專利名稱：一種pcna基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個(gè)年度報(bào)告， “認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗”，也就是說癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn) 失敗的幾個(gè)因素是1、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；2、腫瘤細(xì)胞耐藥性；3、抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善 等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致 癌癥死亡率不降的另二個(gè)重要原因是1、不能做到真正的早期診斷；2、轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制不 清楚。依照傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)影像及和其它生化(如蛋白標(biāo)記物)指標(biāo)來診斷癌癥，認(rèn)為占位性 癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時(shí)無癥狀體征)，這一臨床概念值得認(rèn) 真討論。影像醫(yī)學(xué)的2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，從?xì)胞學(xué)角度， 1公分的腫塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個(gè)腫 瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可 能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實(shí)的是在這個(gè)過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和 單獨(dú)的病灶。臨床上已證實(shí)一旦形成腫塊的同時(shí)，其他癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其他 部位克隆生長；一旦切除原發(fā)灶后，其他器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成或轉(zhuǎn)移。因此， 在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶 時(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，這時(shí)已經(jīng)是晚期了，這是導(dǎo)致癌癥死亡率 不降的真正原因。PCNA 人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)基因位 于第20號(hào)染色體，編碼一個(gè)由261個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，即PCNA蛋白，PCNA是一種細(xì) 胞周期調(diào)節(jié)因子，其合成水平反應(yīng)了細(xì)胞增殖率及DNA合成率，并與多種細(xì)胞周期條件因 子密切相關(guān)，是目前腫瘤增殖活動(dòng)研究的可靠指標(biāo)。PCNA主要分布于增殖細(xì)胞、受有絲體 分裂激活轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞以及實(shí)體瘤中有增殖能力的細(xì)胞，而正常細(xì)胞含量很低。有報(bào)道 PCNA指數(shù)(PCNA-LI)與喉癌臨床分期、淋巴管浸潤、腫瘤大小、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)等 相關(guān)，有腫瘤轉(zhuǎn)移的患者PCNA-LI顯著高于無轉(zhuǎn)移者，因而認(rèn)為PCNA-LI是預(yù)測喉癌腫瘤生 長、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后的敏感指標(biāo)。在肝細(xì)胞癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，PCNA-LI與肝細(xì) 胞癌分化、腫瘤大小、門靜脈侵襲和復(fù)發(fā)等有關(guān)，是評(píng)價(jià)惡性程度、預(yù)測復(fù)發(fā)時(shí)間及患者預(yù) 后的有用指標(biāo)。是一個(gè)與腫瘤侵襲深度，器官轉(zhuǎn)移，血管浸潤后腫瘤后期有關(guān)的指數(shù)。胃癌 患者的 PCNA 指數(shù)高。PCNA，NM_0025921355bp, mRNA, 20pter-pl2 "，cds240... 1025bp。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時(shí))就能做到早期預(yù)測診斷。本發(fā)明采用核酸原為雜交技術(shù)檢測PCNA基因的表達(dá)量來診斷臨床各類癌癥早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，有非常重要臨床價(jià)值。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種PCNA基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種PCNA基因的原位雜交檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物 中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌癥是喉癌、肝細(xì)胞癌或胃癌。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種PCNA基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C )
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C )；7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有 顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測PCNA基因異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位 性癌病灶復(fù)發(fā)之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基 因表達(dá)異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個(gè)真正的早期診斷以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早預(yù) 測。這樣才有可能實(shí)施癌癥的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治癌 癥惡疾。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中喉癌轉(zhuǎn)移病人PCNA基因表達(dá)圖片。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移病人PCNA基因表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中胃癌轉(zhuǎn)移病人PCNA基因表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人PCNA基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例1一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和
標(biāo)本組成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護(hù)液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ ,f 2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ ,f 1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體1 μ 1/管1管/盒 無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管;1管/盒 黃色液體
顯色劑B320 μ1/ 管;1管/盒 無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無色透明液體陽性對照標(biāo)本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護(hù)液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0.5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
實(shí)施例2一種PCNA基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對照標(biāo)本兩張(每次 實(shí)驗(yàn)做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽性對照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應(yīng)無色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的PCNA 基因表達(dá)量，用來確定癌癥是否發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，PCNA基因具有廣譜性，因?yàn)镻CNA基因在正常人中表達(dá)低或零表 達(dá)。如果PCNA基因高表達(dá)，說明癌癥已經(jīng)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，從而獲得癌癥的診斷信息。當(dāng) 檢測到PCNA基因的表達(dá)高于正常對照時(shí)，則可預(yù)測受試者為癌癥早期轉(zhuǎn)移或癌癥轉(zhuǎn)移易 感者，這些癌癥包括喉癌、肝細(xì)胞癌或胃癌。本發(fā)明實(shí)施例采樣為喉癌轉(zhuǎn)移病人5名，肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移病人5名，胃癌轉(zhuǎn)移病人 5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果 表示，所有癌癥轉(zhuǎn)移病人PCNA基因有過度表達(dá)，細(xì)胞染色；正常對照組PCNA基因不表達(dá)，細(xì) 胞無染色。具體結(jié)果請見圖1，圖2，圖3和圖4。實(shí)施例3用PCNA基因試劑盒檢測喉癌轉(zhuǎn)移疾病與用CA125基因試劑盒檢測喉癌轉(zhuǎn)移疾病 之間平行實(shí)驗(yàn)。為了科學(xué)評(píng)價(jià)上述基因各自在喉癌轉(zhuǎn)移疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我們用平 行試驗(yàn)的方法，同時(shí)檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一例喉癌 轉(zhuǎn)移疾病患者的外周血，同時(shí)檢測PCNA基因和CA125 (CA125 (腫瘤標(biāo)記物)，NM_024690)基 因的mRNA(進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報(bào)告等均采用實(shí)施例1和實(shí) 施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā)現(xiàn)PCNA基因在喉癌轉(zhuǎn)移疾病病人中 表達(dá)量比CA125基因在同一疾病病人的表達(dá)量要高。結(jié)果表明，PCNA基因?qū)戆┺D(zhuǎn)移疾病 診斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比CA125基因更好，原位雜交基因表達(dá)圖顯示，PCNA基因的 表達(dá)量是70%，CA125基因的表達(dá)量是50%。本發(fā)明的試劑盒作于喉癌轉(zhuǎn)移疾病診斷的指 標(biāo)有非常重要的臨床意義。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1355<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0152]ggatggccggagctggcgccctggttctggaggtaaccggttactgagggcgagaagcgc600153]cacccggaggctctagcctgacaaatgcttgctgacctgggccagagctcttcccttacg1200154]caagtctcagccggtcgtcgcgacgttcgcccgctcgctctgaggctcctgaagccgaaa1800155]ccagctagactttcctccttcccgcctgcctgtagcggcgttgttgccactccgccacca2400156]tgttcgaggcgcgcctggtccagggctccatcctcaagaaggtgttggaggcactcaagg3000157]acctcatcaacgaggcctgctgggatattagctccagcggtgtaaacctgcagagcatgg3600158]actcgtcccacgtctctttggtgcagctcaccctgcggtctgagggcttcgacacctacc4200159]gctgcgaccgcaacctggccatgggcgtgaacctcaccagtatgtccaaaatactaaaat4800160]gcgccggcaatgaagatatcattacactaagggccgaagataacgcggataccttggcgc5400161]tagtatttgaagcaccaaaccaggagaaagtttcagactatgaaatgaagttgatggatt6000162]tagatgttgaacaacttggaattccagaacaggagtacagctgtgtagtaaagatgcctt6600163]ctggtgaatttgcacgtatatgccgagatctcagccatattggagatgctgttgtaattt7200164]cctgtgcaaaagacggagtgaaattttctgcaagtggagaacttggaaatggaaacatta7800165]aattgtcacagacaagtaatgtcgataaagaggaggaagctgttaccatagagatgaatg8400166]aaccagttcaactaacttttgcactgaggtacctgaacttctttacaaaagccactccac9000167]tctcttcaacggtgacactcagtatgtctgcagatgtaccccttgttgtagagtataaaa9600168]ttgcggatatgggacacttaaaatactacttggctcccaagatcgaggatgaagaaggat10200169]cttaggcattcttaaaattcaagaaaataaaactaagctctttgagaactgcttctaaga10800170]tgccagcatatactgaagtcttttctgtcaccaaatttgtacctctaagtacatatgtag11400171]atattgttttctgtaaataacctatttttttctctattctctgcaatttgtttaaagaat12000172]aaagtccaaagtcagatctggtctagttaacctagaagtatttttgtctcttagaaatac12600173]ttgtgatttttataatacaaaagggtcttgactctaaatgcagttttaagaattgttttt13200174]gaatttaaataaagttacttgaatttcaaacatca135權(quán)利要求
一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥是喉癌、肝細(xì)胞癌或胃癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或 非放射性標(biāo)記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述 的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
9.一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
10.一種PCNA基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求9所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件 為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本 或組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PCNA基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種PCNA基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101993922SQ200910056158
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日 公開號(hào)200910056158.X
發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司