專利名稱：天然香料2-苯乙醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過酵母菌或活性酵母粉發(fā)酵制備天然香料2-苯乙醇 的方法。
背景技術(shù)：
2-苯乙醇(2-phenylethanol， 2-PE )，又名卩-苯乙醇、二苯基乙醇， 是一種具有玫魂花香的芳香醇，其味淡雅細(xì)膩，多存在于玫魂、百合、水 仙、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、餅干、奶酪、葡萄酒等食品 中的風(fēng)味物質(zhì)，該物質(zhì)在堿性環(huán)境以及對空氣的氧化作用穩(wěn)定，其衍生酯 類物質(zhì)，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產(chǎn)品。由于2-苯乙醇香氣輕柔甜 和，不僅是所有玫瑰香型香氣的基本組分，還具有協(xié)同增效作用，是多種 香型配方所需成分。目前2-苯乙醇廣泛應(yīng)用于食品、煙草、化妝品和洗滌 曰化用品中，其用量僅次于香蘭素，為第二大香料產(chǎn)品。
目前全球2-苯乙醇年消耗量近萬噸，多釆用化學(xué)合成方法生產(chǎn)，極少 部分從植物精油中提取，天然2-苯乙醇價格與合成2-苯乙醇相差很大。盡 管合成2-苯乙醇成本較低，但化學(xué)合成2-苯乙醇采用原料多為苯或苯乙烯， 這些合成原料可能的殘留會對人體健康和環(huán)境帶來危害，尤其是作為食品 添加劑時其安全性越來越受到關(guān)注。天然2-苯乙醇可通過物理提取、酶或 微生物法獲得，按歐美相關(guān)規(guī)定，生物轉(zhuǎn)化終產(chǎn)品定義為天然物質(zhì)的前提 是參與代謝的原料須為天然物質(zhì)，目前生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的前體L-苯丙氨 酸和葡萄糖、蔗糖等原料已可滿足上述要求，由于物理方法從玫瑰等植物 提煉油中獲得天然2-苯乙醇產(chǎn)量低成本昂貴，因此微生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙 醇就成為極具研究價值和前景的生產(chǎn)方法。國內(nèi)外研究表明2-苯乙醇可作為微生物殺菌劑，其濃度介于2~3g/L
就能完全抑制多種細(xì)菌和真菌的生長，包括酵母菌其自身生長，例如濃度 為2. Og/L的2-苯乙醇就能完全抑制馬克斯克魯維酵母的生長，對于釀酒酵 母，達(dá)到相同的抑制效果時，2-苯乙醇濃度需4.0g/L。
釆用液液兩相體系生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇，即將發(fā)酵產(chǎn)生的2-苯乙醇轉(zhuǎn)入 油酸或油醇等組成的有機(jī)相中，可以部分解除產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制與毒害，從 而獲得較高濃度2-苯乙醇累積。但釆用液液兩相體系工業(yè)生產(chǎn)2-苯乙醇過 程存在諸多困難，例如，產(chǎn)物分離過程困難，由于2-苯乙醇被轉(zhuǎn)移到有機(jī)
相，產(chǎn)物分離無法釆用吸附層析、有機(jī)溶劑萃取分離方法，同時油酸、油 醇及其發(fā)酵過程形成的氧化物破壞2-苯乙醇香氣品質(zhì)。其次，油水兩相乳
化難于完全分相，釆用膜滲透技術(shù)等使油水兩相分開，在工業(yè)放大時遇到 困難。此外，針對油水兩相，生產(chǎn)中需要不同分離操作單元與設(shè)備。第三， 發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程條件控制苛刻，由于發(fā)酵液引入粘度很高的有機(jī)相，其發(fā)酵 過程需要很高的溶解氧控制條件，包括攪拌轉(zhuǎn)速和通氣等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種通過固液兩相原位分離體系發(fā) 酵制備天然香料2-苯乙醇的方法。
本發(fā)明技術(shù)方案，天然香料2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟選 取克魯斯假絲酵母(&騰/ )、釀酒酵母CSbtcctoow戸j ceAW涵e)、
馬克斯克魯維酵母(/awyverawyc^ mamVwms)中的 一種酵母菌，接入種子培 養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)制備成種子液，將所述種子液或活性干酵母粉接種于發(fā)酵 培養(yǎng)基，以發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)的L-苯丙氨酸為底物，在發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐 中進(jìn)行液體好氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵液加入固相吸附介質(zhì)、L-苯丙 氨酸和葡萄糖，發(fā)酵過程溫度控制在25~37'C,轉(zhuǎn)化18~72h,轉(zhuǎn)化結(jié)東 后采用過濾或離心方式獲得固相吸附介質(zhì)，再釆用洗脫溶劑對所述固相吸 附介質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)一步蒸餾得到天然2-苯乙醇，其中，所述的L-
5苯丙氨酸加入濃度以發(fā)酵液體積計為5~30g/L,所述的固相吸附介質(zhì)包括 活性炭、人造沸石、大孔吸附樹脂或纖維素，所述的洗脫溶劑為無水乙醇 或95%乙醇。
所述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10~30g/L，麥芽汁3~5 g/L,豆芽 汁2 5g/L,蛋白胨4~6g/L，酵母膏2~5g/L， K2HP04. 3H20 0. 5 ~ 1. 5 g/L,溶劑為水，pH自然。
所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量以體積計為3~12%，所述活性 干酵母粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基按重量計為0. 2 ~ 1 0%。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖20~ 200g/L，蛋白胨3~25g/L，酵 母膏2 ~ 20 g/L， K風(fēng).3H20 0. 5 ~ 1. 5 g/L， MgS04. 7 H20 0. 3 ~ 2. 0 g/L, NH4C1 0. 5~1.5 g/L，溶劑為水，pH自然。
所述固相吸附介質(zhì)的用量與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量與體積比為0.01 ~ 0.15: 1。
所述固相吸附介質(zhì)在使用前進(jìn)行滅菌，其滅菌方式為紫外滅菌、60 ~ 121。C濕熱滅菌或150 - 200'C高溫干熱滅菌，滅菌時間10~120min。
所述好氧培養(yǎng)過程，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速100~ 300r/min，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速 100~ 800r/min，通氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為0. 3~1. 5V/V . min。
整個發(fā)酵過程控制發(fā)酵培養(yǎng)基水相中2-苯乙醇的濃度小于3.5g/L， L-苯丙氨酸的濃度大于l.O g/L,葡萄糖的濃度0.5~30.0 g/L。
洗脫液蒸餾的溫度為78~160°C。
發(fā)明的有益效果，本發(fā)明在發(fā)酵過程中加入的固相吸附介質(zhì)對2-苯乙 醇有吸附作用，可解除2-苯乙醇對酵母菌的抑制與毒害。本發(fā)明將酵母菌 發(fā)酵產(chǎn)物2-苯乙醇生物合成累積與產(chǎn)物吸附過程在發(fā)酵罐或發(fā)酵搖瓶中一 起完成，是采用固液兩相體系轉(zhuǎn)化2-苯乙醇將發(fā)酵轉(zhuǎn)化與產(chǎn)物的吸附分離 過程結(jié)合在一起，在克服2-苯乙醇對酵母菌毒害與抑制的同時，又減少提 取的工業(yè)化搡作工序，提高了產(chǎn)品的香氣品質(zhì)。本發(fā)明對生物轉(zhuǎn)化其自身對微生物產(chǎn)生抑制或毒害作用的同類天然香料有指導(dǎo)作用，操作方便，生 產(chǎn)成本低，應(yīng)用前景廣闊。


附圖l是本發(fā)明的方法工藝流程附圖2是實施例7蒸餾粗品的氣相色譜圖;
附圖3是實施例7蒸餾粗品的氣相質(zhì)譜圖。
下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，如圖1所示，天然香料2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟自由選克魯斯假絲酵母(^n/w/ Ca"i/Wa )、 酉良酒酵母CSacc/^ramycas cewv/s/ae)、 馬克斯克魯維酵母 (X7w"eram少c&s wan^"ws)中的 一種酵母菌，將其接入種子培養(yǎng)基，經(jīng)過培 養(yǎng)制備成種子液，所述的種子液或巿售活性干酵母粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基， 以發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)的L-苯丙氨酸為底物，在發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行液 體好氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵液加入固相吸附介質(zhì)、L-苯丙氨酸和葡 萄糖，發(fā)酵過程溫度控制在25~37°C，轉(zhuǎn)化18~72h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后釆用過 濾或離心方式獲得固相吸附介質(zhì)，再釆用洗脫溶劑對所述固相吸附介質(zhì)進(jìn) 行洗脫，洗脫液進(jìn)一步蒸餾得到天然2-苯乙醇。
本發(fā)明所述的L-苯丙氨酸加入濃度以發(fā)酵液體積計為5~30g/L。所述 的固相吸附介質(zhì)包括選活性炭、人造沸石、大孔吸附樹脂或纖維素。所述 的洗脫溶劑包括無水乙醇或95%乙醇。
本發(fā)明所述天然2-苯乙醇種子培養(yǎng)步驟為將自由選的酵母菌無菌操 作條件下接入種子培養(yǎng)基，25 - 37。C搖床培養(yǎng)18~40h，搖床轉(zhuǎn)速100-300r/min，所述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10~30g/L,麥芽汁3 5g/L, 豆芽汁2 ~ 5 g/L,蛋白胨4 ~ 6 g/L,酵母膏2 ~ 5 g/L， K2HP04. 3H20 0. 5 ~1.5g/L，溶劑為水，pH自然。所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量以體 積計為3~12%。巿售活性干酵母粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基按重量計為0.2~ 3. 0%。
本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖20~ 200g/L，蛋白胨3-25 g/L，酵母膏2~20 g/L， K2HP04. 3H20 0. 5 ~ 1. 5 g/L， MgS04. 7 H20 0. 3 ~ 2.0 g/L, NH4C1 0.5-1.5 g/L，溶劑為水，pH自然。發(fā)酵過程溫度控制在 25~37°C,轉(zhuǎn)化時間18 68h。所述發(fā)酵過程為好氧培養(yǎng)過程，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn) 速100 300r/min，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100 ~ 800r/min，通氣量按照通氣速率 比發(fā)酵液體積為0. 3 ~ 1. 5V/V min， L-苯丙氨酸加入濃度為5 ~ 30g/L。
本發(fā)明所述固相吸附介質(zhì)中活性炭、人造沸石、大孔吸附樹脂和纖維 素的任何一種固相吸附介質(zhì)，可釆用的滅菌方式包括紫外滅菌、60~12rC 濕熱滅菌或150 200。C高溫干熱滅菌，滅菌時間10~120min，對于不同固
相吸附介質(zhì)自由選一種滅菌的方式，所選滅菌方式對介質(zhì)吸附量影響較小 為宜。所述選擇的固相吸附介質(zhì)對酵母菌基本沒有毒性，不影響酵母菌生 長，可以將生物合成的天然2-苯乙醇吸附，降低發(fā)酵培養(yǎng)基水相中的2-苯
乙醇濃度。所述固相吸附介質(zhì)的用量與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量與體積比為 0. 01 ~ 0.15:1。
本發(fā)明所述發(fā)酵過程中可一次性或間歇加入固相吸附介質(zhì)、L-苯丙氨 酸和葡萄糖，整個發(fā)酵過程控制發(fā)酵培養(yǎng)基水相中2-苯乙醇的濃度小于 3.5g/L， L-苯丙氨酸的濃度大于l.O g/L，葡萄糖的濃度0.5~30. 0 g/L。
本發(fā)明所述發(fā)酵過程完成后可釆用過濾或離心方式獲得固相吸附介 質(zhì)，固相吸附介質(zhì)中的2-苯乙醇可采用無水乙醇或95%乙醇的任何一種進(jìn) 行洗脫或解吸,包括攪拌解吸、振蕩解吸或上柱洗脫，洗脫過程PH值為3.5~ 10. 0。
本發(fā)明所述固相吸附介質(zhì)得到的洗脫液可釆用蒸餾法獲得天然2-苯乙 醇的制品，蒸餾的方法包括常壓蒸餾、減壓蒸餾和精餾，蒸餾的溫度為78~ 16(TC，得到的產(chǎn)品通過氣相色譜分析或高效液相色譜分析純度在97.5%~99. 5%。
本發(fā)明中所述發(fā)酵轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的酵母菌采用如下方法獲得對自由 選克魯斯，爻絲酵母(^n^" Ca"力'fib )、酉良酒酵母CS^cc/z"ramyces cerev/w'ae)、 馬克斯克魯維酵母OawyverawycM wan;/a"w)中的任何一種或巿售活性酵 母粉，釆用所述種子培養(yǎng)步驟和發(fā)酵轉(zhuǎn)化步驟，最終獲得的發(fā)酵液通過氣 相色譜分析或高效液相色譜分析，發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度大于1. Og/L， 即可釆用所述固液兩相原位分離體系發(fā)酵制備天然2-苯乙醇。
實施例1
本發(fā)明實施例1的酵母菌為克魯斯假絲酵母(^r""/ "/^/&)保藏 于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC 1674,該酵母菌培養(yǎng) 溫度28 3(TC，為高溫生香酵母。
種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L,豆芽汁4g/L,蛋白胨5g/L，酵母膏3 g/L， K風(fēng).3H20 0. 75 g/L，溶劑為水，pH自然，121。C高壓蒸汽滅菌20min。 種子培養(yǎng)基冷卻到28。C后，將克魯斯假絲酵母CICC 1674接種于所述種子 培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min,所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基的接種量以體積計為5%。
發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨5 g/L,酵母膏6 g/L， K2HP04. 3H20 0. 75 g/L， MgS04. 7 H20 0.5 g/L， NH4C1 0.5 g/L，溶劑為水， pH自然，12rC高壓蒸汽滅菌20min。發(fā)酵過程溫度控制在28'C ，發(fā)酵時間 18h時加入L-苯丙氨酸6g/L，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化68h結(jié)束。
發(fā)酵液中2-苯乙醇的高效液相色譜法(HPLC)分析將待測發(fā)酵液樣 品進(jìn)行離心，5000r/min，離心后的上清液再用0. 45^微孔濾膜過濾處理， 濾液立即上RP-HPLC分析，色譜柱為C18柱(Dikma Diamonsi 1C18, 250mmx4. 6咖，5薩)，DAD檢測器，檢測波長260nm,柱溫30。C，流動相為甲 醇水=60 : 40 (v/v),流動相流速lmL/min,進(jìn)樣1(^L,外標(biāo)法定量。 經(jīng)過HPLC分析，上述條件下生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙醇的濃度為2.56g/L。固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化按照實施例l所述種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法， 在發(fā)酵培養(yǎng)18h時加入L-苯丙氨酸4. 5g/L，經(jīng)過2'0h后，采用所述HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為2.48g/L,在50ml的發(fā)酵液中加入樹脂 HZ816 (購于上海華震樹脂公司)1. 50g，樹脂HZ816預(yù)先在8(TC濕熱滅菌， 加入樹脂過程在超凈操作臺上完成。發(fā)酵搖瓶加入樹脂HZ816后，繼續(xù)在 搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速160r/min， 0. 5h后取樣,采用所述HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.63g/L，再向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯丙氨 酸4.5g/L，經(jīng)過26h后，釆用所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為 2. 53g/L。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇解吸釆用0. 3mm的篩網(wǎng)對50ml發(fā)酵液進(jìn)行 過濾，將樹脂HZ816濾出，再以去離子水洗滌2次，將獲得的樹脂HZ816 抽濾，得到的樹脂重量為1.56g，將所述樹脂加入到裝有50ml無水乙醇的 搖瓶中振搖解吸，振搖速度50r/min,時間2h。振搖結(jié)束后，采用所述HPLC 分析解吸液中2-苯乙醇濃度為2.69g/L。對上述樹脂濾出，再加入到裝有 50ml無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，振搖速度50r/min，時間2h。振搖結(jié)束 后，釆用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇濃度為0.41g/L。本實施例1中 L-苯丙氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為84. 5%。
本發(fā)明實施例2的酵母菌為克魯斯假絲酵母(ib7/"/ 保藏 于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC 1674，該酵母菌培養(yǎng) 溫度28 3(TC,為高溫生香酵母。
種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L，麥芽汁3g/L,蛋白胨5g/L，酵母膏3 g/L，K2HP04. 3H20 0. 75 g/L，溶劑為水，pH自然，12TC高壓蒸汽滅菌20min。 種子培養(yǎng)基冷卻到28'C后，將克魯斯假絲酵母CICC 1674接種于所述種子 培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速15Qr/min,所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基的接種量以體積計為5%。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖30g/L,蛋白胨3 g/L，酵母膏8 g/L， K2HP04. 3H20 0. 75 g/L， MgS04. 7 H20 0. 5 g/L， N仏C1 0. 3 g/L，溶劑為水， pH自然，12rC高壓蒸汽滅菌20min。發(fā)酵過程溫度控制在28'C ，發(fā)酵時間 18h時加入L-苯丙氨酸6g/L，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化62h結(jié)束。
按實施例1中發(fā)酵液中2-苯乙醇的高效液相色譜法(HPLC)分析，上 述條件下生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙醇的濃度為2. 47g/L。
固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化按照實施例2所述種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法， 在發(fā)酵培養(yǎng)20h時加入L-苯丙氨酸5.0g/L,經(jīng)過22h后，采用所述HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為2. 31g/L,在50ml的發(fā)酵液中加入活性炭 769型(購于上?；钚蕴繌S有限公司)0. 75g 0. 75g,活性炭預(yù)先在160°C 干熱處理，搖瓶加入活性炭過程在超凈搡作臺上完成。發(fā)酵搖瓶加入活性 炭后，繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min， 0.5h后取樣， 采用所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.47g/L，再向發(fā)酵搖瓶中 加入L-苯丙氨酸5. Og/L，經(jīng)過30h后，釆用所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯 乙醇濃度為2.23g/L。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇解吸釆用0. 4mm的篩網(wǎng)對50ral發(fā)酵液進(jìn)行 過濾，將活性炭濾出，再以去離子水洗滌3次，將獲得的活性炭抽濾，得 到的樹脂重量為0.83g，將所述樹脂加入到裝有50ml無水乙醇的搖瓶中振 搖解吸，振搖速度75r/min，時間2h。振搖結(jié)束后，采用所述HPLC分析解 吸液中2-苯乙醇濃度為3.82g/L。將上述活性炭濾出，再加入到裝有50ml 無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，振搖速度75r/min，時間2h。振搖結(jié)束后， 釆用所述HPLC分析解吸液中2-苯乙醇濃度為0. 53g/L。本實施例2中L-苯丙氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為88. 9%。
實施例3
本發(fā)明實施例3中選擇的酵母菌為釀酒酵母(&cc/iaramyces cerev/s/ae) 保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC 1394，該酵母菌培養(yǎng)溫度28 30'C，主要用于釀造葡萄酒(玫魂香)。
種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，豆芽汁5g/L，蛋白胨4g/L,酵母膏3 g/L， K風(fēng).3H20 0. 75 g/L，溶劑為水，pH自然，121。C高壓蒸汽滅菌20min。 種子培養(yǎng)基冷卻到28'C后，將釀酒酵母CICC 1394接種于所述種子培養(yǎng)基， 搖床培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的接種 量以體積計為5%。
發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨3 g/L，酵母膏8 g/L， K2HP04. 3H20 0. 75 g/L, MgS04. 7 H20 0.5 g/L， NH4C1 0.3 g/L，溶劑為水， pH自然，12rC高壓蒸汽滅菌20min。發(fā)酵過程溫度控制在28°C，發(fā)酵時間 18h時加入L-苯丙氨酸8g/L，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化60h結(jié)束。
按實施例1中發(fā)酵液中2-苯乙醇的高效液相色譜法(HPLC)分析，上 述條件下生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙醇的濃度為3.46g/L。
固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化按照實施例3所述種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法， 在發(fā)酵培養(yǎng)20h時加入L-苯丙氨酸6， Og/L，經(jīng)過20h后，釆用所述HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為2.77g/L，在50ml的發(fā)酵液中加入人造沸 石(購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)2. Og,人造沸石預(yù)先121'C高溫滅菌， 搖瓶加入人造沸石過程在超凈操作臺上完成。發(fā)酵搖瓶加入人造沸石后， 繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min， l.Oh后取樣，釆用 所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.83g/L，再向發(fā)酵搖瓶中加入 L-苯丙氨酸5.0g/L，經(jīng)過14h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為 2. 36g/L。在按上述操作加入人造沸石2. Og，繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化， 發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min， 1. Oh后取樣，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃 度為0.57g/L,再向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯丙氨酸3. Og/L，經(jīng)過"h后，HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為2. 27g/L。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇解吸采用0. 3mm的篩網(wǎng)對50ml發(fā)酵液進(jìn)行 過濾，將人造沸石濾出，再以去離子水洗滌3次，將獲得的人造沸石抽濾， 得到的人造沸石重量為4. 33g，將所述樹脂加入到裝有100ml無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，振搖速度100r/min,時間3h。振搖結(jié)東后，釆用HPLC分 析解吸液中2-苯乙醇濃度為2.54g/L。將上述人造沸石濾出，再加入到裝 有50ml無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，振搖速度100r/min，時間3h。振搖 結(jié)束后，采用HPLC分析解吸液中2-苯乙醇濃度為0.71g/L。本實施例3中 L-苯丙氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為77. 8%。
實施例4
本發(fā)明實施例4中選擇的酵母菌為馬克斯克魯維酵母(^/"yvmw^c^ m"a/am^)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號2.1978， 該酵母菌培養(yǎng)溫度25'C。
種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L，麥芽汁4g/L,蛋白胨3g/L,酵母膏3 g/L, K風(fēng).3H20 0. 75 g/L，溶劑為水，pH自然，121。C高壓蒸汽滅菌20min。 種子培養(yǎng)基冷卻到25'C后，將馬克斯克魯維酵母2. 1978接種于所述種子培 養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 的接種量以體積計為5%。
發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨3 g/L,酵母膏8 g/L， K2HP04. 3H20 0.75 g/L， MgS04. 7 H20 0. 5 g/L， NH4C1 0.3 g/L,溶劑為水， pH自然，12rC高壓蒸汽滅菌20min。發(fā)酵過程溫度控制在25°C,發(fā)酵時間 20h時加入L-苯丙氨酸8g/L，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵轉(zhuǎn)化64h結(jié)束。
按實施例1中發(fā)酵液中2-苯乙醇的高效液相色譜法(HPLC)分析，上 述條件下生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙醇的濃度為3. 52g/L。
固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化按照實施例4所述種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法， 在發(fā)酵培養(yǎng)20h時加入L-苯丙氨酸6. Og/L,經(jīng)過20h后，采用所述HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為2. 95g/L，在50ml的發(fā)酵液中加入樹脂 AB-8 (購于天津南開大學(xué)化工廠)2. Og，樹脂預(yù)先預(yù)先在8(TC濕熱滅菌， 搖瓶加入樹脂AB-8過程在超凈搡作臺上完成。發(fā)酵搖瓶加入樹脂AB-8后， 繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速250r/min， 1. Oh后取樣，釆用
13HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.91g/L，再向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯 丙氨酸5.0g/L，經(jīng)過15h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為2. 29g/L。 在按上述操作加入樹脂2. Og，繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速 250r/min， l.Oh后取樣，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0. 57g/L, 再向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯丙氨酸3.0g/L，經(jīng)過16h后，HPLC分析發(fā)酵液中 2-苯乙醇濃度為2. 30g/L。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇解吸采用0. 3mm的篩網(wǎng)對50ml發(fā)酵液進(jìn)行 過濾，將樹脂AB-8濾出，再以去離子水洗滌2次，將獲得的樹脂抽濾，得 到的樹脂重量為4.12g，將所述樹脂加入到裝有100111195%乙醇的搖瓶中振 搖解吸，振搖速度100r/min，時間3h。振搖結(jié)束后，釆用HPLC分析解吸 液中2-苯乙醇濃度為2.83g/L。將上述樹脂濾出，再加入到裝有50ml95 /fl 乙醇的搖瓶中振搖解吸，振搖速度100r/min，時間3h。振搖結(jié)束后，釆用 HPLC分析解吸液中2-苯乙醇濃度為0. 42g/L。本實施例4中L-苯丙氨酸發(fā) 酵轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為80. 9%。
實施例5
本發(fā)明實例5中選擇的酵母菌為高活性干酵母粉(耐高糖型，湖北安 琪酵母股份有限公司生產(chǎn))。
發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨4 g/L,酵母膏6 g/L， K2HP04. 3H20 0. 5 g/L， MgS04. 7 H20 0. 5 g/L，溶劑為水，pH自然，121。C 高壓蒸汽滅菌20min?；钚越湍阜鄣慕尤氚l(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為1.0%,發(fā) 酵過程溫度控制在35。C，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速220r/min，發(fā)酵時間2h后，加入 L-苯丙氨酸8g/L，發(fā)酵轉(zhuǎn)化56h結(jié)東。
按實施例1中發(fā)酵液中2-苯乙醇的高效液相色譜法(HPLC)分析，上 述條件下生物轉(zhuǎn)化天然2-苯乙醇的濃度為2. 26g/L。
固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化按照實施例4所述種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法， 在發(fā)酵培養(yǎng)2h后加入L-苯丙氨酸10g/L,經(jīng)過Mh后，采用所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為1.93g/L，在50ml的發(fā)酵液中加入樹脂HZ816 (購于上海華震樹脂公司)1.5g,樹脂預(yù)先釆用紫外照射滅菌，照射時間 lh，搖瓶加入樹脂過程在超凈操作臺上完成。發(fā)酵搖瓶加入樹脂后，繼續(xù) 在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速220i7min， l.Oh后取樣，采用HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.42g/L，再向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯丙氨 酸3.0g/L,經(jīng)過12h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為1. 76g/L。再
按上述操作加入樹脂l.Og，繼續(xù)在搖床上進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速 220r/min， l.Oh后取樣，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0. 37g/L， 向發(fā)酵搖瓶中加入L-苯丙氨酸2.0g/L,經(jīng)過16h后，HPLC分析發(fā)酵液中 2-苯乙醇濃度為2. 01g/L。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇解吸釆用0. 3腿的條網(wǎng)對50ml發(fā)酵液進(jìn)行 過濾，將樹脂濾出，再以去離子水洗滌2次，將獲得的樹脂抽濾，得到的 樹脂重量為4. 12g，將所述樹脂加入到裝有50ml無水乙醇的搖瓶中振搖解 吸，振搖速度100r/min,時間3h。振搖結(jié)束后，采用HPLC分析解吸液中 2-苯乙醇濃度為2.65g/L。將上述樹脂濾出，再加入到裝有50ml無水乙醇 的搖瓶中振搖解吸，振搖速度100r/min，時間3h。振搖結(jié)束后，釆用HPLC 分析解吸液中2-苯乙醇濃度為0.44g/L。本實施例5中L-苯丙氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn) 化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為76. 6%。
實施例6
本發(fā)明實施例6中選擇的酵母菌為釀酒酵母CSacc/^raw7c" ce v^/ae) 保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC 1394,該酵母菌 培養(yǎng)溫度28 30'C，主要用于釀造葡萄酒(玫瑰香)。
種子培養(yǎng)基和種子液培養(yǎng)方法按實施例4，所述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基的接種量以體積計為5%。
發(fā)酵罐培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L， K2HP04. 3H20 0. 75 g/L， MgS04. 7 H20 0.5 g/L， NH4C1 0.3 g/L，溶劑為水，pH自然，將所述3. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐(NBS BI0FL0 3000 )中，121。C高壓蒸 汽滅菌20min。發(fā)酵過程溫度控制在3(TC，酵母菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)20h后， 第一次加入L-苯丙氨酸4.5g/L,發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量按照通 氣速率比發(fā)酵液體積為1.25V/V min。
固液兩相體系發(fā)酵轉(zhuǎn)化在所述第一次加入L-苯丙氨酸4.5g/L,經(jīng)過 6.5h后，釆用所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為2. 51g/L， 2-苯乙 醇的合成速率0.39 g.r.h-1,在發(fā)酵液中第一次加入樹脂HZ816 (購于上 海華震樹脂公司)85g，樹脂預(yù)先8(TC濕熱滅菌。發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速升至350r/min, lh后取樣，按實施例1中所述HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為 0.42g/L，向發(fā)酵罐中第二次加入L-苯丙氨酸4. Og/L，經(jīng)過7h后，HPLC分 析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為2.64g/L。向發(fā)酵罐中第二次加入樹脂90g， lh 后取樣，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.61g/L，再向發(fā)酵罐中第 三次加入L-苯丙氨酸4. Og/L,經(jīng)過8h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃 度為2.47g/L。向發(fā)酵罐中第三次加入樹脂85g， lh后取樣，HPLC分析發(fā) 酵液中2-苯乙醇的濃度為0.53g/L，再向發(fā)酵罐中第四次加入L-苯丙氨酸 3.5g/L,發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速升至400r/min,經(jīng)過8h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯 乙醇濃度為2.19g/L。向發(fā)酵罐中第四次加入樹脂75g， lh后取樣,HPLC 分析發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度為0.65g/L，再向發(fā)酵罐中第五次加入L-苯 丙氨酸3. Og/L，經(jīng)過15h后，HPLC分析發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度為2. 33g/L， 停止發(fā)酵。
固相吸附介質(zhì)的2-苯乙醇洗脫采用0. 3mm的篩網(wǎng)對發(fā)酵液進(jìn)行過濾， 將樹脂濾出，再以去離子水洗滌3次，將獲得的樹脂抽濾，得到的樹脂重 量為368. 9g。將所述樹脂裝柱，柱內(nèi)徑3.5cm,柱高65cm,柱體積580ml。 采用無水乙醇洗脫，流速2.0ml/min,當(dāng)無水乙醇洗脫收集液為2. 6L時， 取柱下端流出液樣進(jìn)行HPLC分析，2-苯乙醇的濃度為0. 16g/L,結(jié)束洗脫。 將所述收集的2.6L洗脫液搖勻，取樣進(jìn)行HPLC分析，洗脫液2_苯乙醇的 濃度為13.23g/L，換算為發(fā)酵液2-苯乙醇的終濃度為12. 16g/L，本實施 例6中L-苯丙氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇的總摩爾轉(zhuǎn)率為86. 5%。實施例7
2-苯乙醇洗脫液的蒸餾方法本發(fā)明實施例6中收集到的2.6L洗脫液 進(jìn)行常壓蒸餾，蒸餾溫度80X:,將所述洗脫液蒸餾濃縮到約500ml時，蒸 餾瓶內(nèi)壁可見少量粘稠物附著，將濃縮液轉(zhuǎn)入另外一個2L燒瓶中，取樣按 本發(fā)明實施例1的方法進(jìn)行HPLC分析，2-苯乙醇濃度為63.78g/L,繼續(xù)常 壓蒸餾，直到蒸餾塔頂溫度達(dá)到95'C，停止常壓蒸餾。將所述常壓蒸餾殘 留液76ml進(jìn)行下一步的減壓蒸餾，釆用油泵對蒸餾釜內(nèi)抽真空，蒸餾溫度 從80'C緩慢升溫，到130'C基本粗蒸完畢，獲得蒸餾粗品液A為51ml，釆 用HPLC分析蒸餾粗品中2-苯乙醇濃度為618. 39g/L，所述蒸餾粗品液A準(zhǔn) 備進(jìn)行精餾操作。
發(fā)酵液水相中2-苯乙醇的吸附與解吸將實施例6通過0. 3mm的篩網(wǎng) 的3. 5L發(fā)酵液進(jìn)行離心，3500r/min離心20min，去除菌體，加入80g樹 脂HZ816,攪拌吸附lh，溫度25°C,再釆用0. 3mm的篩網(wǎng)過濾出樹脂HZ816, 以去離子水洗滌2次，將樹脂抽濾，獲得濕樹脂86.1g。向所述86.1g濕樹 脂中第一次加入2倍重量的95%乙醇，攪拌解吸，解吸溫度35'C，時間lh， 結(jié)束后抽濾出樹脂，樹脂重量為82.9g，釆用HPLC分析解吸液樣品的2-苯 乙醇濃度為17. 89g/L。向所述82. 9g濕樹脂中第二次加入2倍重量的95% 乙醇，攪拌解吸，解吸溫度35'C，時間lh,結(jié)束后抽濾出樹脂，樹脂重量 為81.2g，釆用HPLC分析解吸液樣品的2-苯乙醇濃度為10.73g/L。向所述 81. 2g濕樹脂中第三次加入1倍重量的95%乙醇，攪拌解吸，解吸溫度35 。C，時間lh,結(jié)束后抽濾出樹脂，樹脂重量為80.7g，釆用HPLC分析解吸 液樣品的2-苯乙醇濃度為4.81g/L。將上述三次解吸液合并，準(zhǔn)備蒸餾。
按本實施例2-苯乙醇洗脫液的蒸餾方法，對上述三次解吸液進(jìn)行蒸餾， 獲得蒸餾粗品液B為23ml,釆用HPLC分析蒸餾粗品中2-苯乙醇濃度為 232. 18g/L，將本實施例中所述蒸餾粗品液A和蒸餾粗品液B合并，準(zhǔn)備進(jìn)
行精餾操作。
2-苯乙醇?xì)庀喾治雠c質(zhì)譜分析釆用氣相質(zhì)譜7890A (美國安捷倫科技
17有限公司)對蒸餾粗品分析，分析條件為柱溫32°C—240°C (10min)、 10°C/min，分流比50:1,進(jìn)樣量0. 2pL，溶劑延遲3 min,掃描參數(shù)20-450amu， El源70ev，進(jìn)樣口溫度250。C，離子源溫度230。C， MS四級桿溫度150°C， 柱流量lmL/min。采用所述氣相質(zhì)譜分析，產(chǎn)品純度98. 6% (附圖2 )，確定 產(chǎn)物分子量為122.1 (附圖3),產(chǎn)物分子量與2-苯乙醇完全相同。
產(chǎn)品精僧與產(chǎn)品純度將待精餾粗品進(jìn)料后，油泵預(yù)真空，先將表壓 力降至-0.05MPa以下，緩慢升高蒸餾釜溫度，先將粗品中少量水蒸出，連 續(xù)抽真空，壓力可至-0. 09脂Pa，收集115。C餾分。，按所述氣相分析方法， 產(chǎn)品純度99. 3%。
所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所 作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.天然香料2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟選取克魯斯假絲酵母(krusei Candida)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)中的一種酵母菌，接入種子培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)制備成種子液，將所述種子液或活性干酵母粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)的L-苯丙氨酸為底物，在發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行液體好氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵液加入固相吸附介質(zhì)、L-苯丙氨酸和葡萄糖，發(fā)酵過程溫度控制在25～37℃，轉(zhuǎn)化18～72h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后采用過濾或離心方式獲得固相吸附介質(zhì)，再采用洗脫溶劑對所述固相吸附介質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)一步蒸餾得到天然2-苯乙醇，其中，所述的L-苯丙氨酸加入濃度以發(fā)酵液體積計為5～30g/L，所述的固相吸附介質(zhì)包括活性炭、人造沸石、大孔吸附樹脂或纖維素，所述的洗脫溶劑為無水乙醇或95％乙醇。
2. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所 述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10~30g/L，麥芽汁3 5g/L，豆芽汁2~5 g/L,蛋白胨4~6 g/L，酵母膏2~5 g/L， K風(fēng).3H20 0. 5 — 1.5 g/L， 溶劑為水，PH自然。
3. 如權(quán)利要求1所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所 述種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量以體積計為3~12%，所述活性干酵母 粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基按重量計為0. 2 ~ 3. 0%。
4. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所 述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖20~ 200g/L，蛋白胨3~25g/L,酵母膏2~ 20 g/L， K2HP04.3H20 0.5 - 1. 5 g/L， MgS04. 7 H20 0. 3 ~ 2. 0 g/L， NH4C1 0.5-1.5 g/L,溶劑為水，pH自然。
5. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所 述固相吸附介質(zhì)的用量與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量與體積比為0. 01 ~ 0. 15: 1。
6. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所述固相吸附介質(zhì)在使用前進(jìn)行滅菌，其滅菌方式為紫外滅菌、60 12rC濕 熱滅菌或150 20(TC高溫干熱滅菌，滅菌時間10~120min。
7. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所 述好氧培養(yǎng)過程，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速lQQ~30Qr/min,發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100 ~ 800r/min，通氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為0. 3 ~ 1. 5V/V . min。
8. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于整 個發(fā)酵過程控制發(fā)酵培養(yǎng)基水相中2-苯乙醇的濃度小于3. 5g/L， L-苯丙氨 酸的濃度大于1. 0 g/L，葡萄糖的濃度0. 5 ~ 30. 0 g/L。
9. 如權(quán)利要求l所述天然香料2-苯乙醇的制備方法，其特征在于洗 脫液蒸餾的溫度為78~160'C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然香料2-苯乙醇的制備方法，通過選擇克魯斯假絲酵母、釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母，經(jīng)培養(yǎng)制備成的種子液或活性干酵母粉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)的L-苯丙氨酸為底物，在發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行液體好氧發(fā)酵，再在發(fā)酵過程中加入固相吸附介質(zhì)、L-苯丙氨酸和葡萄糖，發(fā)酵結(jié)束后以過濾或離心方式獲得固相吸附介質(zhì)，再采用洗脫溶劑對吸附介質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)一步蒸餾得到純度為97.5％～99.5％的天然2-苯乙醇。本發(fā)明將2-苯乙醇的發(fā)酵與吸附分離結(jié)合在一起，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品香氣品質(zhì)優(yōu)良。
文檔編號C12P7/22GK101608190SQ200910054988
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者付艷麗, 濤 王, 榮紹豐, 蔡寶國 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院