專利名稱：一種鐮形扇頭蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重組表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I的血生物基 因序列、Rhipilin-I基因在大腸桿菌中的重組表達(dá)以及在制備抗凝制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在生物進(jìn)化過程中，哺乳動物形成了一個復(fù)雜的凝血系統(tǒng)來阻止血液的流失，而 很多以血液為生的生物體內(nèi)往往存在很多抗凝血蛋白以對抗宿主的凝血功能。蜱是一類以 吸血為生的體外寄生蟲。與其他吸血節(jié)肢動物相比，蜱的吸血時間特別長，如硬蜱的吸血時 間一般在10-14天(Sonenshine，1993)。蜱的長時間吸血過程，必然引起宿主一系列止血反 應(yīng)，如血管收縮、血小板凝集和血液凝固。為了進(jìn)行持續(xù)的吸血，蜱必須克服宿主的止血反 應(yīng)，自從WaXman(1990)鑒定出第一個蜱的抗凝血分子以來，研究人員發(fā)現(xiàn)蜱的唾液腺在吸 血過程中分泌產(chǎn)生多種抗止血分子，蜱唾液腺分泌的前列腺素D2和12可以誘導(dǎo)血管收縮 和抑制血小板凝集(Bowman，1995)，幾種血小板凝集抑制蛋白分子也從硬蜱和軟蜱中鑒定 (Mans, 2002)；針對血液凝固的抗凝血分子，如凝血酶(thrombin)抑制蛋白分子、凝血因子 Xa(FXa)抑制蛋白分子和組織因子通路抑制蛋白分子(TFPI)已在美洲花蜱、變異革蜱、間 突硬蜱、具尾扇頭蜱、微小牛蜱等多種國外優(yōu)勢蜱體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)(MaritZ-01iVier，2007)。盡 管已報道的蜱抗凝血分子多達(dá)20多種，但完全鑒定的還很少，獲得編碼這些蛋白分子的基 因序列不超過8個。從目前的結(jié)果分析，蜱抗凝血分子多數(shù)屬于Kimitz家族絲氨酸酶特異 性抑制分子，特征性含有1個或2個KU結(jié)構(gòu)功能域和高度保守的半胱氨酸殘基，在進(jìn)化上 可能來自同一祖先(Lai，2004)。由于血栓引起的人心、腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，目前可用的抗栓制劑有 限，因此，抗栓藥物的研究一直是十分關(guān)注的領(lǐng)域(Bates and ffeitz,2006)。根據(jù)水蛭(螞 蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床(Turk，2006 ；Bates and ffeitz,2006)o在已經(jīng)鑒定的蜱抗凝血分子中，有2個分子在動物模型實(shí)驗(yàn)中具有抗血栓治 療作用，其中1990年鑒定的TAP分子為凝血因子Xa(FXa)抑制劑，重組表達(dá)的TAP在多個 動物模型上都顯示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前還未能在人體臨床上使用 (Bates and Weitz，2006)，但利用TAP分子的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制設(shè)計更小的、沒有抗原性的抗 栓藥物，或者構(gòu)建新型重組抗栓藥物分子正在研究并取得進(jìn)展，例如，應(yīng)用TAP功能區(qū)序列 和錨定蛋白Armexin V序列構(gòu)建一個新的重組抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比單個錨定 蛋白Armexin V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一個蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年從 間突硬蜱鑒定的分子，與人的組織通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/組織因 子復(fù)合體，在大鼠模型中，顯示了很強(qiáng)的抗血栓作用(Monteiro，2005 ；Nazareth，2006)。這 些研究表明，蜱的抗凝血分子可能開發(fā)為新型抗血栓藥物。鐮形扇頭蜱屬于硬蜱，主要分布于南亞及中國南方，是優(yōu)勢蜱種，在牛、羊、狗、兔 等多種動物吸血寄生，也可侵襲人體叮咬吸血，但是還未見關(guān)于其抗凝血分子的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究鐮形扇頭蜱抗凝血分子，開發(fā)新型抗凝血生 物制劑。本發(fā)明提供了鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I的基因序列，其基因的核苷酸 序列和對應(yīng)的氨基酸序列如下鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I的核苷酸序列aatattggaaaaacttcagcgagcagaaaacaaccaaaggcaatgaagattttacaatac60
gcgctcttggcttgtcttctcgtctcgatattaggcgatgatgatgacgaagaaaacgag120
ggtgcggcggggagtgatgatgcgggcgcaacgcctacagcactgtcgaagccagcagcc180
acttctgcggaaggaaacaccgcagcaaaaaactcaggtggtgacatcaagcaaccgaaa240
caagaactgcccgaaccgtcctcaaaaggccaaaagaaaccgagactacccaagagatgc300
ttattcaagccagaacagggaaactgcgcaggttctcgtttccttcctagatggtggtat360
aacccagaaactgagagctgcgaaccattcacttatccagtgtgcaataagaaaaacgaa420
gcattcgtatcatgtacactgtgcatgaacatgtgcatgaggaataagaggggcagggag480
aaggctaaatggattagaaaagtttgtagaaaaagtccgaaagtaaaatctggatgaatg540
tagttggctctgccacttcttctgccataaaatattcgaaaacatttgttatgaataata600
t t a tc a aa a3. 3. 3. 3.a
620

鐮形扇頭蜱蜱抗凝血分子Rhipilin-I氨基酸序列 Met Lys lie Leu Gln Tyr Ala Leu Leu Ala Cys
1
Leu
Asp
Ala
Pro
65
Arg
Gly
Cys
Val
Arg
Gly Asp Ala
Glu 50
Lys
Leu
Ser
Glu
Ser 130 Glu
Asp 20 Ala
Asn
Glu
Lys
Phe 100 Phe
Gly 35 Gly
Gln
Pro
Arg
Pro 115
Cys Thr Lys Ala
5
Asp
Thr
Thr
Leu
Arg
85
Leu
Thr
Leu
Lys
Asp
Pro
Ala
Pro
70
Cys
Pro
Tyr
Cys
Trp
Glu Glu Thr
Ala
55
Glu
Leu
Arg
Pro
Met 135 lie
Ala 40 Lys
Pro
Phe
Trp
Val 120
Asn Met Arg Lys
Asn
25
Leu
Asn
Ser
Lys
Trp 105 Cys
10 Glu
Ser
Ser
Ser
Pro
90
Tyr
Asn
Cys
Val
Gly
Lys
Gly
Lys
75
Glu
Asn
Lys
Met
Cys
Leu
Ala
Pro
Gly 60 Gly
Gln
Pro
Lys
Leu Val Ala
Ala
45
Asp
Gln
Gly
Glu
Asn 125 Asn
Arg 140
Arg Lys
Gly
30
Ala
lie
Lys
Asn
Thr 110 Glu
Lys
Ser
Ser
15
Ser
Thr
Lys
Lys
Cys
95
Glu
Ala
Arg
Pro
lie
Asp
Ser
Gln
Pro 80 Ala
Ser
Phe
Gly
Lys
5
145150155160Val Lys Ser Gly。本發(fā)明通過構(gòu)建鐮形扇頭蜱雌蜱吸血前后唾液腺消減文庫，對所有克隆進(jìn)行末端 測序分析，共獲得247個有效EST序列。對其中一個抗凝血分子同源性基因的克隆，進(jìn)行了 全序列測定和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其為完整編碼基因，命名為Rhipilin-I基因。該基因 全長為620bp，在3’端有polyA和polyA的信號序列AATAAAA，含有有一個完整的開放閱讀 框，從第43個堿基到536個堿基，編碼164個氨基酸，預(yù)測分子量為18kDa。蛋白質(zhì)信號肽 分析，在N-末端有一個18個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列；蛋白質(zhì)功能域分析，在第84個氨基 酸至第139個氨基酸為一典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑Kimitz功能域。Blast分析發(fā)現(xiàn)該分 子與抗凝血分子之一的組織通道抑制因子顯著同源。本發(fā)明的另一目的是提供了所述鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I在大腸桿菌 中的重組表達(dá)方法。根據(jù)鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因生物信息學(xué)分析結(jié)果，將不包 含信號肽序列的實(shí)際編碼區(qū)亞克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-l/Rhipilin-l，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分 析顯示，重組GST融合蛋白獲得高效表達(dá)，GST-融合蛋白為44kDa，與預(yù)期重組蛋白的大小 一致，進(jìn)一步分析表明，重組融合蛋白多數(shù)以可溶性蛋白形式存在。本發(fā)明的又一目的是提供了所述鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I在制備抗凝 血生物制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明以純化的鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I重組蛋白，進(jìn)行兔 血漿復(fù)鈣時間(Recalcification Time, RT)和部分凝血酶激活時間(Activated PartialThromboplastinTime, APTT)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該分子具有抗凝血活性。


圖1鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列 分析其中ATG為起始密碼子；下劃實(shí)線序列為信號肽序列；箭頭為信號肽的切割位點(diǎn)； 下劃虛線序列為Kunitz功能域；TAG為終止密碼子；AATAAA為加尾信號。圖2鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I的表達(dá)和純化M，為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1和2分別為含空載體細(xì)菌誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后蛋白帶，3和4 分別為含重組載體細(xì)菌誘導(dǎo)前蛋白帶、誘導(dǎo)后蛋白帶；5、6、7分別為誘導(dǎo)細(xì)菌的不溶性蛋 白、可溶性蛋白和純化的重組蛋白圖3鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I血漿復(fù)鈣時間實(shí)驗(yàn)結(jié)果a為對照GST蛋白(濃度18. 75 300nM) ；b為生理鹽水；c、d、e、f、g分別為濃度 為 18. 75nM、37. 5nM、75nM、150nM、300nM 的重組 Rhipilin-1 樣品圖4鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I對兔血漿部分凝血酶激活時間的影 響1為對照GST蛋白(濃度15. 625 250nM) ；2為生理鹽水；3、4、5、6、7分別為濃度為 15. 625nM、31. 25nM、62. 5nM、125nM、250nM 的重組 Rhipilin-1 樣品
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I的基因克隆和序列分析1.材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)動物鐮形扇頭蜱采自湖北水牛，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。新西蘭大白兔購 自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。1.2試驗(yàn)菌種、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌菌株DH5ci購自博大泰克公司，質(zhì) 粒 pGEM-TEasy、T4DNA 連接酶購自 Promega 公司，質(zhì)粒 pGEX_4T_l 購自 Amersham PharmaciaBiotech ；TRIZOL試劑購自Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒購自賽百盛公 司；Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；PCR SelectTM cDNA SubtractionKit, SMART PCR cDNA Synthesis Kit, PCR Purification Kit 為 Clontech 公司產(chǎn)品。1. 3鐮形扇頭蜱唾液腺的制備鐮形扇頭蜱未吸血成蜱按雌雄1 1混合接種兔耳，接種后4-5天，取出半飽血雌 蜱，解剖鏡下分離唾液腺，-70°C保存?zhèn)溆茫煌或缛何次乞绲耐僖合侔赐瑯臃椒ǚ蛛x。1. 4蜱唾液腺總RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol試劑，按實(shí)驗(yàn)說明操作，分別提取鐮形扇頭蜱未吸 血雌蜱和半飽血雌蜱總RNA，溶于無RNase的水中，測定總RNA濃度，然后保存于_70°C冰箱1. 5雙鏈cDNA的合成采用Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，分別以總 RNA 為模板， 用01ig(dT)18引物在M MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一鏈cDNA(SS cDNA)，并用長距離 PCR(LD-PCR)擴(kuò)增 cDNA 第二鏈(ds cDNA)；1. 6抑制性消減雜交應(yīng)用Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit。本試驗(yàn)以半飽血雌蜱唾液 腺為Tester，以未吸血雌蜱唾液腺為Driver ；步驟如下分別將Adaptorl-Tester cDNA和 Adaptor 2R_Tester cDNA與Driver cDNA混合，68°C溫育8h，進(jìn)行第1輪雜交；將上述兩個 反應(yīng)產(chǎn)物混合，并再次加入足量的Driver cDNA, 68°C過夜，進(jìn)行第2輪雜交；對消減雜交的 產(chǎn)物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，分別以加接頭未消減的半飽血雌蜱的cDNA做對照。PCR的引物序 列對應(yīng)于 Adaptor IfPHAdaptor 2R 的序列(Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit)。1. 7消減文庫的建立、陽性克隆的篩選、EST序列測定與分析PCR擴(kuò)增后的消減雜交產(chǎn)物經(jīng)PCR Purification Kit純化，與pGEM-T-easy載體 連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5 α篩選藍(lán)白斑，挑取全部白色克隆，以巢式PCR引物Primer 1 和Primer 2R進(jìn)行擴(kuò)增，將陽性克隆送上?；瞪锛夹g(shù)公司測序，測序結(jié)果在GenBank上 進(jìn)行同源性分析(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)；1. 8抗凝血分子Rhipilin-I的全長基因序列測定和分析根據(jù)EST序列信息，挑選一個編號為48的EST序列，進(jìn)行全序列測定和生物信息 學(xué)分析，結(jié)果為完整編碼抗凝血分子同源性基因，命名為Rhipilin-I基因。2.結(jié)果與分析
鐮形扇頭蜱雌蜱吸血前后唾液腺消減文庫成功構(gòu)建，對所有克隆進(jìn)行末端測序分 析，共獲得247個有效EST序列。對其中一個抗凝血分子同源性基因的克隆，進(jìn)行了全序 列測定和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)為完整編碼基因，命名為Rhipilin-I基因。該基因全長為 620bp，在3’端有polyA和polyA的信號序列AATAAAA，含有有一個完整的開放閱讀框，從 第43個堿基到536個堿基，編碼164個氨基酸，預(yù)測分子量為18kDa，蛋白質(zhì)信號肽分析 (http //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)發(fā)現(xiàn)在 N-末端有一個 18 個氨基酸構(gòu)成的 信號肽序列，蛋白質(zhì)功能域分析(http://smart, embl-heidlberg. de/smart/job_status.) 發(fā)現(xiàn)在第84個堿基至139個堿基處有一典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑Kimitz功能域。Blast 分析發(fā)現(xiàn)該分子與抗凝血分子之一的組織通道抑制因子顯著同源。實(shí)施例2鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因的重組表達(dá)和抗凝血活性驗(yàn)證1.材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)動物新西蘭大白兔購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。1.2試驗(yàn)菌種、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌菌株DH5a、BL21(DE3)購自博大泰克公 司，質(zhì)粒pGEM-T Easy、T4DNA連接酶購自Promega公司，質(zhì)粒pGEX_4T_l購自Amersham Pharmacia Biotech ;DNA膠回收試劑盒購自賽百盛公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、 EcoRI和Xhol內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。GST 'BindTM試劑盒購自Novagen ；APTT試劑盒購 于太陽生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白分析試劑盒為PIERCE公司產(chǎn)品；引物由賽百盛公司合 成。1. 3鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因生物信息學(xué)分析結(jié)果，將不包含信 號肽序列的實(shí)際編碼區(qū)亞克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中，上游引物為5' GAATTCGATGATGATGACGAAGAAAACGAG3，下游引物為5，國 CTCGAGTCATCCAGATTTTACTTTCGGACT3，，5，端和 3，端分別引入 EcoRI 和
Xhol I酶切位點(diǎn)，斜體字母表示酶切位點(diǎn)，方框中為保護(hù)性堿基。以重組克隆載體pGEM/ Rhipilin-I 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；該程序?yàn)?94°C 2min 后，以 94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 60s 循環(huán)30次后，最后72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物回收、酶切、純化，同時將載體pGEX_4T_l 用相應(yīng)的酶作雙酶切，將酶切后純化的PCR產(chǎn)物和載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，經(jīng)PCR和酶切鑒定 陽性菌落，按試劑盒說明書操作抽提陽性菌的重組質(zhì)粒pGEX-4T-l/Rhipilin-l ；1. 4鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I的重組表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液0D600在0. 6 0. 8左右時，向培養(yǎng)基中加入IPTG，使終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體，用 12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，重組GST融合表達(dá)蛋白，用GST · Bind 試劑盒純 化，BCA法測蛋白濃度。1. 5鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I對兔血漿復(fù)鈣時間的影響用健康實(shí)驗(yàn)兔全血按照9 1加入3.8%檸檬酸鈉，3000171^11離心51^11，制成兔 檸檬酸鈉血漿中。在96孔板中分別加入0. ImL待測血漿，然后加入0. ImL溶解于生理鹽 水的不同濃度的重組Rhipilin-I樣品，樣品與生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋(終濃度為0. 15nm/ mL-2. 4nm/mL)。37 "C 保溫 15min ；力卩入 0. ImL 0. 025mol/L 的 CaCl2 溶液，于 405nm 處， O-IOmin內(nèi)每隔25s測定一次OD值，OD值的增加反映血漿凝結(jié)程度。對照分別加入同樣體積的生理鹽水和GST蛋白。每次實(shí)驗(yàn)做三復(fù)孔。1. 6鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I對兔部分凝血酶激活時間的影響試 驗(yàn)將待測血漿0. ImL加入0. ImL鞣花酸部分凝血活酶溶液和0. ImL不同濃度的 Rhipilin-l，37°C孵育5min，立即加入0. 025mol/L CaCl2溶液0. ImL,同時開始計時，當(dāng)溶 液出現(xiàn)混濁時停止計時，此時間即為鞣花酸部分凝血活酶激活時間(APTT)。同時分別加入 0. ImL生理鹽水和GST蛋白代替Rhipilin-I作為對照測定未加RhAP的鞣花酸部分凝血酶 激活時間(APTT)。2.結(jié)果與分析2. 1鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I基因的表達(dá)與純化鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21中， 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，空質(zhì)粒pGEX_4T_l表達(dá)的GST蛋白為26kDa， 重組質(zhì)粒表達(dá)的GST-融合蛋白為44kDa，與預(yù)期重組蛋白的大小一致。進(jìn)一步分析表明， 重組融合蛋白多數(shù)以可溶性蛋白形式存在，經(jīng)GST · Bind 試劑盒純化，得到純化的重組 Rhipilin-K 圖 2)。2. 2重組Rhipilin-I對兔血漿復(fù)鈣時間的影響結(jié)果如圖3所示，加入鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I后，兔血漿復(fù)鈣時 間隨濃度增加而延長，當(dāng)鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I濃度達(dá)到75nM以上時， 對于血漿凝集的抑制作用差異顯著，對照重組GST在不同濃度條件下均無抑制血漿凝集作 用；生理鹽水對照也無抑制血漿凝集作用，結(jié)果表明重組Rhipilin-I對兔血漿有抗凝作 用，并具有濃度依賴特征。2. 3重組Rhipilin-I對兔血漿部分凝血酶激活時間的影響兔血漿部分凝血酶激活時間(APTT)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與對照生理鹽水和重 組GST相比，當(dāng)鐮形扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I終濃度為15. 625nM以上時，可顯著 延長兔血漿鞣花酸部分凝血酶激活時間(APTT)，并隨著濃度增加激活時間越長，說明鐮形 扇頭蜱抗凝血分子重組Rhipilin-I的抗凝作用十分明顯并具有濃度依賴特點(diǎn)。APTT的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果也表明重組Rhipilin-I不僅從內(nèi)源凝血系統(tǒng)抑制血液凝固，對外源凝血途徑也有 明顯的抑制作用。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所<120> 一種硬蜱的抗凝血分子Rhipilin-I的基因序列和重組表達(dá)<130>說明書、權(quán)利要求書<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>620<212>DNA<213>抗凝血分子Rhipilin-I的核苷酸序列<400>1
aatattggaaaaacttcagcgagcagaaaacaaccaaaggcaatgaagattttacaatac60
gcgctcttggcttgtcttctcgtctcgatattaggcgatg atgatgacgaagaaaacgag120
ggtgcggcggggagtgatgatgcgggcgcaacgcctacagcactgtcgaagccagcagcc180
acttctgcggaaggaaacaccgcagcaaaaaactcaggtggtgacatcaagcaaccgaaa240
caagaactgcccgaaccgtcctcaaaaggccaaaagaaaccgagactacccaagagatgc300
ttattcaagccagaacagggaaactgcgcaggttctcgtttccttcctagatggtggtat360
aacccagaaactgagagctgcgaaccattcacttatccagtgtgcaataagaaaaacgaa420
gcattcgtatcatgtacactgtgcatgaacatgtgcatgaggaataagaggggcagggag480
aaggctaaatggattagaaaagtttgtagaaaaagtccga aagtaaaatctggatgaatg540
tagttggctctgccacttcttctgccataaaatattcgaa aacatttgttatgaataata600
t t a tc a aa aa a
620<210>2
<211>164
<212>PRT
<213> 蝶抗凝血分子Rhipi]—in_氨基酸序列
<400>2
Met LyslieLeuGlnTyrAlaLeuLeuAlaCysLeuLeuValSerlie
151015
Leu GlyAspAspAspAspGluGluAsnGluGlyAlaAlaGlySerAsp
202530
Asp AlaGlyAlaThrProThrAlaLeuSerLysProAlaAlaThrSer
354045
Ala GluGlyAsnThrAlaAlaLysAsnSerGlyGlyAsplieLysGln
505560
Pro LysGlnGluLeuProGluProSerSerLysGlyGlnLysLysPro
65707580
Arg LeuProLysArgCysLeuPheLysProGluGlnGlyAsnCysAla
859095
Gly SerArgPheLeuProArgTrpTrpTyrAsnProGluThrGluSer
100105110
Cys GluProPheThrTyrProValCysAsnLysLysAsnGluAlaPhe
115120125
Val SerCysThrLeuCysMetAsnMetCysMetArgAsnLysArgGly
130135140
Arg GluLysAlaLysTrplieArgLysValCysArgLysSerProLys
145150155160
Val LysSerGly
O
權(quán)利要求
一種鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin 1基因序列，其特征在于所述基因全長為620bp，在3’端有polyA和polyA的信號序列AATAAA，含有一個完整的開放閱讀框，從第43個堿基到536個堿基，編碼164個氨基酸，其分子量為18kDa；其編碼蛋白在N 末端有一個18個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列，切割點(diǎn)在第18和第19個氨基酸間；從第84個氨基酸至第139個氨基酸，預(yù)測編碼一個典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz功能域；所述鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin 1的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如下鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin 1的核苷酸序列aatattggaa aaacttcagc gagcagaaaa caaccaaagg caatgaagat tttacaatac 60gcgctcttgg cttgtcttct cgtctcgata ttaggcgatg atgatgacga agaaaacgag 120ggtgcggcgg ggagtgatga tgcgggcgca acgcctacag cactgtcgaa gccagcagcc 180acttctgcgg aaggaaacac cgcagcaaaa aactcaggtg gtgacatcaa gcaaccgaaa 240caagaactgc ccgaaccgtc ctcaaaaggc caaaagaaac cgagactacc caagagatgc 300ttattcaagc cagaacaggg aaactgcgca ggttctcgtt tccttcctag atggtggtat 360aacccggaaa ctgagagctg cgaaccattc acttatccag tgtgcaataa gaaaaacgaa 420gcattcgtat catgtacact gtgcatgaac atgtgcatga ggaataagag gggcagggag 480aaggctaaat ggattagaaa agtttgtaga aaaagtccga aagtaaaatc tggatgaatg 540tagttggctc tgccacttct tctgccataa aatattcgaa aacatttgtt atgaataata 600aaattatcaa aaaaaaaaaa 620鐮形扇頭蜱蜱抗凝血分子Rhipilin 1氨基酸序列Met Lys Ile Leu Gln Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Leu Leu Val Ser Ile1 5 10 15Leu Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asn Glu Gly Ala Ala Gly Ser Asp20 25 30Asp Ala Gly Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ser Lys Pro Ala Ala Thr Ser35 40 45Ala Glu Gly Asn Thr Ala Ala Lys Asn Ser Gly Gly Asp Ile Lys Gln50 55 60Pro Lys Gln Glu Leu Pro Glu Pro Ser Ser Lys Gly Gln Lys Lys Pro65 70 75 80Arg Leu Pro Lys Arg Cys Leu Phe Lys Pro Glu Gln Gly Asn Cys Ala85 90 95Gly Ser Arg Phe Leu Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Ser100 105 110Cys Glu Pro Phe Thr Tyr Pro Val Cys Asn Lys Lys Asn Glu Ala Phe115 120 125Val Ser Cys Thr Leu Cys Met Asn Met Cys Met Arg Asn Lys Arg Gly130 135 140Arg Glu Lys Ala Lys Trp Ile Arg Lys Val Cys Arg Lys Ser Pro Lys145 150 155 160Val Lys Ser Gly。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I在大腸桿菌中的 重組表達(dá)方法，其特征在于，將不包含信號肽序列的實(shí)際編碼區(qū)亞克隆到原核表達(dá)載體 PGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-l/Rhipilin-l，轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌后，用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)；SDS-PAGE電泳分析顯示，重組GST融合蛋白獲得高效表達(dá)，GST-融合蛋白為 44kDa,與預(yù)期重組蛋白的大小一致。
3.如權(quán)利要求2所述的一種鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I在大腸桿菌中的重組 表達(dá)方法，其特征在于，所使用的宿主菌為BL21，質(zhì)粒為pGEX-4T-l，除去信號肽序列后的 編碼基因在大腸桿菌中高效表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-I在制備抗凝血生物制 劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了鐮形扇頭蜱抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列及其在大腸桿菌中的重組表達(dá)方法。通過構(gòu)建鐮形扇頭蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消減文庫和測序分析，從鐮形扇頭蜱克隆到一個抗凝血分子Rhipilin-1的全長編碼基因，核苷酸全長620bp，開放閱讀框編碼164個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為18kDa，在N-端有一個18個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列，并含有一個典型的Kunitz功能域，該分子與抗凝血分子之一的組織通道抑制因子顯著同源。將該基因亞克隆到pGEX-4T-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組GST融合蛋白以可溶性的形式高效表達(dá)。以純化的重組蛋白進(jìn)行兔血漿復(fù)鈣時間和部分凝血酶激活時間實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Rhipilin-1分子具有抗凝血生物活性，可用于制備抗凝血生物制劑。
文檔編號C12N15/15GK101928710SQ20091005369
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者向飛宇, 周勇志, 周金林, 李莊, 石磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所