專利名稱：一種cd44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說(shuō)關(guān)于一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及 其檢測(cè)方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤 的7-10%，在婦女僅次于子宮癌。它的發(fā)病常與遺傳有關(guān)，以及40-60歲之間，絕經(jīng)期前后 的婦女發(fā)病率較高。僅約1-2%的乳腺患者是男性。通常發(fā)生在乳房腺上皮組織的惡性腫 瘤。是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，乳腺癌從癌前變到形成癌癥，需要幾年時(shí)間，如何做到早期檢測(cè)、診斷、預(yù)后的檢 測(cè)及診治后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期檢出是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。CD44是細(xì)胞因子，在人類原發(fā)性乳腺癌中表達(dá)降低，其它癌癥中也表達(dá)降低。對(duì) CD44的研究時(shí)間較長(zhǎng)、較廣泛也較深入。已知其為分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，主 要參與異質(zhì)性粘附，即腫瘤細(xì)胞與宿主基質(zhì)的粘附，異質(zhì)性粘附在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起 促進(jìn)作用。CD44的目的蛋白主要功能為(1)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與(微循環(huán))毛細(xì)血管后小靜 脈中的高柱狀內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，使淋巴細(xì)胞穿過(guò)血管壁或到淋巴組織；(2)參與淋巴細(xì)胞的 激活過(guò)程；(3)與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、層粘連蛋白等基質(zhì)分子結(jié)合；(4)能與細(xì)胞骨 架蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞偽足形成，并與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi)，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時(shí))就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)檢測(cè)CD44基因，對(duì)乳腺癌基因 水平的早期診斷有非常重要的臨床意義。⑶44基因序列號(hào)NM-000610，5748bp，⑶S :435… 2663。本發(fā)明的原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技 術(shù)結(jié)合起來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原 理是使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ) 核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)， 從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種⑶44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)乳腺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所 述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種⑶44基因的原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C )；
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C )；
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)乳腺癌發(fā)生動(dòng)態(tài)過(guò)程，以及用于乳腺癌預(yù)
防醫(yī)學(xué)的檢測(cè)和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)癌胚蛋白標(biāo)志物，以及 影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測(cè)⑶44異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查 及其它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性乳腺癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊 之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床乳腺癌病患一個(gè)真正的預(yù)后早期 診斷。這樣才有可能實(shí)施乳腺癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治乳腺癌惡疾。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例中乳腺癌癥病人CD44基因表達(dá)圖片。圖2是正常乳腺CD44基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和
標(biāo)本組成如下
消化液100iil/管1管/盒無(wú)色透明液體
保護(hù)液100iil/管1管/盒無(wú)色透明液體
預(yù)雜交液1300u 1/ ,r 2管/盒無(wú)色透明液體
正義雜交液lOiU/管1管/盒無(wú)色透明液體
反義雜交液lOyi/管1管/盒無(wú)色透明液體
封閉液1000u 1/ ,r 1管/盒無(wú)色透明液體
堿性磷酸酶抗體lyl/管1管/盒無(wú)色透明液體
顯色劑A175u 1/ 管1管/盒黃色液體
顯色劑B320u 1/ 管1管/盒無(wú)色透明液體
緩沖液I 10x90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液II 10x80ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液III 10x20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液IV 10x90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無(wú)色透明液體
陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本6片/盒
上述試劑成分說(shuō)明(所有試劑購(gòu)自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，100mg 蛋白酶 K，加 DEPC_H20 5ml ；
2、保護(hù)液0. 2g的glycine加入1ml的IX緩沖液I ；
3、預(yù)雜交液1X緩沖液II 7.5ml
50XD 3ml
10mg/ml yest t--RNA 750ul
llmg/ml SALMONTESTES DNA682ul
0. 04M EDTA 3ml
50% formamide15ml
4、封閉液0.03g的bloking(購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司)加入1ml IX緩沖液III
5、10x緩沖液I (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HP04. 12H20 360gKC1 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、10x 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHC1 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. lgNaCl 87. 66gHC1 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:1M Tris-HC1(PH9. 5) :Tirs 121. lg 加 HC1 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；1M NaCl :NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A :NBT lg 加 70% DMF11. 44ml ；11、顯色劑8 :BCIP lg 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實(shí)施例2一種CD44基因原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用10ml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心lOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 lOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心lOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將10X緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；
2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. IX緩沖液II ；3、將10X緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液III;4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至100ml既可)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本兩張(每次 實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液lOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液lml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗lOmin, 三蒸水洗5min，以上過(guò)程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2 X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(lml封閉液加5mllX緩沖液 III) lOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml IX緩沖液III) lOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無(wú)色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)底物細(xì)胞中的CD44 基因表達(dá)量，用來(lái)確定乳腺癌的預(yù)后。臨床研究表明，CD44基因在乳腺癌中低表達(dá)，因?yàn)?⑶44基因在正常人高表達(dá)，⑶44基因的低表達(dá)說(shuō)明乳癌預(yù)后差，⑶44基因的表達(dá)程度與乳 癌的預(yù)后有關(guān)，屬負(fù)相關(guān)，表達(dá)愈低預(yù)后愈差。從而獲得乳腺癌的診斷信息。如上所述，當(dāng) 檢測(cè)到CD44基因表達(dá)時(shí)，可預(yù)測(cè)受試者為乳腺癌預(yù)后情況。具體結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖1和圖2。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種⑶44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5748<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0145]gagaagaaagccagtgcgtctctgggcgcaggggccagtggggctcggaggcacaggcac600146]cccgcgacactccaggttccccgacccacgtccctggcagccccgattatttacagcctc1200147]agcagagcacggggcgggggcagaggggcccgcccgggagggctgctacttcttaaaacc1800148]tctgcgggctgcttagtcacagccccccttgcttgggtgtgtccttcgctcgctccctcc2400149]ctccgtcttaggtcactgttttcaacctcgaataaaaactgcagccaacttccgaggcag3000150]cctcattgcccagcggaccccagcctctgccaggttcggtccgccatcctcgtcccgtcc3600151]tccgccggcccctgccccgcgcccagggatcctccagctcctttcgcccgcgccctccgt4200152]tcgctccggacaccatggacaagttttggtggcacgcagcctggggactctgcctcgtgc4800153]cgctgagcctggcgcagatcgatttgaatataacctgccgctttgcaggtgtattccacg5400154]tggagaaaaatggtcgctacagcatctctcggacggaggccgctgacctctgcaaggctt6000155]tcaatagcaccttgcccacaatggcccagatggagaaagctctgagcatcggatttgaga6600156]cctgcaggtatgggttcatagaagggcacgtggtgattccccggatccaccccaactcca7200157]tctgtgcagc333C33C3C3ggggtgtacatcctcacatccaacacctcccagtatgaca7800158]catattgcttcaatgcttcagctccacctgaagaagattgtacatcagtcacagacctgc8400159]ccaatgcctttgatggaccaattaccataactattgttaaccgtgatggcacccgctatg9000160]tccagaaaggagaatacagaacgaatcctgaagacatctaccccagcaaccctactgatg9600161]atgacgtgagcagcggctcctccagtgaaaggagcagcacttcaggaggttacatctttt10200162]acaccttttctactgtacaccccatcccagacgaagacagtccctggatcaccgacagca1080
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權(quán)利要求
一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)乳腺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非 放射性標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種⑶44基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9.一種CD44基因的原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或 組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種CD44(癌抗原44)基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種CD44基因原位雜交檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測(cè)乳腺癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101993941SQ200910056178
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日 公開(kāi)號(hào)200910056178.發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司