專利名稱：一種生產(chǎn)重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組高活性錳超氧化 物歧化酶的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金 屬酶，能夠保護(hù)需氧細(xì)胞免受正常代謝過程中產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, R0S)的毒害，其主要催化下列反應(yīng)202__+2H+ — H202+02, H2O2隨后被過氧化氫酶(CATs)和 過氧化物酶清除。SOD家族有多種同功酶，按分子所含金屬輔基的不同，可將其分為銅鋅超氧化物歧 化酶(Cu，Ζη-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧 化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, EC-S0D)四類，這四類 SOD 都催化同 一種催化反應(yīng)。由于不同類型的SOD在一級結(jié)構(gòu)上無同源性，它們之間的理化特性及穩(wěn)定 性差別很大，不同種屬不同組織來源的同種SOD也略有差別。錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn_S0D)是哺乳動物的三 種超氧化物歧化酶之一，位于線粒體內(nèi)，對維持胞內(nèi)ROS平衡具有重要的作用。ROS對多種 生理過程的調(diào)節(jié)具有重要作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、分化和衰老。ROS不僅和多種病理狀態(tài) 的病因有關(guān)，而且參與腫瘤的形成過程。Mn-SOD可以從動物血提取，但由于存在動物源性的問題，在應(yīng)用的過程中可能會 存在免疫原性，同時動物源性還可能帶入其它污染，存在不安全問題。所以，利用基因工程 技術(shù)進(jìn)行人Mn-SOD的生產(chǎn)是一種可行且便捷的方法?；蚬こ蘉n-SOD的生產(chǎn)存在的問題 之一是由于誘導(dǎo)后的過量表達(dá)來不及正確折疊形成不溶性的包涵體，需要進(jìn)一步的變性、 復(fù)性才有可能獲得活性Mn-SOD，另外，即使是可溶性表達(dá)，也普遍存在活性不高的問題，這 也是由于其折疊過程的不正確造成的。因此，本領(lǐng)域需要進(jìn)一步研究開發(fā)獲得高活性Mn-SOD的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達(dá)的錳超氧化物歧化酶的細(xì) 胞(細(xì)胞培養(yǎng)物)；(2)破碎步驟(1)獲得的細(xì)胞，離心獲取上清；(3)將步驟(2)獲得的上清進(jìn)行熱變性，熱變性溫度為75士2°C，熱變性時間為 10 士 5分鐘；熱變性后冷卻，離心(優(yōu)選離心10 士 2分鐘)獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。
在一個優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用超聲破碎細(xì)胞在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)錳超氧化物歧化酶。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，熱變性溫度為75士2°C (優(yōu)選75士 1°C，更優(yōu)選 750C )，熱變性時間為10士2分鐘(優(yōu)選10士 1分鐘；更優(yōu)選10分鐘)。在另一優(yōu)選例中，所述的熱變性在水浴中進(jìn)行。在另一優(yōu)選例中，熱變性后冷卻至0_4°C (優(yōu)選0°C )。在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中，采用DEAE-FF陰離子交換樹脂進(jìn)行純化。在另一優(yōu)選例中，所述的錳超氧化物歧化酶是人錳超氧化物歧化酶。在另一優(yōu)選例中，步驟(5)中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子(Mn2+)為 1 (5-100)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。在另一優(yōu)選例中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (10-30)在純化 的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。更優(yōu)選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 20在純化的錳超氧化物 歧化酶中加入錳離子。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1A、粗酶液的比活與熱變性時間的關(guān)系。圖1B、總的酶活與熱變性時間的關(guān)系。圖2、可溶性表達(dá)的rhMn-SOD的純化。
具體實施例方式為了得到高活性的重組錳超氧化物歧化酶，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開發(fā)了一 種生產(chǎn)重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法在重組可溶性表達(dá)錳超氧化物歧化 酶后，將細(xì)胞上清進(jìn)行熱變性，之后純化經(jīng)過熱變性的蛋白溶液，純化產(chǎn)物用適當(dāng)濃度的錳 離子進(jìn)行激活。所述方法可獲得高活性的錳超氧化物歧化酶。本發(fā)明的生產(chǎn)重組活性錳超氧化物歧化酶的方法，即從可溶性表達(dá)的無活性或者 低活性的脫輔基超氧化物歧化酶通過體外處理獲得活性錳超氧化物歧化酶的方法，體外處 理的方法為在適當(dāng)條件下加入適量的輔基-錳離子；適當(dāng)?shù)臈l件還包括適量輔基的加入后 轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚藻i超氧化物歧化酶的條件。如本文所用，術(shù)語“錳超氧化物歧化酶”、"Mn-S0D'\ "MnSOD“可互換使用。如本文所用，術(shù)語“重組人錳超氧化物歧化酶”、“rhMn-SOD”、“重組人Mn-SOD”可
互換使用，都指來源于人的經(jīng)基因工程手段重組表達(dá)獲得的錳超氧化物歧化酶。如本文所用，術(shù)語“具有酶活性”指具有天然存在的錳超氧化物歧化酶的生物活 性。天然存在的錳超氧化物歧化酶的生物活性例如指其抑制連苯三酚自氧化的活性。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達(dá)的錳超氧化物歧化酶的細(xì) 胞；
(2)破碎步驟(1)獲得的細(xì)胞，離心獲取上清；(3)將步驟⑵獲得的上清進(jìn)行熱變性，熱變性溫度為75士2°C，熱變性時間為 10 士 5分鐘；熱變性后冷卻，離心獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶?？捎糜诒景l(fā)明方法的錳超氧化物歧化酶沒有特別限制，可以是來源于任何物種的 錳超氧化物歧化酶。一種優(yōu)選的錳超氧化物歧化酶是來源于人的錳超氧化物歧化酶。用于本發(fā)明的錳超氧化物歧化酶是重組表達(dá)的錳超氧化物歧化酶。重組錳超氧化 物歧化酶表示通過重組體DNA方法和其他人工方法制備的重組多肽，它具有與任何天然存 在的錳超氧化物歧化酶相同的或基本上相同的氨基酸序列。眾所周知，根據(jù)已公開的錳超氧化物歧化酶序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過PCR 擴(kuò)增等方法制備錳超氧化物歧化酶的編碼序列，然后將其插入表達(dá)載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化常見的 宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)，就可以表達(dá)重組錳超氧化物歧化酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中， 通過IPTG誘導(dǎo)使得大腸桿菌表達(dá)可溶性的錳超氧化物歧化酶，然后回收該錳超氧化物歧化酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。優(yōu)選的表達(dá)載體宜包括在宿主細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)克隆的基因所必需的調(diào)節(jié)元件，定位在編碼錳超氧化物歧化酶的核酸附近，以便 影響其表達(dá)。優(yōu)選的細(xì)菌寄主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，一種合適的大腸桿菌的例子是常見的 大腸桿菌BL21(DE3)。對于表達(dá)重組錳超氧化物歧化酶的大腸桿菌，通過本領(lǐng)域人員常用的破細(xì)胞手段 (如珠磨法破碎、液氮研磨破碎、壓力杯法破碎、超聲破碎等)，可以獲得可溶性的重組錳超 氧化物歧化酶。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用超聲破碎細(xì)胞可以獲得良好的細(xì)胞破碎效果。破碎細(xì)胞后獲得的可溶性蛋白中通常同時還包含其它雜蛋白，需要通過適當(dāng)?shù)姆?法來去除雜蛋白而保留可溶性的重組錳超氧化物歧化酶。去除雜蛋白的方法在本領(lǐng)域中是 多種多樣的，本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究后，意外地發(fā)現(xiàn)采用熱變性方法來去除雜蛋白可以獲 得良好的效果，不僅使得雜蛋白盡可能多地被去除，而且對于重組錳超氧化物歧化酶的損 害最低，從而為后續(xù)獲得高活性的重組錳超氧化物歧化酶提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，不 經(jīng)過熱變性步驟去除雜蛋白而直接進(jìn)行純化，純化效果不好，且得到的錳超氧化物歧化酶 的活性也不夠理想。熱變性的溫度也是較為關(guān)鍵的因素，溫度太高可能會影響到酶活性，而溫度過低 可能不足以分離去除(沉淀)雜蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，熱變性溫度為75士2°C;更 優(yōu)選75士 1°C，最優(yōu)選75°C，在所述溫度下進(jìn)行熱變性，非但不會明顯降低重組錳超氧化物 歧化酶的酶活性，而且還能夠盡可能多地去除雜蛋白。熱變性的時間是另一較為關(guān)鍵的因素，時間過長會對酶活性造成不可逆轉(zhuǎn)的影 響，而時間過短可能不足以分離去除(沉淀)雜蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，熱變性時間 為10士2分鐘，更優(yōu)選10士 1分鐘；最優(yōu)選10分鐘。熱變性的實施可采用本領(lǐng)域常用的加熱技術(shù)，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的熱 變性在水浴中進(jìn)行，水浴提供了均勻且溫和的條件，從而有利于保留重組錳超氧化物歧化 酶的酶活性。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，熱變性后立即將重組錳超氧化物歧化酶的酶液冷卻，從 而有利于較多地沉淀掉雜蛋白。優(yōu)選地，將酶液冷卻至0-4°C (優(yōu)選0°C)。經(jīng)歷熱變性后的酶液可進(jìn)一步進(jìn)行純化。一種優(yōu)選的純化方法為陰離子樹脂吸附 法；優(yōu)選的陰離子樹脂包括DEAE陰離子交換樹脂(如DEAE-FF陰離子交換樹脂)；優(yōu)選的 純化方法包括連續(xù)NaCl梯度洗脫；優(yōu)選的NaCl洗脫的濃度范圍為0-0. 5M。獲得純化的重組錳超氧化物歧化酶后，需要對該酶進(jìn)行激活以得到活化的重組錳 超氧化物歧化酶，用于激活的錳離子濃度的高低也可影響到其酶活性的高低。作為本發(fā)明 的優(yōu)選方式， 按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (5-100)在純化的錳超氧化物 歧化酶中加入錳離子；更優(yōu)選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (10-30)在 純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子；最優(yōu)選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離 子為1 20在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、重組人Mn-SOD的可溶性表達(dá)設(shè)計以下引物正向5-GACATATGAAGCACAGCCTCCCCGACC-3，(SEQID NO 1)；反向5，-GCAAGCTTGCATAACGATCGTGGTTTAC-3，(SEQID NO :2)。以人胎盤cDNA(購自Invitrogen)為模板，用前述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得人 Mn-SOD的編碼序列。前述獲得的序列用Ndel/Hindlll酶切后插入到pET28a表達(dá)載體(購自 Invitrogen)的相應(yīng)位點中，測序鑒定獲得正確插入的重組表達(dá)載體。將該重組表達(dá)載體常 規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落，接種至30mL LB培養(yǎng)液中(含100 μ g/mLAmp)， 置于37°C搖床過夜培養(yǎng)(10 12h)后，以2%接種量轉(zhuǎn)入二級瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。菌密度 至0D6000. 5 0. 6時，于37°C和12 °C下分別加入終濃度0. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時， IOOOOrpm離心收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心后獲得上清表達(dá)的重組人Mn_S0D。實施例2、上清中加入不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用前述獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行超聲破碎，離心后收集上清，其中含有可溶性的重組 人Mn-SOD以及其它雜蛋白。在獲得的含有可溶性的重組人Mn-SOD (rhMn-SOD)的上清中加入不同濃度的Mn2+， 觀察不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用。結(jié)果見表1。rhMn-SOD活性的測定方法采用微量連苯三酚法。酶活性定義如下25°C時，Iml反 應(yīng)液中每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量為一個活性單位。
rhMn-SOD比活性的測定定義為每mg蛋白所含的酶活力單位數(shù)。單位為U/mg。表 1
rhMn-SOD 活 性(U/ml)蛋白含量 (mg/ml)比活提高倍數(shù)上清1602.369.61Mn2+濃 度(mM)0.110062.3437.46.3112102.3526.17.61010902.3473.96.8可見，當(dāng)Mn2+濃度為ImM時，rhMn-SOD活性最高。實施例3、熱變性方法除上清中雜蛋白前述獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行超聲破碎，離心后收集上清，得到粗酶液。超聲破碎菌體后所得的粗酶液分別在60、65、70、75、80°C水浴條件下，熱變性5、 10、15、20min，熱變性后立即浸入水中(水溫0°C )冷卻，離心lOmin，取上清酶液，測定比 活。獲得的比活測定結(jié)果見圖1A?？梢?，75°C IOmin的熱變性效果是最佳的，上清中比活提高2. 5倍，而此時總的酶 活也沒有明顯降低，見圖1B。因此，確定75°C IOmin為rhMn-SOD粗酶液熱變性條件。實施例4、上清中脫輔基rhMn-SOD的純化脫輔基是指分子中不含有輔因子Mn的SOD蛋白，該實施例中脫輔基的rhMn-SOD 通過在培養(yǎng)誘導(dǎo)過程中不加入輔因子Mn而獲得。用2 X 15cm層析柱，DEAE-FF陰離子交換柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的緩沖 液平衡，然后經(jīng)熱變性處理后的上清液上樣，用相同的緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，用含0 0. 5M NaCl梯度洗脫，分部收集，測定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合并，測總酶 活和總蛋白含量。合并酶活高的收集管，即得純化的活性重組rhMn-SOD?？扇苄员磉_(dá)的rhMn-SOD的純化結(jié)果見圖2。純化后脫輔基重組人Mn-SOD上清中加入不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用見表 2。Mn2+處理在室溫和最適pH條件下(如pH8. 0)進(jìn)行。表2
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權(quán)利要求
一種生產(chǎn)錳超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括(1)重組表達(dá)錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達(dá)的錳超氧化物歧化酶的細(xì)胞；(2)破碎步驟(1)獲得的細(xì)胞，離心獲取上清；(3)將步驟(2)獲得的上清進(jìn)行熱變性，熱變性溫度為75±2℃，熱變性時間為10±5分鐘；熱變性后冷卻，離心獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用超聲破碎細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)錳超氧 化物歧化酶。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，熱變性溫度為75士2°C，熱變性 時間為10士2分鐘。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的熱變性在水浴中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，熱變性后冷卻至0-4°C。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，采用DEAE-FF陰離子交換樹脂 進(jìn)行純化。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的錳超氧化物歧化酶是人錳超氧化物 歧化酶。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，按照摩爾比錳超氧化物歧化 酶錳離子為1 (5-100)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為 1 (10-30)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。所述方法在重組可溶性表達(dá)錳超氧化物歧化酶后，將細(xì)胞上清進(jìn)行熱變性，之后純化經(jīng)過熱變性的蛋白溶液，純化產(chǎn)物用適當(dāng)濃度的錳離子進(jìn)行激活。所述方法可獲得高活性的錳超氧化物歧化酶。
文檔編號C12N9/02GK101955918SQ20091005500
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者吳梧桐, 李素霞, 袁勤生, 陳車生 申請人:華東理工大學(xué)