專利名稱：：玉米基因Opaque1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種玉米基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是一種玉米基因0paquel的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)背景谷類作物提供了人類攝取蛋白的50%左右，而在發(fā)展中國家則占到了70%(GibbonandLarkins，2005)。隨著世界人口的持續(xù)增長、以及發(fā)展中國家飲食結(jié)構(gòu)的不斷調(diào)整，在世界有限的耕地上需要生產(chǎn)出更多的糧食。因此，糧食問題日益凸現(xiàn)、急需解決。玉米(Z朋歷^^L.)是世界上分布最廣的作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻位居世界第三位。它是全世界同時(shí)也是我國主要的糧食和飼料作物。據(jù)FA0統(tǒng)計(jì)，從1998年起，玉米總產(chǎn)量已超過小麥和水稻成為世界第一大糧食作物(史桂榮，2002)。玉米目前最主要的用途是作物飼料。作為飼料，玉米的蛋白含量和品質(zhì)是育種的重要目標(biāo)。通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。而這些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白，也稱作玉米蛋白(zein)。它是一類在種子發(fā)育過程中特異表達(dá)的蛋白，主要起貯存自由氨基酸的作用。醇溶蛋白又可以進(jìn)一步分為四類，分別是a、e、y和5醇溶蛋白。其中最大的一類是a醇溶蛋白。a醇溶蛋白基因家族根據(jù)所編碼蛋白的分子大小，又分為22kDa醇溶蛋白和19kDa醇溶蛋白兩個(gè)部分。a醇溶蛋白約占醇溶蛋白總量的80X以上，是決定種子蛋白含量的重要因素。各種類型的醇溶蛋白形成不可溶的組織，稱為蛋白體(proteinbody),分布于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中。在籽粒成熟過程中，蛋白體堆積于玻璃質(zhì)胚乳區(qū)域的淀粉粒間。玉米雖然含有較好的蛋白含量，但其蛋白品質(zhì)卻并不理想。這主要表現(xiàn)在玉米的必需氨基酸含量并不均衡，特別是缺乏必需氨基酸賴氨酸。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物。有8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須從外界食物中攝取。它們是蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，統(tǒng)稱"必需氨基酸"。8種必需氨基酸中，以賴氨酸影響最大，但在普通玉米中缺乏也最多。因此高賴氨酸玉米的培育是提高玉米蛋白品質(zhì)的重點(diǎn)。高賴氨酸玉米與普通玉米最本質(zhì)的區(qū)別是胚乳中各種蛋白質(zhì)組成及蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異。高賴氨酸玉米營養(yǎng)價(jià)值提高的原因是其醇溶蛋白含量下降；而谷蛋白、白蛋白、球蛋白等非醇溶蛋白含量相對(duì)提高。由此表明，玉米種子中儲(chǔ)藏蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著地影響著玉米作為動(dòng)物飼料的營養(yǎng)價(jià)值，因此對(duì)蛋白質(zhì)含量以及成分的改變是培育高蛋白品質(zhì)玉米的關(guān)鍵途徑。玉米的一些籽粒突變對(duì)儲(chǔ)藏蛋白的氨基酸含量有很大的影響，其中最為顯著的是玉米的粉質(zhì)籽粒突變體(Opaque突變體)。這些籽粒突變體都定位在不同的玉米染色體位點(diǎn)，都不同程度地改變了儲(chǔ)藏蛋白的積累和必需氨基酸的含量，因此在玉米蛋白品質(zhì)的遺傳育種上都具有潛在的價(jià)值。其中&a^/e-J(02)是一種能夠顯著改變胚乳儲(chǔ)藏蛋白氨基酸含量的突變類型。玉米胚乳粉質(zhì)突變體opa^ye湖發(fā)現(xiàn)為玉米品質(zhì)改造創(chuàng)新提供了極為重要的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)oi通過減少醇溶蛋白的合成、增加其它富含賴氨酸的蛋白質(zhì)，從而最終提高胚乳中賴氨酸的含量。除o2外，玉米中還存在大量其它的Opaque突變體，它們都在不同程度上影響了儲(chǔ)藏蛋白的含量和必需氨基酸的含量，在玉米高必需氨基酸的遺傳育種上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。叩鄰^/(oD是玉米經(jīng)典的粉質(zhì)胚乳突變體，最早由Singleton和Jones發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)出柔軟、粉質(zhì)的籽粒表型。ol突變體在特定遺傳背景下(如A69Y等)，能產(chǎn)生o2突變體類似的效應(yīng)，賴氨酸含量增加，蛋白品質(zhì)提高(Balconietal.，1998)。經(jīng)典遺傳學(xué)將ol是定位于玉米第四號(hào)染色體長臂的一個(gè)基因。已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明其引起賴氨酸含量增加的機(jī)制有別于o2等其他突變體。因此可以在多重突變的情況下，通過效應(yīng)疊加，進(jìn)一步增強(qiáng)賴氨酸等必需氨基酸的含量。所以ol無論是單獨(dú)使用，或是和o2等其他高賴氨酸突變體聯(lián)合使用，都將對(duì)高賴氨酸或高必需氨基酸含量的高品質(zhì)玉米的培養(yǎng)起到很好的作用。Opaquel基因至今未通過雜交育種被很好地利用。首先是因?yàn)閛l由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時(shí)間；其次，由于籽粒在脫水過程中受外界環(huán)境影響，最終收獲的籽粒在表型鑒定上存在一定誤差，所以在籽粒成熟時(shí)對(duì)ol類型籽粒的選擇上存在較大難度。DNA分子標(biāo)記輔助育種是一項(xiàng)新的育種技術(shù)，該技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)控制目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時(shí)識(shí)別難的問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。與常規(guī)育種相比，該技術(shù)可提高育種效率2-3倍。由于其明顯的優(yōu)越性，該技術(shù)己引起了發(fā)達(dá)國家的高度重視。DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是(1)獲得的分子標(biāo)記應(yīng)該是能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合Ol類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性標(biāo)記；(2)獲得的共顯性分子標(biāo)記位于該基因在染色體物理位置的兩側(cè)；(3)兩側(cè)的DNA分子標(biāo)記都應(yīng)該與控制目標(biāo)性狀的基因緊密連鎖。但是，以往研究中并沒有獲得位于01基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，故無法對(duì)該基因所控制的目標(biāo)性狀進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助選擇。所以，對(duì)于該種標(biāo)記的獲得和鑒定是對(duì)玉米高氨某酸品質(zhì)某閔01講行DNA分^MiB輔fltS種J5^1。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種玉米基因Op叫uel的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的之二在于提供在該分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本(01類型以及育種中廣泛使用的野生型自交系B73、Mo17、W64A和W22類型，)以及它們雜交子代(F1代)類型中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種玉米基因0paquel的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至3'端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA;反向引物從5，端至3'端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA;擴(kuò)增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5，端至3，端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG;反向引物從5，端至3'端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。一種上述的玉米基因0paquel的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。本發(fā)明通過經(jīng)典的遺傳定位獲知基因定位在玉米第4號(hào)染色體的長臂上(Bin4.07)。通過在01位點(diǎn)附近為純合突變體和純合野生型的植株構(gòu)建的回交群體(BC)，提取純合突變體、野生型以及BC群體各單株的基因組DNA。在前人粗定位的基礎(chǔ)上，通過篩選已有的SSR分子標(biāo)記，獲取有多態(tài)性的SSR類型分子標(biāo)記(umc2027與umcl999)，將01基因定位于分子標(biāo)記umc2027與umcl999之間。根據(jù)umc2027與咖cl999之間已知的B73基因組序列(http:〃麗.genome,arizona.edu/fpc/maize)'設(shè)計(jì)引物。通過測(cè)序以及序列比對(duì)，獲得純合突變體與純合野生型親本間的序列差異，并通過所測(cè)序列開發(fā)標(biāo)記，獲得能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合01類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性分子標(biāo)記IDPg21與IDPg25。以遺傳學(xué)中兩點(diǎn)與三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)對(duì)這2個(gè)共顯性分子標(biāo)記與01基因的遺傳連鎖關(guān)系進(jìn)行分析表明，這兩個(gè)標(biāo)記位于01基因染色體物理位置的兩側(cè)，并且均與該基因緊密連鎖。以IDPg21與IDPg25對(duì)01與B73、Mol7、W22、W64A和BSSS53進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳分析表明，IDPg21在01與B73、Mo17、W64A、W22和BSSS53均具有多態(tài)性。IDPg25在01與B73、Mo17、W64A和W22具有多態(tài)性。本發(fā)明提供的2個(gè)位于01基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，以及利用這兩個(gè)共顯件DNA分子標(biāo)記對(duì)01某閔講行分子標(biāo)記輔助詵擇的方法。利用這兩個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中01基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用01基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。圖l是玉米籽粒純合突變體外形圖，(01/01)籽粒，圖2為玉米籽粒野生型(+/+)籽粒。圖3是用于進(jìn)行01基因定位的BC群體構(gòu)建路線。圖4是標(biāo)記IDPg21在BC群體中的分離情況，其中01/01:01為純合體；OlA為雜合體；-為負(fù)對(duì)照；圖5是標(biāo)記IDPg25在BC群體中的分離情況，其中01/01:01為純合體；01/+為雜合體；-為負(fù)對(duì)照；圖6是本發(fā)明中分子標(biāo)記在玉米四號(hào)染色體長臂上的示意位置，其中CEN4代表四號(hào)染色體著絲粒，TEL代表端粒；圖7是標(biāo)記IDPg21在不同自交系間的多態(tài)情況；圖8是標(biāo)記IDPg25在不同自交系間的多態(tài)情況具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)或植物分子生物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(PlantMolecularBiology—ALaboratoryManual,MelodyS.Clark編，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記的獲得及與01連鎖關(guān)系的確定通過純合突變體(01/01)與純合野生型(+/+)雜交獲得Fl(01/+)，然后以F1為母本，純合突變體為父本進(jìn)行回交構(gòu)建回交(BC)群體，參見圖3。BC群體中出現(xiàn)了基因型分離，包含01/+與01/01兩種基因型，具有01/+基因型的與+/+基因型的籽粒均為非Opaque的野生型類型，具有01/01基因型的籽粒為Opaque的突變體類型，參見圖1和圖2。取BC群體中Opaque以及非Opaque類型的籽粒各1000粒以及純合突變體與純合野生型親本籽粒，將兩個(gè)親本以及Opaque以及非Opaque類型的籽粒分別放在盛有自來水的培養(yǎng)皿中室溫(22—25'C)浸泡7小時(shí)后，種于蛭石介質(zhì)中萌發(fā)，約一周后，在苗抽出第三片葉時(shí)，取約lcii^葉片放于1.5mlEDDendorf管中，放入液氮中諫凍。對(duì)所有材料講行DNA抽提，抽6提步驟如下-1.速凍后的葉片用塑料棒于Eppendorf管中磨碎，加入500W抽提液(Tris-HC1lOOmMpH8.5;EDTA20mMpH8.0:NaCllOOmM:月桂基肌氨酸鈉1%),劇烈混勻后室溫放置10min。2.在管中再加入500W酚氯仿異戊醇(25:24:1)，劇烈混勻后室溫放置10min。3.4'C8000g離心10min，吸取上清液400W至另一新的Eppendorf管，加入500W氯仿，輕柔混勻，室溫放置10min。4.4'C8000g離心10min，吸取上清液300Hl至另一新的E卯endorf管，加入750nl無水乙醇，輕柔混勻后，一20。C放置30min。5.4'C12000g離心10min，棄上清液，加入500Pl70%乙醇，輕柔顛倒Eppendorf管，室溫放置5min。6.重復(fù)步驟5。7.4'C12000g離心10min，棄上清液，放置超凈臺(tái)上自然風(fēng)干。8.用50WTE(Tris-HC110mMpH8.0;EDTAlmMpH8.0)溶解沉淀。保存于一20。C。9.取lWDNA樣品稀釋50倍，以紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品的0D260和0D280，通過0D260計(jì)算DNA樣品濃度。10.依據(jù)濃度，將樣品統(tǒng)一稀釋至50ng/ul，取lW用于PCR反應(yīng)。PCR體系按照北京鼎國生物公司提供的Taq酶說明書配制，溫度條件94°C1min;94'C20sec,58。C20sec,72°C40sec,32循環(huán)；72°C7min。PCR產(chǎn)物加入1/10體積的10Xloadingbuffer,上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠上，電泳至溴酚藍(lán)跑出底線，經(jīng)溴化乙錠染色后應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果，參見圖3和圖4。經(jīng)分析電泳結(jié)果，篩選到玉米數(shù)據(jù)庫(www.maizegdb.org)可以獲得的分子標(biāo)記(咖c2027,umcl999),通過初步定位將01定位于umc2027與umcl999。再通過分析這兩個(gè)標(biāo)記間的B73基因組序列，在基因非翻譯及內(nèi)含子區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，回收PCR產(chǎn)物，測(cè)序，比較野生型和突變體間的基因組差異。依據(jù)有差異的基因組區(qū)段設(shè)計(jì)引物，參見表l。通過PCR擴(kuò)增以及凝膠(瓊脂糖或聚丙烯酰胺)電泳分析，獲得了兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記IDPg21和IDPg25。進(jìn)一步將BC群體中的單株數(shù)擴(kuò)大到7000株，按照以上方法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR、電泳以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果表明，有50株在分子標(biāo)記IDPg01A和017間發(fā)生交換，有75株在分子標(biāo)記IDPg25和01間發(fā)生交換，有125株在分子標(biāo)記IDPg21和IDPg25之間發(fā)生交換。這些證據(jù)說明，IDPg21和IDPg25分別位于01基因染色體物理位置的兩側(cè)，分子標(biāo)記IDPg21和01間遺傳距離為0.71cM，分子標(biāo)記IDPg25和01間遺傳距離為1.07cM，參見圖6。表一分子標(biāo)記引物表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例二分子標(biāo)記在不同親本間的多態(tài)性鑒定使用實(shí)施例一中的方法提取Ol、野生型和四種育種中廣泛使用的自交系B73、Mo17、W64A和BSSS53的基因組DNA，通過PCR反應(yīng)識(shí)別在不同品種間的多態(tài)性。結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的分子標(biāo)記IDPg21可以區(qū)別01與B73、Mo17、W64A、W22和BSSS53這五種自交系，IDPgl5可以區(qū)別01與B73、Mo17、W64A和W22這四種自交系。在以B73、Mo17、W64A和W22這四種自交系為背景導(dǎo)入01基因進(jìn)行優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種時(shí)，分子標(biāo)記IDPg21和IDPg25可以起到對(duì)01基因進(jìn)行輔助選擇的作用，參見圖7和圖8。實(shí)施例三IDPg21和IDPg25對(duì)01基因分子標(biāo)記輔助選擇的方法利用這兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記IDPg21和IDPg25，可以鑒定01的基因型。分子標(biāo)記IDPg21和IDPg25對(duì)某一雜交組合中的子代進(jìn)行分析，兩側(cè)標(biāo)記同為野生型(如B73、Mo17、W64A和W22)類型條帶植株的基因型即為野生型，兩側(cè)的分子標(biāo)記同為雜合體(如Fl)類型條帶植株的基因型即為雜合體，兩側(cè)的分子標(biāo)記同為01/01純和突變體類型條帶植株的基因型即為突變體。通過這兩個(gè)分子標(biāo)記對(duì)雜交育種時(shí)子代各個(gè)單株進(jìn)行基因型鑒定的準(zhǔn)確性很高，錯(cuò)選概率僅為1.89X10—5,所以這兩種分子標(biāo)記對(duì)利用01基因進(jìn)行分子育種時(shí)具有重要的輔助作用。序列表<110〉上海大學(xué)<120〉玉米基因0paquel的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<160〉5<210〉1<211〉19<212>腿<213〉人工序列〈400〉1GGGCTTATCTCGCTCTCCA19<210〉2〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈210〉3〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3CGCTTATTGATGAGCAGTCTG21<210>4〈211〉22<212>DNA〈213>人工序列<400>4GGATACTATACTCGATCGCAAT22<400>GGTGC2CGGGCATAGTCTAA權(quán)利要求1.一種玉米基因Opaquel的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA；反向引物從5’端至3’端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA；擴(kuò)增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG；反向引物從5’端至3’端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。2.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米基因Opaquel的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種玉米基因Opaque1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。該分子標(biāo)記的擴(kuò)增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA，反向引物從5’端至3’端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA；擴(kuò)增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG，反向引物從5’端至3’端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。利用本發(fā)明的兩個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中01基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用01基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101629210SQ20091005386公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者宋任濤,晶張,林佃彬,慧王,王桂鳳,許政暟申請(qǐng)人:上海大學(xué)