專(zhuān)利名稱(chēng)：Tnfsf13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及TNFSF13作為藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑 的篩選方法。
背景技術(shù)：
光動(dòng)力療法(Photodynamic Therapy,簡(jiǎn)稱(chēng)PDT)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種通過(guò)生物光 敏化作用來(lái)?yè)p傷腫瘤組織的新型腫瘤療法。其原理是利用一些熒光量子產(chǎn)額高的光敏劑注 射體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞與其親和性高于正常細(xì)胞，因而潴留在腫瘤細(xì)胞中。當(dāng)用強(qiáng)光照射后， 光敏劑吸收光子躍遷至激發(fā)態(tài)，處于激光態(tài)的光敏劑再將能量傳至周?chē)难醴肿赢a(chǎn)生單線 態(tài)氧。單線態(tài)氧是細(xì)胞的強(qiáng)毒性劑，作用途徑包括直接損傷，即通過(guò)細(xì)胞膜、線粒體或溶 酶體等PDT敏感細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，破壞此結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞受損。
光敏劑正是通過(guò)上述的機(jī)制而殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織的損傷極小。光動(dòng)力療法 與傳統(tǒng)的三大腫瘤治療手段外科手術(shù)、化療和放療相比，由于光動(dòng)力療法具有雙重選擇 性即光導(dǎo)纖維的定向照射作用與藥物在腫瘤組織中的潴留作用，使該療法在腫瘤治療中具 有良好的應(yīng)用前景。
已經(jīng)研究和使用的大多數(shù)光敏劑都屬于四吡咯化合物，它是一類(lèi)具有卟吩核的大環(huán)化 合物的總稱(chēng)，四吡咯化合物廣泛存在于自然界中，如植物體內(nèi)的葉綠素。本實(shí)驗(yàn)室一直致 力于四吡咯新藥的研究和開(kāi)發(fā)。自主開(kāi)發(fā)的多種光敏劑無(wú)論在體內(nèi)和體外都顯現(xiàn)了良好的 光動(dòng)力殺傷作用。但合成什么樣結(jié)構(gòu)的光敏更有效？如何篩選出高效的光敏劑？在以往研 究中發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑的敏感性不同而且趨勢(shì)不一致，需要有一種方法或細(xì)胞 模型能篩選出高效的光敏劑。
TNFSF13是腫瘤壞死因子家族中的成員，腫瘤壞死因子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)殺傷作用， 我們前期工作發(fā)現(xiàn)光敏劑光動(dòng)力治療后TNFSF13明顯上調(diào)，TNFSF13上調(diào)后抑癌基因p53 表達(dá)水平也上調(diào)，提示光動(dòng)力療法可能通過(guò)介導(dǎo)TNFSF13表達(dá)而達(dá)到強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的作 用。
本發(fā)明在前期結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)以TNFSF13為光敏劑分子靶標(biāo)，通過(guò)監(jiān)測(cè)光動(dòng)力治 療前后TNFSF13改變情況判斷光敏劑的治療效果，同時(shí)通過(guò)TNFSF13低表達(dá)或不表達(dá)穩(wěn)定 株篩選出對(duì)腫瘤具有強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。TNFSF13作為基因藥靶在腫瘤光動(dòng)力療法光敏 劑篩選中的應(yīng)用為光動(dòng)力抗腫瘤治療提供良好的模型和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在前期結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)以TNFSF13為光敏劑分子靶標(biāo)，通過(guò)監(jiān)測(cè)光動(dòng)力治 療前后TNFSF13表達(dá)水平改變情況判斷光敏劑的治療效果，表達(dá)水平增加提示光敏劑具有 強(qiáng)殺傷腫瘤作用，以TNFSF13表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療 法光敏劑的篩選方法，包括如下步驟
a. Real-time PCR檢測(cè)耙腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)TNFSF13;
b. 光敏劑與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)； C.激光照射耙腫瘤細(xì)胞；
d. 收集激光照射后的腫瘤細(xì)胞抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
e. 檢測(cè)光敏劑光動(dòng)力治療后TNFSF13表達(dá)水平改變情況；
f. 以TNFSF13表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。 本發(fā)明通過(guò)TNFSF13RNA干擾慢病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行TNFSF13沉默，獲得TNFSF13低
表達(dá)或不表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株對(duì)光動(dòng)力治療腫瘤的效果，通過(guò)MTT檢測(cè) 光動(dòng)力治療后細(xì)胞的存活率，判斷與TNFSF13表達(dá)水平相關(guān)、對(duì)光動(dòng)力療法敏感的光敏劑，
獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光
敏劑的另一篩選方法，包括如下步驟
(1) 獲得TNFSF13RNA干擾慢病毒；
(2) TNFSF13 RNA干擾慢病毒感染靶腫瘤細(xì)胞，獲得不表達(dá)或低表達(dá)TNFSF13 的腫瘤穩(wěn)定細(xì)胞株；
(3) 將光敏劑與穩(wěn)定細(xì)胞株共培養(yǎng)；
(4) 激光照射與光敏劑共培養(yǎng)后的穩(wěn)定細(xì)胞株；
(5) MTT法評(píng)估細(xì)胞的存活率；
(6) 獲得治療效果與TNFSF13表達(dá)水平相關(guān)的光敏劑，即獲得對(duì)TNFSF13陽(yáng)性 腫瘤細(xì)胞敏感的光敏劑。
4步驟2中所述的靶腫瘤細(xì)胞可為根據(jù)real-time PCR法檢測(cè)TNFSF13在光動(dòng)力療法前后 的情況得到TNFSF13表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株
本發(fā)明中TNFSF13作為光敏劑藥靶將為光敏劑的篩選提供良好的細(xì)胞模型。通過(guò)檢測(cè) 光敏劑光動(dòng)力治療前后TNFSF13的改變和細(xì)胞對(duì)光敏劑療效改變等指標(biāo)來(lái)篩選具有強(qiáng)殺傷 作用的光敏劑，是良好的篩選模型、方式，為新型高效光敏劑獲得提供新的思路和方法。


圖1 TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑一種篩選方法的操作流程圖2實(shí)施例1的光敏劑光動(dòng)力治療前后TNFSF13差異表達(dá)圖，
X軸代表光敏劑光動(dòng)力治療中光敏劑濃度，Y軸代表TNFSF13表達(dá)水平；
圖3實(shí)施例2 MTT法檢測(cè)TNFSF13低表達(dá)或不表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑光動(dòng)力治療的 敏感性變化，
X軸中NC為正常表達(dá)TNFSF13的細(xì)胞，TNFSF13-siRNA為T(mén)NFSF13被沉默 的細(xì)胞；Y軸為細(xì)胞的存活率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:光敏劑光動(dòng)力治療前后TNFSF13差異表達(dá)檢測(cè) 1將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液， 接種于6cm培養(yǎng)皿中； 2置37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
3 24h后加光敏劑；
4 48h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(XD-635AB型光動(dòng)力PDT激光治療儀)； 5根據(jù)Invitrogen公司的Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，均為RNase-free操作；
6根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; 7 Real-time PCR檢測(cè)
配置反應(yīng)體系
試齊u每管加入
SYBR premix ex taq:
上游引物(5hM):
下游引物(5pM):0.5nl
cDNAl単
5(2) 設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-timePCR:預(yù)變性95。C， 15S;之后每一步變性95t:。 5S; 退火延伸6(TC， 30S;共進(jìn)行54個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。
(3) 制作熔解曲線
8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2: MTT法檢測(cè)TNFSF13低表達(dá)或不表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì) 光敏劑光動(dòng)力治療的敏感性變化
1. 將TNFSF13RNA干擾慢病毒感染腫瘤細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549株，獲得低表達(dá)或不表達(dá) TNFSF13的穩(wěn)定細(xì)胞株；
2. 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，正常表達(dá) TNFSF13的肺癌細(xì)胞株A549株作為對(duì)照；
3. 接種于96孔板，每孔100nl;
4. 置37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
5. 24h后加光敏劑；
6. 48h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(XD-635AB型光動(dòng)力PDT激光治療儀)
7. 72h時(shí)進(jìn)行MTT檢測(cè)
8. 進(jìn)行MTT前拍照
9. 培養(yǎng)終止前4h加入l(Hil5mg/ml的MTT
10. 吸棄培養(yǎng)液后加100plDMSO終止反應(yīng)
11. 酶標(biāo)儀570nm檢測(cè)OD值
12. 采用軟件SPSS12.0對(duì)兩種細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。
權(quán)利要求
1.一種TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法，其特征在于包括下列步驟a.Real-time PCR檢測(cè)靶腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)TNFSF13；b.光敏劑與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)；c.激光照射靶腫瘤細(xì)胞；d.收集激光照射后的腫瘤細(xì)胞抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA；e.檢測(cè)光敏劑光動(dòng)力治療后TNFSF13表達(dá)水平改變情況；f.以TNFSF13表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法， 其特征在于所述腫瘤細(xì)胞是肺癌細(xì)胞株A549。
3. —種TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法，其特征在于包括 下列步驟(1) 獲得TNFSF13RNA干擾慢病毒；(2) TNFSF13 RNA干擾慢病毒感染靶腫瘤細(xì)胞，獲得不表達(dá)或低表達(dá)TNFSF13 的腫瘤穩(wěn)定細(xì)胞株；(3) 將光敏劑與穩(wěn)定細(xì)胞株共培養(yǎng)；(4) 激光照射與光敏劑共培養(yǎng)后的穩(wěn)定細(xì)胞株；(5) MTT法評(píng)估細(xì)胞的存活率；(6) 獲得治療效果與TNFSF13表達(dá)水平相關(guān)的光敏劑，即獲得對(duì)TNFSF13陽(yáng)性 腫瘤細(xì)胞敏感的光敏劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法， 其特征在于步驟2中所述的靶腫瘤細(xì)胞可為根據(jù)real-time PCR法檢測(cè)TNFSF13在光 動(dòng)力療法前后的情況得到TNFSF13表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選 方法，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞是肺癌細(xì)胞株A549。
全文摘要
本發(fā)明涉及TNFSF13作為光敏劑藥靶的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法。其通過(guò)將TNFSF13作為光敏劑的藥靶，在激光照射下檢測(cè)光敏劑光動(dòng)力治療前后TNFSF13表達(dá)水平改變，以TNFSF13表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑；利用TNFSF13作為光敏劑光動(dòng)力療法的藥物靶標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)TNFSF13被沉默后的細(xì)胞株對(duì)光動(dòng)力治療的敏感性，獲得治療效果與TNFSF13表達(dá)水平相關(guān)的光敏劑，即獲得對(duì)TNFSF13陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞敏感的光敏劑。本發(fā)明為良好的篩選模型、方式，為新型高效光敏劑獲得提供新的思路和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101665831SQ20091005478
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者丁志樓, 筠 孫, 楊曉霞, 鄭梅珍, 陳志龍 申請(qǐng)人:東華大學(xué);陳志龍