿菌防治植物病害的 研究，篩選到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的枯草芽孢桿菌G3菌株。該菌株表現(xiàn)出良好的防病殺菌功能，并 在國內(nèi)首次對其抗真菌物質(zhì)和殺菌機(jī)理進(jìn)行深入研究，證實(shí)G3菌株分泌的殺菌活性物質(zhì) 有伊枯草菌素A、生物表面活性素和幾丁質(zhì)酶類。伊枯草菌素A為主要的殺真菌活性物質(zhì)， 它直接破壞新生真菌菌絲的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物流出造成菌絲斷裂、死亡；生物表面活性 劑抑制真菌孢子萌發(fā)和芽管伸長；幾丁質(zhì)酶抑制真菌孢子萌發(fā)和芽管伸長并抑制真菌菌絲 生長；三者合力則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制病原真菌孢子萌發(fā)、芽管生長和菌絲斷裂的生物效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種適用于防治大 量產(chǎn)孢的植物病原菌，防效達(dá)70%左右的伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于吖啶橙溶液24_36h，得到突變 株；(2)將豆粕粉和自來水按重量比1 (70-80)混合，再加熱至90-100°C，然后進(jìn)行 過濾，得到的濾渣中再加入自來水，繼續(xù)過濾1-2次；(3)向過濾后的濾液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，攪拌溶解，再向 其中加入玉米淀粉、酵母粉和自來水，混合得到溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為7. 2-7. 4，再加入碳 酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，塞好瓶塞，將三角瓶加熱至120-125°C， 滅菌20-40min，得到培養(yǎng)液；(4)控制溫度為30-32°C，攪拌速度為180_200rpm，將步驟(1)中得到的突變株在 培養(yǎng)液中進(jìn)行一環(huán)斜面菌苔接種，接種時(shí)間為60-80h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)采用高效液相色譜分析儀從上述菌株中篩選出伊枯草菌素A單組分最高的 6-8個(gè)菌株；(6)采用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，篩選出1-2 個(gè)殺菌活性菌株，即為產(chǎn)品。所述的步驟(1)中的吖啶橙溶液的重量濃度為200-300 μ g/ml。所述的步驟(2)中的過濾采用雙層紗布擠壓過濾。所述的步驟(3)中葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、玉米淀粉、酵母粉、自來 水和碳酸鈣加入量與豆粕粉的重量比為(0.3-0.4) (0. 25-0. 35) (0. 04-0. 07) (0. 02-0.04) (1. 2-1.8) (0. 3-0.4) (350—450) (0. 2-0. 25) 4。所述的步驟(3)中調(diào)節(jié)溶液pH值采用氫氧化鈉溶液。所述的步驟(3)中氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為5-7mol/L。所述的步驟(3)中的瓶塞由1層絨布或4-6層紗布構(gòu)成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特別適用于防治大量產(chǎn)孢的植物病原真菌，如白粉病菌、 灰霉病菌和葉霉病菌引起的真菌病害，1. 5%伊枯草菌素A制劑500 600倍液采用最常規(guī)
4的葉面噴霧法進(jìn)行田間防治，防效60 70%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為200 μ g/ml吖啶橙 溶液24h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和300ml自來水混合，加熱至100°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加300ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾2次；(3)向過濾后的濾液中加入0.36kg葡萄糖、0.32kg蛋白胨、0.06kg磷酸二氫鉀、 0. 03kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 6kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水400ml，混合得到溶液，利用6mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 3，再加入0. 24kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用4層紗布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)?，將三角瓶加熱?21°C，滅 菌 30min ；(4)控制溫度為31°C，攪拌速度為200rpm，將步驟⑴中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為72h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的7個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸 方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl)，利用該方法篩選出篩選出2個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為
產(chǎn)品 ο制得的伊枯草菌素A生物殺菌劑對番茄灰霉病菌生物效價(jià)測定結(jié)果見表1。其 最小抑菌濃度MIC為20. 0 μ g/mL ；其濃度對數(shù)值與菌絲生長抑制率機(jī)值回歸方程Y = 3. 82+1. 96Χ ；r = 0. 970 ；有效抑菌中濃度 EC5tl 為 4. 00 μ g/mL, 95 % 置信限為 3. 13 5.13 μ g/mL。表1伊枯草菌素A生物殺菌劑對番茄灰霉病菌室內(nèi)生物測定結(jié)果 注接種菌餅直徑5. 00mm，抑菌率(％ )以測量菌落直徑減5mm計(jì)算。菌落直徑 5. OOmm表示，菌餅菌絲萌發(fā)但不能搭在含藥培養(yǎng)基上生長，為100%抑菌率。實(shí)施例2(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為220 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和290ml自來水混合，加熱至95°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加300ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾2次；(3)向過濾后的濾液中加入0.33kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.05kg磷酸二氫鉀、 0. 03kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 5kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水500ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 2，再加入0. 24kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用4層紗布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)?，將三角瓶加熱?20°C，滅 菌 30min ；(4)控制溫度為30°C，攪拌速度為200rpm，將步驟⑴中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為72h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的7個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸 方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl)，利用該方法篩選出篩選出2個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為產(chǎn)品。
制得的伊枯草菌素A生物殺菌劑中伊枯草菌素A含量測定為1.230yg/yL。 其最小抑菌濃度MIC為19. 7 μ g/mL ；其濃度對數(shù)值與菌絲生長抑制率機(jī)值回歸方程Y =3. 58+1. IOX ；r = 0. 996 ；有效抑菌中濃度 EC5tl 為 2. 39 μ g/mL，95 % 置信限為 2. 16 2. 63 μ g/mL。實(shí)施例3伊枯草菌素A生物殺菌劑防治溫室大棚黃瓜白粉病藥效試驗(yàn)(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為220 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和290ml自來水混合，加熱至95°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加300ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾2次；(3)向過濾后的濾液中加入0.33kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.05kg磷酸二氫鉀、 0. 03kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 5kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水500ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 2，再加入0. 24kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用4層紗布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)冢瑢⑷瞧考訜嶂?20°C，滅 菌 3Omin ；(4)控制溫度為30°C，攪拌速度為200rpm，將步驟⑴中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為72h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的7個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸 方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl),利用該方法篩選出篩選出2個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為
女口
廣 PFt ο利用20噸罐發(fā)酵液噴霧干燥制得的粉劑，伊枯草菌素A含量20mg/g，G3活芽孢 500億/g，將得到的伊枯草菌素A生物殺菌劑配置成400倍液(2. 25kg殺菌劑/公頃)、500 倍液(1. 8kg殺菌劑/公頃)、600倍液(1. 5kg殺菌劑/公頃)，采用最常規(guī)的葉面噴霧法進(jìn) 行田間防治，并對農(nóng)田噴CK(清水)進(jìn)行比較，對黃瓜白粉病的防治效果如表2所示，試驗(yàn) 中，伊枯草菌素A生物殺菌劑對黃瓜的葉片、花及果實(shí)無任何藥害，也沒有觀察到對其它生 物的影響，因此，伊枯草菌素A生物殺菌劑可以作為無公害的瓜類白粉病防治藥物加以使 用。表2伊枯草菌素A生物殺菌劑溫室對黃瓜白粉病防治效果 實(shí)施例4伊枯草菌素A生物殺菌劑防治番茄葉霉病藥效試驗(yàn)(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為200 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和320ml自來水混合，加熱至98°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加320ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾2次；(3)向過濾后的濾液中加入0.36kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.06kg磷酸二氫鉀、 0. 03kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 6kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水400ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 2，再加入0. 24kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用4層紗布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)?，將三角瓶加熱?22°C，滅 菌 40min ；(4)控制溫度為30°C，攪拌速度為200rpm，將步驟(1)中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為80h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的7個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸 方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl),利用該方法篩選出篩選出2個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為 利用20噸罐發(fā)酵液噴霧干燥制得的粉劑，伊枯草菌素A含量20mg/g，G3活芽孢 500億/g，將得到的伊枯草菌素A生物殺菌劑配置成400倍液(2. 25kg殺菌劑/公頃)、500 倍液(1. 8kg殺菌劑/公頃)、600倍液(1. 5kg殺菌劑/公頃)，采用最常規(guī)的葉面噴霧法進(jìn)行田間防治，并對農(nóng)田噴CK(清水)進(jìn)行比較，對番茄葉霉病的防治效果如表3所示，伊枯 草菌素A生物殺菌劑對番茄葉霉病有較好的防治效果，防治效果與使用劑量呈明顯的相關(guān) 性。3個(gè)濃度各小區(qū)的病情指數(shù)差異不大，表明藥效的穩(wěn)定性。因此，伊枯草菌素A生物殺 菌劑目前是防治番茄葉霉病較為理想藥物。整個(gè)試驗(yàn)期目測結(jié)果，藥劑對番茄植株、花蕾和 果實(shí)與CK對照區(qū)一樣，無任何藥害癥狀產(chǎn)生，并且施藥區(qū)葉色嫩綠，明顯好于對照區(qū)和化 防區(qū)，有肥效作用。表3伊枯草菌素A生物殺菌劑防治溫室番茄葉霉病效果 實(shí)施例5(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為200 μ g/ml吖啶橙 溶液24h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和280ml自來水混合，加熱至90°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加280ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾1次；(3)向過濾后的濾液中加入0.3kg葡萄糖、0.25kg蛋白胨、0.04kg磷酸二氫鉀、 0. 02kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 2kg玉米淀粉和0. 3kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水450ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 2，再加入0. 2kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用1層絨布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)冢瑢⑷瞧考訜嶂?20°C，滅 菌 20min ；(4)控制溫度為30°C，攪拌速度為180rpm，將步驟⑴中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為60h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的6個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl),利用該方法篩選出篩選出1個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為
Φ 口
廣 BFI ο實(shí)施例6(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于重量濃度為300 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突變株；(2)將4kg豆粕粉和320ml自來水混合，加熱至100°C，然后采用雙層紗布擠壓過 濾，向過濾后的濾渣再加320ml的自來水，繼續(xù)用雙層紗布擠壓過濾2次；(3)向過濾后的濾液中加入0.4kg葡萄糖、0.35kg蛋白胨、0.07kg磷酸二氫鉀、 0. 04kg硫酸鎂，開啟攪拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 8kg玉米淀粉和0. 4kg 酵母粉，補(bǔ)充自來水350ml，混合得到溶液，利用7mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 7. 4，再加入0. 25kg碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，裝瓶時(shí)不斷搖動(dòng)， 確保每瓶中的培養(yǎng)基均一，利用6層紗布作為瓶塞，牛皮紙?jiān)?，將三角瓶加熱?25°C，滅 菌 40min ；(4)控制溫度為32°C，攪拌速度為200rpm，將步驟(1)中得到的突變株進(jìn)行一環(huán)斜 面菌苔接種，搖瓶接種時(shí)間為80h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)將上述菌株利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，得到酸性沉淀，利用硅膠柱層析和薄板層 析法將其提純，得到粗品，然后再利用高效液相進(jìn)一步純化，得到純度較高菌株，經(jīng)高效液 相(HPLC)測試，篩選出伊枯草菌素A單組分最高的8個(gè)菌株；(6)利用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，將上述菌株 定量加入PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平皿，然后將沾過葉霉菌孢子懸浮液直徑6mm的無菌濾紙 片貼于PDA培養(yǎng)基表面，25°C下培養(yǎng)3d后，觀察、測量菌落直徑，紙片上無葉霉菌長出的濃 度為該搖瓶培養(yǎng)液的最小抑菌濃度(MIC)，以μ L/mL表示；用游標(biāo)卡尺測量各菌落直徑，樣 品濃度以log值計(jì)，菌落平均直徑轉(zhuǎn)為抑菌機(jī)率值，計(jì)算出劑量濃度與抑菌機(jī)率值的回歸 方程，得到有效抑菌濃度(EC5tl)，利用該方法篩選出篩選出2個(gè)殺菌活性最高的菌株，即為
女口
廣PR ο
10
權(quán)利要求
一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)取生長階段的枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體，將其置于吖啶橙溶液24 36h，得到突變株；(2)將豆粕粉和自來水按重量比1∶(70 80)混合，再加熱至90 100℃，然后進(jìn)行過濾，得到的濾渣中再加入自來水，繼續(xù)過濾1 2次；(3)向過濾后的濾液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，攪拌溶解，再向其中加入玉米淀粉、酵母粉和自來水，混合得到溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.2 7.4，再加入碳酸鈣，得到預(yù)培養(yǎng)液，將預(yù)培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，塞好瓶塞，將三角瓶加熱至120 125℃，滅菌20 40min，得到培養(yǎng)液；(4)控制溫度為30 32℃，攪拌速度為180 200rpm，將步驟(1)中得到的突變株在培養(yǎng)液中進(jìn)行一環(huán)斜面菌苔接種，接種時(shí)間為60 80h，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)采用高效液相色譜分析儀從上述菌株中篩選出伊枯草菌素A單組分最高的6 8個(gè)菌株；(6)采用含藥平皿法測定上述菌株的最小抑菌濃度和有效抑菌濃度，篩選出1 2個(gè)殺菌活性菌株，即為產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的吖啶橙溶液的重量濃度為200-300 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(2)中的過濾采用雙層紗布擠壓過濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、玉米淀粉、酵母粉、自來水和碳酸鈣加 入量與豆粕粉的重量比為(0.3-0. 4) (0. 25-0. 35) (0. 04-0. 07) (0. 02-0. 04) (1.2-1.8) (0. 3-0.4) (350-450) (0. 2-0. 25) 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中調(diào)節(jié)溶液pH值采用氫氧化鈉溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為5-7mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中的瓶塞由1層絨布或4-6層紗布構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種伊枯草菌素A生物殺菌劑的制備方法，(1)將枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體置于吖啶橙溶液得到突變株；(2)將豆粕粉和自來水混合，加熱過濾；(3)向?yàn)V液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，攪拌溶解后加入玉米淀粉、酵母粉和自來水，利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值，再加入碳酸鈣，分裝入三角瓶，加熱至120-125℃滅菌；(4)將突變株進(jìn)行一環(huán)斜面菌苔接種，得到含伊枯草菌素A單組分的菌株；(5)利用高效液相和含藥平皿法篩選伊枯草菌素A單組分最高的菌株為產(chǎn)品。本發(fā)明適用于防治大量產(chǎn)孢的植物病原真菌，如白粉病菌、灰霉病菌和葉霉病菌引起的真菌病害，采用最常規(guī)的葉面噴霧法進(jìn)行田間防治，防效60～70％。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101899402SQ200910052320
公開日2010年12月1日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者馮鎮(zhèn)泰, 沈麗娟, 陳偉, 顧真榮, 馬承鑄, 龔新進(jìn) 申請人:上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司