專利名稱：一種aldh1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種ALDH1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)160萬，死亡人數(shù)近 160萬，患者600萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400萬 人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康 的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率穩(wěn)定上升且趨年輕化，發(fā)病率在女性腫瘤中居第三位。據(jù)世界范 圍統(tǒng)計(jì)，全球每年約有120多萬人患乳腺癌，每年死于乳癌人數(shù)20萬，工業(yè)發(fā)達(dá)國家乳腺癌 進(jìn)一步增加，根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)(ACS)的報(bào)告，美國每年超過20萬人接受乳癌治療，其中約 四萬人被奪去生命。從2006中國乳腺癌內(nèi)分泌治療高峰論壇上了解到，中國是乳腺癌發(fā)病 率增長最快的國家之一，我國每年有約20萬名婦女患乳腺癌，中國乳腺癌發(fā)病率每年約增 長3% ；在京、津、滬等大中城市，乳腺癌已躍居女性惡性腫瘤之首。研究顯示，乳腺癌發(fā)病與 家族遺傳有密切關(guān)系，特別是猶太人婦女有一種特殊的BRCAl基因變異與家族性乳癌密切 相關(guān)，家族遺傳導(dǎo)致的乳癌大約占所有病例的5% -10，有乳癌家族史同時(shí)有BRCAl基因變 異的婦女，她們一生中有85%機(jī)率患乳癌，而且有50%的機(jī)率患妊巢癌。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BRCAl 基因無變異的大部分婦女患乳癌，而各國此類乳癌的發(fā)病率都在升高。近來的研究發(fā)現(xiàn)一 種叫ALDHl (乙醛脫氫酶1)，與乳癌的預(yù)后密切相關(guān)，它是乳癌復(fù)發(fā)的根源，可用于乳癌的 預(yù)后的觀察指標(biāo)。ALDHl基因標(biāo)記總體上具有高度一致，活化水平可能預(yù)測乳癌的存活率， 并且是有前景的預(yù)后工具。美國密歇根州州立大學(xué)綜合癌癥中心的Ginestier等人，發(fā)現(xiàn) 了一個(gè)檢測乳腺癌干細(xì)胞的新標(biāo)志物——乙醛脫氫酶1 (ALDHl)。利用此標(biāo)志物，研究者首 次在乳腺癌實(shí)體組織中發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞，(Cell Stem Cell 2007，1 :555)。干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞 中的比例一般不到5%，但卻可能是癌癥演進(jìn)的關(guān)鍵細(xì)胞。研究者采用一種稱為ALDEFLU0R 的試劑，檢測細(xì)胞內(nèi)的ALDHl活性。ALDHl活性高的細(xì)胞能被熒光標(biāo)記，從而可以被檢測和 分選出來。結(jié)果表明，在乳腺組織的正常細(xì)胞以及癌細(xì)胞中，ALDEFLU0R陽性的細(xì)胞具有類 似于干細(xì)胞的特性，而陰性細(xì)胞則不然。另外，對(duì)577份患者乳腺癌組織標(biāo)本的研究顯示， 19% 30%的腫瘤表達(dá)ALDHl。表達(dá)ALDHl陽性腫瘤患者的預(yù)后最差，其總體生存率較低， 發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性是ALDHl陰性腫瘤患者的1. 76倍。同時(shí)，研究者還對(duì)分選的細(xì)胞能否形 成乳腺腫瘤進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，僅ALDHl陽性細(xì)胞可形成腫瘤，即使只用500個(gè)陽性細(xì) 胞也會(huì)形成腫瘤；但5萬個(gè)ALDHl陰性細(xì)胞也不會(huì)形成腫瘤。該研究發(fā)現(xiàn)一種重要的可應(yīng) 用于檢測惡性乳腺癌干細(xì)胞的新標(biāo)志物，用這種簡單的標(biāo)志物可評(píng)估患者預(yù)后。本發(fā)明采 用核酸原位雜交技術(shù)檢測ALDHl基因，觀察細(xì)胞內(nèi)ALDHl基因的表達(dá)程度，來分析癌癥干細(xì) 胞存在和存在的量，進(jìn)一步研究表明ALDHl基因標(biāo)記總體上具有高度一致，活化水平和高 表達(dá)可能預(yù)測乳癌的預(yù)后，并且是有前景的預(yù)后工具。
乳腺癌從癌前變到形成癌癥，需要幾年時(shí)間，如何做到早期檢測、診斷、預(yù)后的檢 測及診治后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期檢出是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。常規(guī)的影像醫(yī)學(xué)檢查只 能診斷是否有占位的癌腫塊，也就是說發(fā)現(xiàn)已屬于癌癥晚期，往往病人的生存期不長。如何 在更早期發(fā)現(xiàn)(癌變前期)它有非常重要的臨床意義，也就是說如何從單細(xì)胞水平和基因 水平做到早期診斷和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期檢測是我們要實(shí)現(xiàn)治愈乳癌的關(guān)鍵?，F(xiàn)在臨床上有一 個(gè)錯(cuò)誤概念，依照傳統(tǒng)的影像醫(yī)學(xué)和結(jié)合其它生化檢測指標(biāo)，判定占位性的癌癥在二公分 以下是屬于早期癌癥，這一概念值得認(rèn)真討論。醫(yī)學(xué)影像學(xué)的2CM以下的腫塊屬于早期癌 癥這一界限科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，從?xì)胞學(xué)的角度，ICM腫塊約有1億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2CM的腫 塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)目，遠(yuǎn)不止2億個(gè)腫瘤細(xì)胞。由于目前臨床上的診斷手段比較 缺乏，通過X線、B超、CT、核磁共振等的手段能分辨在1-2CM以下的腫瘤已經(jīng)不錯(cuò)。而事實(shí) 上是，從單克隆癌細(xì)胞到2CM以下的腫塊可能是相當(dāng)長的病理演變過程，可能是一年或兩 年及三年以上，從癌變前期到癌細(xì)胞形成及生成2CM腫塊要經(jīng)過相當(dāng)長的病理演變過程， 在這個(gè)病理演變過程中，難以證實(shí)早先形成癌細(xì)胞克隆腫塊是唯一的癌塊，可能在最早形 成克隆腫塊的同時(shí)，癌細(xì)胞通過不同的途徑遷移到其它部位克隆生長。這在臨床上已得到 證實(shí)，一旦切除腫塊后，其他地方會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或其它多發(fā)的腫塊先后形成或轉(zhuǎn)移。因此，在 臨床上以2CM以下大小的腫塊來界分早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)，事實(shí)上這時(shí)的癌變已屬于晚期， 這導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正理由。美國所有的主要健康組織都認(rèn)為對(duì)癌癥的早期檢測是 挽救生命，降低晚期治療費(fèi)用的關(guān)鍵。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時(shí))就能做到早期預(yù)測診斷。將ALDHl基因的檢測技術(shù)用來篩選和預(yù)后檢測臨床婦科乳腺 癌的資料未見報(bào)道。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果表明ALDHl 基因表達(dá)與其它研究報(bào)道一致。該基因可以乳腺癌預(yù)后病理演變的重要標(biāo)志物。鑒于目前有些生化指標(biāo)(癌胚蛋白，糖蛋白、癌癥標(biāo)志物)敏感性不夠高，例如， AFP(甲胎蛋白)在癌塊直徑2公分以上或2公分以下的肝癌陽性率分別是50%和20%。 目前的一些生化診斷指標(biāo)只是對(duì)晚期癌癥檢測比較靈敏，如何做到影像醫(yī)學(xué)手段無法判定 癌癥，標(biāo)志物檢測不夠靈敏時(shí)，就能發(fā)現(xiàn)癌癥已發(fā)生及已轉(zhuǎn)移，或者在治療后能及早地預(yù)測 轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)狀況，特別是作為臨床婦科乳腺癌普查篩選的硬指標(biāo)，及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌，降低乳腺 癌的發(fā)病率和死亡率，這就是本發(fā)明初衷。本發(fā)明的原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技 術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原 理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ) 核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測， 從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。中國專利文獻(xiàn)CN1556221公開了 “IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物診斷和治療結(jié)腸癌的用 途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒”。中國專利文獻(xiàn)CN1769485公開了“櫛孔扇貝病原類立克次 氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒”。但是，關(guān)于ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒及其 檢測技術(shù)未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種ALDHl基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種ALDHl基因的原位雜交檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ALDHl基因的原位雜交檢測試 劑盒，在制備檢測乳腺癌或乳腺癌預(yù)后疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、 標(biāo)記物，其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。ALDHl基因的核苷酸序列長度是 2116bp，CDS 是 54. . 1559，位于染色體 9q21. 13. 1"位點(diǎn)上。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述，還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ALDHl基因的原位雜交 檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述 的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ALDHl基因原位雜交檢 測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。作為可選的技術(shù)方案，所述a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度 為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以ALDHl基因 為檢測對(duì)象，合成探針是ALDHl基因的DNA或RNA序列，檢測的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞 或乳腺組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供ALDHl基因的半定量或 定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量，正常乳腺組織ALDHl 基因低表達(dá)，即淺顯色或不顯色，在乳腺癌病人高表達(dá)，深顯色，臨床意義非常重大。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C )
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C )；7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測乳腺癌發(fā)生動(dòng)態(tài)過程，以及用于乳腺癌預(yù) 防醫(yī)學(xué)的檢測和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標(biāo)志物，以及 影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測ALDHl異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢 查及乳腺檢查未發(fā)現(xiàn)占位性乳腺癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫 塊之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床乳腺癌病患一個(gè)真正的預(yù)后早 期診斷。這樣才有可能實(shí)施乳腺癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底 根乳腺癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中乳腺癌癥病人ALDHl基因表達(dá)圖片。圖2是正常乳腺ALDHl基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合圖對(duì)本發(fā)明提供的一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方 法和應(yīng)用的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。實(shí)施例1一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和
標(biāo)本組成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護(hù)液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ ,f 2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ ,f 1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體 μ /管1管/盒無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管;1管/盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管;1管/盒 無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無色透明液體陽性對(duì)照標(biāo)本 6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護(hù)液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
實(shí)施例2一種ALDHl基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對(duì)照標(biāo)本兩張(每次 實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽性對(duì)照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2 X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15mi η ；13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的 ALDHl基因表達(dá)量，用來確定乳腺癌的預(yù)后。臨床研究表明，ALDHl基因在乳腺癌中高表達(dá)， 因?yàn)锳LDHl基因在正常人低表達(dá)，ALDHl基因的高表達(dá)說明乳癌預(yù)后差，ALDHl基因的表達(dá) 程度與乳癌的預(yù)后有關(guān)，屬正相關(guān)，表達(dá)越高預(yù)后越差。從而獲得乳腺癌的診斷信息。具體 結(jié)果請(qǐng)見圖1和圖2。實(shí)施例3用ALDHl基因試劑盒檢測乳腺癌疾病與用ERK基因試劑盒檢測乳腺癌疾病之間平 行實(shí)驗(yàn)。為了科學(xué)評(píng)價(jià)上述基因各自在乳腺癌疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我們用平行 試驗(yàn)的方法，同時(shí)檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一例乳腺癌 疾病患者的外周血，同時(shí)檢測ALDHl基因和ERK基因的mRNA (進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化 染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報(bào)告等均采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟 及試劑)。發(fā)現(xiàn)ALDHl基因在乳腺癌疾病病人中表達(dá)量比ERK基因在同一疾病病人的表達(dá) 量要高。結(jié)果表明，ALDHl基因?qū)θ橄侔┘膊≡\斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比ERK基因更 好，原位雜交基因表達(dá)圖顯示，ALDHl基因的表達(dá)量是70%，ERK基因的表達(dá)量是50%。本 發(fā)明的試劑盒作于乳腺癌疾病診斷的指標(biāo)有非常重要的臨床意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用0140]<130>/0141]<160>10142]<170>PatentIn versiorι 3. 30143]<210>10144]<211>21160145]<212>DNA0146]<213> 智人(Homo sapiens)0147]<400>10148]atcagaaccaaattgctgagccagtcacct0149]cctcaggcacgccagacttacctgtcctac0150]tcttcataaacaatgaatggcatgattcag0151]ctgcaactgaggaggagctctgccaggtag0152]cagtgaaggccgcaagacaggcttttcaga0153]ccgagagggggcgactattatacaagttgg0154]tggcgacaatggagtcaatgaatggtggaa0155]tagcaggctgcatcaaaacattgcgctact0156]gtacaataccaattgatggaaattttttta0157]gtggccaaatcattccttggaatttcccgt0158]cactgagctgtggaaacacagtggttgtca0159]tccacgtggcatctttaataaaagaggcag0160]ctggttatgggcctacagcaggggcagcca0161]ccttcacaggatcaacagaggttggcaagt0162]tgaagagggtgaccctggagcttggaggaa0163]acttggacaatgctgttgaatttgcacacc0164]gtatagccgcatccaggatttttgtggaag0165]gtgttgagcgggctaagaagtatatccttg0166]gccctcagattgacaaggaacaatatgata0167]aagaaggggccaaactggaatgtggaggag0168]agcccacagtgttctctaatgttacagatg0169]gaccagtgcagcaaatcatgaagtttaaat0170]atactttctatggcttatcagcaggagtgt0171]tctcctctgctctgcaggcaggaacagtgt0172]agtgcccctttggtggattcaagatgtctg0173]tccatgaatatacagaggtcaaaacagtca0174]gaaaatacaagagtggagagaagctcttca0175]atagtagattttaaagacaaaatttttctt0176]atattagtattaatactacccatagaaaac0177]ttgccttctgaaatgtgacccccaagtcct0178]tatgatctctctagctttgtcatagttatg
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權(quán)利要求
一種ALDH1基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測乳腺癌或乳腺癌預(yù)后疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非 放射性標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.一種ALDHl基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9.一種ALDHl基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或 組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種ALDH1(乙醛脫氫酶1)基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種ALDH1基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測乳腺癌或乳腺癌預(yù)后疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)；本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101993944SQ20091005618
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日 公開號(hào)200910056181.9
發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司