專利名稱：一種Exendin-4衍生物的重組制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有Exendin-4活性的Exendin-4衍生物及其制備和應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
1992年，Eng等從分布于美國亞利桑那州和墨西哥北部的希拉毒蜥(/feJoofer鵬^y印ecfM/7)唾液中分離到一種由39個氨基酸組成的蛋白，與GLP-1有53%的同源性，后將其命名為Exendin-4。隨后的研究表明，Exendin-4和GLP-1作用于同一受體，信號轉導途徑類似，在哺乳動物體內具有完全相同的生理功能。Exendin-4能刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌，即在血糖濃度高時刺激胰島素分泌，低濃度和正常濃度時不刺激胰島素分泌；同時還具有促進P細胞增殖與新生、抑制胰高血糖素分泌、減緩胃排空、抑制食物吸收等作用。2005年4月，化學合成的GLP-1類似物Exenatide經美國FDA批準上市，臨床實驗表明Exenatide
能^效控制二甲雙胍與磺酰脲類療效不理想的n型糖尿病，降低空腹及餐后血糖，降低糖化血紅蛋白含量，減輕體重，對n型糖尿病有較好的療效。
但是，由于Exenatide (酰胺化的Exendin-4)的半衰期較短(2~4小時)，需每日皮下注射兩次，給患者帶來極大痛苦?？梢奅xenatide在臨床應用上還是存在較大的缺陷，因此迫切需要開發(fā)半衰期更長的、便于臨床使用的Exendin-4衍生物。
國內外對Exendin-4的研究方向之一是通過對其結構進行改變，將得到的Exendin-4衍生物應用于糖尿病治療，以達到延長藥物在體內的藥效時間的目的。美國Amylin公司采用一個或多個聚乙二醇(PEG)聚合物修飾Exendin-4賴氨酸上的e -氨基，上述Exendin-4衍生物與天然Exendin-4相比，能夠顯著延長半衰期，此外還能降低免疫原性、抵抗蛋白酶水解、提高生物利用度、降低毒性并增加穩(wěn)定性，但該方法的制備工藝較復雜，產物分離純化困難，而且得率很低，不利于工業(yè)化生產。
4Exendin-4衍生物可以通過固相化學合成制備獲得，見本發(fā)明人的發(fā)明專利申請(申請?zhí)枮?200910045187.6"，發(fā)明名稱為"一種Exendin-4衍生物及其固相化學合成")，但該制備方法的成本較高，因此，本發(fā)明提供了一種經濟高效的，利用DNA重組技術制備Exendin-4衍生物的方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明涉及的Exendin-4指Exendin-4 (1-39)，其序列(Seq ID No. 1)羅列如下
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。此外，還涉及Exendin-4的截短形式Exendin-4 (1-30)，其序列，(Seq ID No. 5)羅列如下
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A1a-Val-Arg_Leu_Phe-11e-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly 。
本發(fā)明提出的Exendin-4衍生物m39Exendin-4具有以下三種結構Exendin—4 (1—39) 一Xaa40 (Seq ID No. 2)， Exendin—4 (1—39) —Xaa40—Xaa41(Seq ID No.3)和Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41-Xaa42 (Seq ID No. 4)之一，其中Xaa40， Xaa41和Xaa42分別是Cys， Ala， Gly， His, Ser和Thr中的
任何一個氨基酸。
本發(fā)明提出的Exendin-4衍生物m30Exendin-4具有以下三種結構Exendin-4 (1-30) -Xaa31 (Seq ID No. 6)， Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32
(Seq ID No. 7)和Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33 (Seq ID No. 8)之一，其中Xaa31, Xaa32和Xaa33分別是Cys， Ala, Gly， His, Ser和Thr中的任何一個氨基酸。
上述衍生物不僅保持了天然Exendin-4在體內的活性，還顯著延長了體內藥效時間，具有非常良好的臨床應用價值。此外，該衍生物通過DNA重組技術制備，成i低，產量高，有利于大規(guī)模生產和使用。
本發(fā)明的技術方案是提供利用DNA重組技術制備上述衍生物的方法。
通過DNA重組技術生產Exendin-4衍生物，成本低，產量高，易于純化，且純化過程中活性損失較小。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案選用DNA重組技術來制備Exendin-4衍生物。
現(xiàn)詳細說明本發(fā)明的技術方案。
一種Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，包括步驟
(1) 按Exendin-4衍生物的氨基酸序列合成基因片段；
(2) 構建含有Exendin-4衍生物編碼序列的重組表達載體；
(3) 用含有Exendin-4衍生物或融合的Exendin-4衍生物基因序列的表達載體轉入原核生物的宿主細胞，獲得基因工程菌株；
■ (4)將基因工程菌株經液體發(fā)酵，離心獲得含有Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的濕菌體；
(5) 將濕菌體破壁，分離獲得含Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的粗品；
(6) 經純化，冷凍干燥制得Exendin-4衍生物。本發(fā)明的另一技術方案是提供Exendin-4衍生物在制備預防或治療糖尿病的
藥物中作藥物活性成分的應用。
本發(fā)明的另一技術方案是提供含有有效量Exendin-4衍生物以及藥學可接受的成分的組合物。
,本發(fā)明的Exendin-4衍生物優(yōu)選以無菌凍干物形式儲存，在給藥前與合適的等滲溶液混合，其中含有藥學上可接受的成分如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉等，然后可通過靜脈注射、腹腔注射或皮下注射等方式給藥。
下面的附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，以下m3犯xendin-4和m30Exendin-4代表本發(fā)明的Exendin-4衍生物。
圖1是質粒pET32a(+)-m39Exendin-4的構建，其中該質粒含Exendin-4衍生物。
圖2是質粒pET32a(+)-m3犯xendin-4(Trx-)的構建，其中該質粒含Exendin-4衍生物。
圖3是質粒pET32a(+)-m30Exendin-4的構建，其中該質粒含Exendin-4衍生物。
圖4是質粒pET32a(+)-m30Exendin-4(Trx-)的構建，其中該質粒含Exendin-4衍生物。
具體實施例方式
下面結合實施例，進一步詳述本發(fā)明。說明書及以下實施例中所用質粒、菌體等，以及未注明具體條件的實驗方法，可按常規(guī)條件進行，或按商品供貨商所建議的條件進行。
實施例l DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子結構式為Seq ID No. 2，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40，其中Xaa40=Cys;
步驟(1)中按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，通過PCR方法合成以下長度為164bp的片斷，即Seq ID No. 9:gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggtggtccg 120agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnntaa tgaaagctta aact 164其中，nl45=t， nl46=g， nl47=c;
其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以及限制性內切酶餘2II和歷/7dlII位點；
.步驟(2)中，上述基因片斷以限制性內切酶^^II和歷'/7dni雙酶切并純化回收，以限制性內切酶II和歷Vxini雙酶切大腸桿菌質粒pET32a (+)并純化回收大片斷，二者混合后加入T4 DNA連接酶，16'C連接1-8小時，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的重組質粒pET32a(+) -m39Exendin-4;
步驟(3)中，重組質粒pET32a(+)-m39Exendin-4與受體菌大腸桿菌BL21 (DE3)混合，冰浴15-30分鐘，42。C水浴熱激60-90秒，37。C培養(yǎng)30-45分鐘，菌液涂布含氨芐青霉素的瓊脂糖平板，37t)培養(yǎng)12-16小時后出現(xiàn)的菌落即為含有Exendin-4衍生物基因序列的基因工程菌株；
步驟(4)中，含有Exendin-4衍生物基因序列的基因工程菌株在含氨芐青霉，的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600nm=0. 5-0. 9，加IPTG至終濃度0.5-1.0mmol/L， 37"C誘導3-5小時，離心收集濕菌體；
7步驟(5)中，菌體重懸于IDA-0緩沖液，冰浴中超聲破碎，離心后收集上清進行鎳離子螯合親和層析，收集含Exendin-4衍生物融合蛋白的洗脫組分，采用截留分子量為5kD的Amicon Ultra-15超濾離心管將蛋白脫鹽、濃縮至3mg/mL以上，得到含有Exendin-4衍生物融合蛋白的粗品；
步驟(6)中，在Exendin-4衍生物融合蛋白粗品中加入腸激酶，23-25。C裂解6-12小時，反應混合液再進行鎳離子螯合親和層析，收集穿透峰，冷凍干燥獲得Exendin-4衍生物。
實施例2 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子結構式為Seq ID No. 3，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41，其中Xaa40=Cys，Xaa41:Gly;
'步驟(1)中按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，通過PCR方法合成以下長度為167bp的片斷，即Seq ID No. 10:gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggtggtccg 120agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnnnnn taatgaaagc ttaaact 167其中，nl45=t， nl46=nl48=nl49=g， nl47=nl50=c;
其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以及限制性內切酶5g7II和ffi/7dlll位點；其余步驟同實施例l。.實施例3 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子結構式為Seq ID No. 3，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41，其中Xaa40:Gly，Xaa41=Cys;
步驟(1 )合成的Seq ID No. 10基因片斷中，nl45=nl46=nl49=g， nl47=nl50=c，nl48=t。
其余步驟同實施例l。
實施例4 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子結構式為Seq ID No. 4，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41-Xaa42，其中Xaa40=Cys， Xaa41=Ala， Xaa42=Gly;
步驟(1)中按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，通過PCR方法合成以下長度為170bp的片斷，即Seq ID No. 11: gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggtggtccg 120 agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnnnnn nnntaatgaa agcttaaact 170 其中，nl45=t， nl46=nl48=nl50=nl51=nl52=g， nl47=nl49=nl53=c; 其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以 及限制性內切酶A^II和歷/7dlII位點； 其余步驟同實施例1。
實施例5 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 4，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41-Xaa42，其中 Xaa40=Ala， Xaa41=Cys， Xaa42=Gly;
'步驟(1)合成的Seq ID No. ll基因片斷中，nl45=t， nl46=nl48=nl50=nl51=nl52=g， nl47=nl49=nl53=c。 其余步驟同實施例1。
實施例6 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 4，即Exendin-4 (1-39) -Xaa40-Xaa41-Xaa42，其中 Xaa40=Ala， Xaa41=Gly， Xaa42=Cys:
步驟(1)合成的Seq ID No. 11基因片斷中，nl45=nl47=nl48=nl49=nl52=g， nl46=nl50=nl53=c， nl51=t。
其余步驟同實施例1。 .實施例7以敲除硫氧還蛋白方式制備Seq ID No. 2的Exendin-4衍生物；
步驟(2)中將含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒 pET32a(+)-m3犯xendin-4用限制性內切酶yVote I酶切構建得到含有Exendin-4 衍生物基因序列的質粒pET32a(+)-m39Exendin-4(Trx-)，其中Trx是硫氧還蛋 白。
實施例8 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 6,即Exendin-4 (1-30) -Xaa31，其中Xaa31=Cys;
步驟(1)中按Exendiri-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子， 通過PCR方法合成以下長度為137bp的片斷，即Seq ID No. 12:cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnnn 120 taatgaaagc ttcctcc 137 其中，nll8=t， nll9=g， nl20=c;
其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以 及限制性內切酶II和歷"dIII位點； 其余步驟同實施例l。
實施例9 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 7，即Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32，其中Xaa31=Cys， Xaa32=Gly;
步驟(1)中按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子， 通過PCR方法合成以下長度為140bp的片斷，即Seq ID No. 13: cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnnn 120 nnntaatgaa agcttcctcc 140 其中，nll8=t， nll9=nl21=nl22=g， nl20=nl23=c;
其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以 及限制性內切酶份JII和歷"dIII位點； 其余步驟同實施例1。
實施例10 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 7，即Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32，其中Xaa31=Gly， Xaa32=Cys;
步驟(l)合成的Seq ID No. 13基因片斷中，nll8all9勺122二g， nl20=nl23=c， nl21=t。
其余步驟同實施例l。
實施例11 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No, 8，即Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33，其中 Xaa31=Cys， Xaa32=Ala， Xaa33=Gly;
步驟(1)中按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，通過PCR方法合成以下長度為143bp的片斷，即Seq ID No. 14: cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnnn 120 nnnnnntaat gaaagcttcc tec 143
其中，nll8=t， nll9=nl21=nl23=nl24=nl25=g， nl20=nl22=nl26=c; 其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以 及限制性內切酶II和歷/ dlII位點； 其余步驟同實施例l。
實施例12 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 8，即Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33，其中 Xaa31=Ala， Xaa32=Cys， Xaa33=Gly;
步驟(1)合成的Seq IDNo. 14基因片斷中，nll8=nl20=nl22=nl24=nl25=g， nll9=nl23=nl26=c， nl21=t。 '其余步驟同實施例l。
實施例13 DNA重組技術制備本發(fā)明的Exendin-4衍生物，該衍生物的分子 結構式為Seq ID No. 8，即Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33，其中 Xaa31=Ala， Xaa32=Gly， Xaa33=Cys;
步驟(1)合成的Seq IDNo. 14基因片斷中，nll8=nl20=nl21=nl22=nl25=g， nll9=nl23=nl26=c， nl24=t。
其余步驟同實施例l。
實施例14 以敲除硫氧還蛋白方式制備Seq ID No. 6的Exendin-4衍生物；
步驟(2)中將含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒 pET32a(+)-m30Exendin-4用限制性內切酶A^e I酶切構建得到含有Exendin-4 衍生物基因序列的質粒pET32a(+)-m30Exendin-4(Trx-)，其中Trx是硫氧還蛋 白。
實施例15 Exendin-4衍生物的降血糖作用。 實驗材料與方法
雌性健康昆明小鼠(清潔級，上海復旦大學醫(yī)學院動物中心提供)； 60%葡萄糖溶液；0. 9%NaCl溶液； Exendin-4 (1-39); Exendin-4 (1-30);
m39Exendin-4，具有實施例1所述Exendin-4衍生物的結構；
m30Exendin-4，具有實施例8所述Exendin-4衍生物的結構； '血糖測試儀(上海新立醫(yī)療器械有限公司出品)。
雌性健康昆明小鼠禁食過夜，分為5組(n=10)。 1，生理鹽水對照組；2， Exendin-4(1 -39)給藥對照組；3， Exendin-4(1-30)給藥對照組；4， m39Exendin-4 給藥組，具體的序列結構是實施例1中所述的結構；5, m30Exendin-4給藥組， 具體的序列結構是實施例8中所述的結構。Exendin-4 (1-39)給藥對照組2腹 腔注射0. 5ug的Exendin-4 (1-39); Exendin-4 (1-30)給藥對照組3腹腔注射 0. 4ug的Exendin-4(1-30);m3犯xendin-4給藥組4 9，每組分別腹腔注射0. 5ug 的m3犯xendin-4; ra30Exendin-4給藥組10 15，每組分別腹腔注射0. 4ug的 m30Exendin-4;記此時為零時刻。1 3組于5. 5、 9. 5、 11. 5、 13. 5、 23. 5、 27. 5、 29:5、 35. 5小時給予100uL 60%葡萄糖溶液，分別于6、 10、 12、 14、 24、 28、 30、 36小時進行小鼠尾靜脈取血10ul，用血測試糖儀測定血糖濃度；4組于5. 5、 11.5、 23.5、 29.5、 35. 5小時給予100uL 60%葡萄糖溶液，分別于6、 12、 24、 30、 36小時進行小鼠尾靜脈取血10ul，用血測試糖儀測定血糖濃度；5組于5. 5、 9.5、 13.5、 23.5、 27. 5小時給予100uL 60%葡萄糖溶液，分別于6、 10、 14、 24、 28小時進行小鼠尾靜脈取血10ul，用血測試糖儀測定血糖濃度。
結果如下表所示，所示數值均為n=10的均值，所示降糖率按如下方法計算 降糖率(％)=(生理鹽水對照組血糖值-給藥組血糖值)/生理鹽水)(才照組血糖值。 與生理鹽水對照組小鼠相比，在給藥后6小時，Exendin-4 (1-39)給藥對照組 和,Exendin-4 (1-30)給藥對照組均不能顯著降低小鼠血糖，Exendin-4 (1-39) 的降血糖活性稍高于Exendin-4 (1-30)。而m39Exendin-4給藥組可在30小時 內顯著降低小鼠血糖，m30Exendin-4給藥組可在24小時內顯著降低小鼠血糖， 藥效持續(xù)時間均比Exendin-4 G-39)延長。結果還顯示，按本發(fā)明方法制備出 的m3犯xendin-4和m30Exendin-4均表現(xiàn)出比固相化學合成制備的 m39Exendin-4和m30Exendin-4更加長效的降血糖活性。
12表 m39Exendin-4、 m30Exendin-4的降血糖作用 降糖率(％)
6h10h12h14h24h30h36h
10000000
213.9000000
32.8000000
452. 2—40. 1—39.225.413.0
552. 141. 0—22.726.300
實施例16包含Exendin-4衍生物的組合物
取lmg通過DNA重組技術制備的m30Exendin-4，溶解于0. 5mL去離子水中; 另取50mg甘露醇，溶解于0.5mL去離子水中；將二者混勻即為m30Exendin-4 與甘露醇的組合物，其中含lrag/mL的m30Exendin-4以及50mg/mL的甘露醇。
13序列表
<110〉華東師范大學
<120〉 一種Exendin-4衍生物的重組制備方法和應用 <160〉 8 〈210> 1 <211> 39 〈212〉 PRT
〈213〉 希拉毒蜥(/fe7。Gfermg s卿e""歷) 〈400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Uu Lys Asn Gly Gly 20 25 30
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35
〈210> 2 〈211〉 40 <212> PRT 〈213>人工序列 <220〉
〈221〉合成構建體 〈222> (40)
<223> Xaa=Cys， Ala， Gly， His, Ser或Thr <400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 25 30Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40
〈210〉 3 <211> 41 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉
〈221〉合成構建體 〈222〉 (40， 41)
〈223〉 Xaa=Cys， Ala， Gly， His, Ser或Thr 〈400〉 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 25 30
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa Xaa 35 40
〈210〉 4 〈211〉 42 <212〉 PRT <213>人工序列 <220>
<221>合成構建體 〈222〉 (40， 41， 42)
<223> Xaa=Cys， Ala, Gly， His, Ser或Thr 〈400〉 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly20
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35
<210> 5 〈211〉 30 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 5
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu 20
〈210〉 6 〈211〉 31 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220〉
〈221〉合成構建體 <222〉 (31) <223〉 Xaa=Cys， Ala， Gly， His, Ser或Thr 〈400〉 6
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 25 30
X犯
<210> 7 〈2'11〉 32 〈212〉 PRT
25
Xaa Xaa Xaa 40
30
Leu Ser Lys Gin Met Glu
10 15
Trp Leu Lys Asn Gly Gly<213〉人工序列 〈220〉
〈221〉合成構建體 〈222〉 (31， 32)
<223〉 Xaa=Cys， Ala， Gly， His, Ser或Thr <400> 7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser 5
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie 20
Xaa Xaa 〈210〉 8 <211> 33 〈212〉 PRT <213>人工序列 〈220〉
〈221>合成構建體 〈222〉 (31， 32， 33) 〈223〉 Xaa=Cys， Ala， Gly， His, Ser或Thr 〈400〉 8
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 25 30
Xaa Xaa Xaa 〈210> 9 <211> 164 <212〉 薩 <213>人工序列
Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 10 15 Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 25 30
17<220>
〈2^1〉 misc_feature 〈222〉 (145， 146， 147) <223> n=a或g或c或t <400> 9
gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnntaa tgaaagctta 〈210〉 10 〈211〉 167 〈212> DNA <213〉人工序列 〈220〉
〈221> raisc_feature 〈222〉 (145， 146， 147， 148， 149， 150) 〈223〉 n=a或g或c或t 〈400〉 10
gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat 3gcagcggtg cgccgccgcc gagcnnnnnn taatgsaagc <2'10〉 11 〈211〉 170 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
<221> misc一feature
〈222〉 (145， 146, 147， 148， 149， 150， 151， 152， 153) 〈223〉 n=a或g或c或t <400〉 11
cctttaccag cgatctgagc 60 ggctgaaaaa tggtggtccg 120 aact 164
cctttaccag cgatctgagc 60 ggctgaaaaa tggtggtccg 120 ttaaact 167gccctagatc tggatgacga tgacaagcatggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc
aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctgtttattgaat ggctgaaaaa tggtggtccg
agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnnnrmnrmtaatgaa agcttaaact 170
<210>12
〈211>137
<212>DNA
〈213〉人工序列
<220〉
〈221〉misc—feature
<222>(118， 119， 120)
<223>n=a或g或c或t
〈400〉12
cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60
aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnnn 120
taatgaaagc ttcctcc 137
〈210〉 13
<211〉 140
<212> 腿
〈213〉人工序列
<220>
〈221> misc一feature
<2&〉 (118， 119， 120， 121， 122， 123)
〈223〉 n=a或g或c或t
〈400> 13
cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnnn 120 nnntaatgaa agcttcctcc 140 <210> 14 <211〉 143
19<212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
<221〉 misc—feature
〈222> (118， 119， 120， 121， 122， 123， 124， 125， 126) <223〉 n=a或g或c或t <400〉 14
cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcnrm 120 rmnnrmtaat gaaagcttcc tcc 14權利要求
1.一種Exendin-4衍生物的重組制備方法，其特征在于，包括步驟(1)按Exendin-4衍生物的氨基酸序列合成基因片段；(2)構建含有Exendin-4衍生物編碼序列的重組表達載體；(3)用含有Exendin-4衍生物或融合的Exendin-4衍生物基因序列的表達載體轉入原核生物的宿主細胞，獲得基因工程菌株；(4)將基因工程菌株經液體發(fā)酵，離心獲得含有Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的濕菌體；(5)將濕菌體破壁，分離獲得含Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的粗品；(6)經純化，冷凍干燥制得Exendin-4衍生物。
2.根據權利要求l所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，該衍 生物的分子結構式為Seq ID No. 2，即Exendin-4(1-39)-Xaa40，其中Xaa40=Cys;步驟(1)中，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼 子，合成以下長度為164bp的片斷，即Seq ID No. 9:gccctagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60 aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggtggtccg 120 agcagcggtg cgccgccgcc gagcnnntaa tgaaagctta aact 164 其中，nl45=t， nl46=g， nl47=c;其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以 及限制性內切酶餘JII和歷/7dlII位點；步驟(2)中，以限制性內切酶^^II和歷'/7din雙酶切，以大腸桿菌質粒 pET32a(+)為表達載體，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的重組質粒 pET32a(+) -m39Exendin-4;步驟(3)中，宿主受體菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
3.根據權利要求2所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，以敲 除硫氧還蛋白方式制備Seq ID No. 2的Exendin-4衍生物；其中步驟(2)中， 將含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒pET32a(+) - m3犯xendin-4用限制性內 切酶AWe I酶切，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒 pET32a(+)-m39Exendin-4(Trx-)，其中Trx是硫氧還蛋白。
4.根據權利要求l所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，該衍生物的分子結構式為Seq ID No. 6，即Exendin-4(l-30)-Xaa31 ，其中Xaa31=Cys;步驟(1)中，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成以下長度為137bp的片斷，即Seq ID No. 12:cctccagatc tggatgacga tgacaagcat ggcgaaggca cctttaccag cgatctgagc 60aaacagatgg aagaagaagc ggtgcgcctg tttattgaat ggctgaaaaa tggcggcn加 120taatgaaagc ttcctcc 137其中，nll8=t， nll9=g， nl20=c;其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以及限制性內切酶份/II和歷/7dlII位點；步驟(2)中，用限制性內切酶v5!^n和歷Vxiin雙酶切，以大腸桿菌質粒pET32a(+)為表達載體，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的重組質粒pET32a(+)-m30Exendin-4;步驟(3)中，受體菌是大腸桿菌BL21 (DE3)。
5. 根據權利要求4所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，以敲除硫氧還蛋白方式制備Exendin-4衍生物，該衍生物的分子結構式為Seq IDNo: 6;其中步驟(2)中，將含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒PET32a(+)-m30Exendin-4用限制性內切酶Nde I酶切，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒pET32a(+)-m30Exendin-4(Trx-)，其中Trx是硫氧還蛋白。
6. 如權利要求l所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的重組基因工程菌是攜帶重組質粒的大腸桿菌DH5ci ，BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述重組質粒是含有權利要求1所述的Exendin-4衍生物基因的四種重組質粒pET32a(+)-m3犯xendin-4， pET32a(+)-m3犯xendin-4(Trx-)，pET32a(+) -m30Exendin-4或pET32a(+) -m30Exendin-4 (Trx-)的任意之一，其中Trx是硫氧還蛋白。
7. 按權利要求1所述方法制備的Exendin-4衍生物在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分的應用。
8. —種組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的按權利要求1所述方法制備的Exendin-4衍生物，以及藥學可接受的成分。
全文摘要
一種具有Exendin-4活性的Exendin-4衍生物的重組制備方法和應用，屬于生物工程技術領域。該衍生物的分子結構式為以下的六種結構式Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)，Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq ID No.6)，Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)之一，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32和Xaa33分別是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一個氨基酸。采用DNA重組技術制備該衍生物。該衍生物具有長于Exendin-4的半衰期；通過DNA重組技術制備，易于純化，成本低，特別適合于在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分。
文檔編號C12N15/70GK101665799SQ20091005410
公開日2010年3月10日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權日2009年6月29日
發(fā)明者震 馮, 勛 勞, 吳自榮, 洋 汪, 娟 顧, 靜 黃 申請人:華東師范大學