專利名稱：Egfr基因突變篩查評估分子靶向藥物療效的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及EGFR基因突變篩査評估分子靶向藥物療效的檢測方法，利用直接測序的 方法對EGFR基因18-21號外顯子進(jìn)行突變檢測，為針對性的靶向治療提供依據(jù)，以避免不 合理用藥，更好的為患者提供治療方案，屬于藥物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種廣泛分布于人 體各組織細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，是HER/ErbB家族成員之一。該家族包括EGFR、 HER2、 HER3和HER4。 EGFR與其配體(EGF、 TGFa 、 HB — EGF、 amphiregulin、 betacellulin) 結(jié)合后在細(xì)胞表面形成二聚體。這種二聚體包括與其本身形成的同源二聚體和與erbB家 族其它成員形成的異源二聚體。受體二聚體化后，內(nèi)在的蛋白激酶活化，TK磷酸化使信 號下傳。從而，激活其下游的3條主要信號通路Ras2/Raf2/MAPK通路、磷脂酰三磷酸 肌醇(PI3K)和絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、 JAK和STAT通路。3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終介導(dǎo)細(xì) 胞分化、生存、遷移、侵襲、黏附和細(xì)胞損傷修復(fù)等一系列過程。靶向EGFR的藥物，通 過阻斷信號傳導(dǎo)，來達(dá)到治療目的。
EGFR是一種跨膜受體，它屬于一個包括四種相關(guān)蛋白的家族。每個受體可選擇性地 與10種不同的配體結(jié)合。當(dāng)一個配體結(jié)合一個單鏈EGFR后，受體形成二聚體，它通過 酪氨酸激酶的活性，激活受體自磷酸化，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)出信號。自磷酸化觸發(fā)一系列胞內(nèi)途 徑，可導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、阻滯凋亡、活化(腫瘤)侵襲和轉(zhuǎn)移，并刺激腫瘤誘導(dǎo)的新生血管 形成。EGFR的基因突變作為使用藥物是否有效的一個重要因素。直到最近的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 的基因突變?nèi)源嬖谟谕怙@子18 21，不同外顯子的突變將導(dǎo)致構(gòu)象變化，改變和增強(qiáng)蛋白 的活性，同樣增強(qiáng)對TKI的敏感性。TKI通過與ATP競爭結(jié)合EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)，阻 止酪氨酸殘基磷酸化，從而阻止EGFR信號通路的傳導(dǎo)，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、 血管生成等一系列腫瘤細(xì)胞生物活動。
表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)如阿瓦斯丁 (AVASTIN)，特羅凱 (Erlotinib)，吉非替尼(gefitinib,又稱易瑞沙，Iressa);西妥昔單(Erbitux)等能通 過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中必須的表皮生長因子受體酪氨酸激酶阻斷腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)， 從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。根據(jù)藥物的作用耙點和性質(zhì)，可將耙向EFGR藥物分為兩類 一類是單克隆抗體(Cetuximab， ABX-EGF， EMD 72000等)，通過識別受體的胞外區(qū)，競爭與配體結(jié)合，干擾EGFR的自身 磷酸化及阻礙細(xì)胞表面EGFR 二聚體形成，抑制信號傳導(dǎo)系統(tǒng)激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞增 殖；另一類是小分子的化合物(IRESSA， Erlotinib, EKB2569等)，能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接 作用于EGFR的胞內(nèi)區(qū)，干擾ATP結(jié)合，抑制酪氨酸的活性阻斷激酶的自身磷酸化及底物 的磷酸化，徹底阻斷異常的酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)。雖然兩類藥物的作用部位不同，但通過 阻止配體介導(dǎo)的受體及下游信號通路的激活，最終產(chǎn)生相似的效果，即阻滯細(xì)胞在G1期、 促進(jìn)凋亡、抑制新生血管形成、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，從而起到治療作用。
Lynch等和Paez等首先報道了位于EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)第18 21外顯子的突變與 gefitinib的有效率明顯相關(guān)。實驗證實EGFR基因突變能導(dǎo)致細(xì)胞功能改變，Lynch等發(fā) 現(xiàn)導(dǎo)入del747 753InsS和L858R的細(xì)胞與具有野生型EGFR的細(xì)胞相比，EGFR蛋白的表 達(dá)水平相當(dāng)，加入EGF后EGFR突變體的磷酸化程度更高，持續(xù)時間更長。Paez等發(fā)現(xiàn)攜 帶L858R的H325S細(xì)胞對gefitinib的敏感性比野生型細(xì)胞高100倍；gefitinib不但抑 制EGFR自我磷酸化，還抑制EGFR下游分子ERK1/2和AKT激酶的磷酸化。EGFR基因共28 個外顯子.其中編碼酪氨酸激酶區(qū)的是第18 21外顯子。對EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析表 明，盡管突變部位分散在整個酪氨酸激酶編碼區(qū)，但89%的突變集中在第19外顯子的缺 失和第21外顯子的L858R點突變。
實驗證實有功能的突變EGFR是一種糖蛋白的跨膜受體，是酪氨酸激酶生長因子受體 家族的成員。 一旦EGFR胞外部分與配體相結(jié)合，就會在細(xì)胞表面形成受體同源二聚體或 異源二聚體。EGFR最常見的異源二聚體化類型是Her-2。該二聚體化改變了受體的構(gòu)象， 導(dǎo)致受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的特定酪氨酸殘基自身磷酸化，激活其下游信號途徑，將外界信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 至細(xì)胞內(nèi)，這種突變的基因被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，提高了細(xì)胞對EGF的反應(yīng)性，也明顯增加了 對gefitinib的敏感性。
Lynch等認(rèn)為這種現(xiàn)象可能是由于EGFR突變使EGFR酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點的某些 關(guān)鍵基團(tuán)發(fā)生重構(gòu)，增強(qiáng)了與ATP或其競爭性抑制劑gefitinib的相互作用。因此，有突 變EGFR基因的患者表現(xiàn)出對gefitinib更好的治療反應(yīng)。Paez等率先分析了 119例NSCLC 患者的突變與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EGFR突變發(fā)生率在腺癌中高于其他病理類型，女性 高于男性。此次實驗全部選擇原發(fā)性肺腺癌患者，結(jié)果男性EGFR基因突變發(fā)生率明顯低 于女性，與Paez等人的結(jié)果相符。美國非小細(xì)胞肺癌的患者中只有約10X有EGFR的基因 突變，然而在亞洲人中，約30X的非小細(xì)胞肺癌患者有EGFR的基因突變。本實驗中腺癌
6EGFR突變率為37.6%，高于非小細(xì)胞肺癌的平均突變率，這也說明在中國人腺癌中的突 變率高于其他病理類型的突變率，而且明顯高于歐美人。Pao等發(fā)現(xiàn)不吸煙NSCLC患者的 EGFR突變率高于既往吸煙的患者，本研究中，無吸煙史病例EGFR基因突變發(fā)生率為47. 1 %,也明顯高于有吸煙史者，與有些文獻(xiàn)報道一致。以EGFR受體酪氨酸激酶為靶點抗腫 瘤藥物已經(jīng)成為晚期肺癌治療的一種新選擇。由于NSCLC中EGFR基因突變與TKIs治療敏 感性顯著相關(guān)，臨床上應(yīng)根據(jù)EGFR突變情況來選擇用藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制藥物療效的檢測方法，可 用于評估易瑞沙類藥物治療腫瘤的療效。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制
藥物療效的檢測方法，其特征在于，具體步驟為 步驟1.采集被測者血清或腫瘤組織樣本； 步驟2。基因組DNA的抽提方法
采用硅膠吸附法抽提步驟1中被測者DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像 法對DNA濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢 測；
步驟3.基因分型
將每一個被測者樣本分別放入4個反應(yīng)孔，4個反應(yīng)孔分別檢測EGFR基因18-21號 外顯子突變情況，采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點 進(jìn)行基因型進(jìn)行確定
步驟3-l，反應(yīng)體系配置
在每一個反應(yīng)孔中加入PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng) 體系總體積為20ul，其中，PCR試劑(天根生化KT202-12) 5ul，正向引物和反向引物各 0.4ul， 20ngM的步驟2得到的EGFR DNA模板3ri，去離子水11.2ul;
EGFR基因第18外顯子正向和反向引物
正相弓l物s ttccaaatgagctggcaagt
反向引物gtcaatggcccctttcataa
EGFR基因第19外顯子正向和反向引物
正相弓l物ccccagcaatatcagcctta
反向引物agtgctgggtagatgccagtEGFR基因第20外顯子正向和反向引物 正相弓l物gcacagcttttcctccatga 反向引物gatgggacaggcactgattt EGFR基因第21外顯子正向和反向引物 正相引物actaacgttcgccagccata 反向弓l物tcattcactgtcccagcaag 步驟3-2， PCR反應(yīng)條件
將反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95。C預(yù)熱15分鐘；再進(jìn) 行35個循環(huán)的95。C、 45秒；60°C、 45秒；72°C、 60秒；72°C、 7分鐘后降溫至4。C;
步驟3-3，將反應(yīng)孔在PCR擴(kuò)增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，有肉眼可見清晰白色 條帶即可進(jìn)入下一步
a. lwtM瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；
b. 2000bpDNA標(biāo)記物6ul
c. 步驟3-2的PCR產(chǎn)物4ul加入電泳緩沖液lul
d. 電泳電壓120v
e. 電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖； 步驟3-4，純化
終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0. 2U SAP+ PCR產(chǎn)物純化試劑2. 5U EX0N1/ 7ul;
在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH20 3。825ul、 PCR產(chǎn)物純化試劑SAP 0. 05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EX0N1 0.125ul、步驟3-3的PCR產(chǎn)物3ul; 反應(yīng)條件為37°C 、 60min; 80°C、 15min; 4'C恒溫保存;
步驟3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進(jìn)行測序，引物濃度為luM， ABI 3730測序儀；
步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產(chǎn)物、測序試劑BigDye、四種 dNTP、 luM測序引物，18-21號外顯子測序引物分別為ttccaaatgagctggcaagt; ccccagcaatatcagcctta; gcaca-gcttttcctccatga; actaacgttcgccagccata;
步驟3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、測序試 劑用量、PCR反應(yīng)條件；
步驟3-5-3，取一塊反應(yīng)板，標(biāo)上模板名、測序引物名、日期；
步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用一個反應(yīng)孔；
步驟3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的BigDye、 1. 4ul的dNTP、 2ul的測序引物、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0. lul的去離子水ddH20;體系分裝好后，
上離心機(jī)，達(dá)900轉(zhuǎn)/分即停；
步驟3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96
'C10秒；再進(jìn)行25個循環(huán)的96°C、 10秒；50°C、 5秒；60°C、 4分鐘；60°C、 4分鐘后
降溫至4'C恒溫保存；
步驟3-5-7，擴(kuò)增結(jié)束后，在每孔加入lul 125raM乙二胺四乙酸EDTA;
步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進(jìn)行沉淀，不得超過24小時；
步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機(jī)，3650轉(zhuǎn)/分，4。C離心30分鐘；
步驟3-5-10,輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul 70wt%
乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4'C離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，
將殘余酒精風(fēng)干，室溫放置20分鐘；
步驟3-5-11，每孔加入8ul 95wtM甲酰胺與ddH20混合物；
步驟3-5-12，在ABI 3730上進(jìn)行結(jié)果讀取，用軟件Chromas査閱測序檢測結(jié)果18-21 每個外顯子都2類結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果； 步驟4，結(jié)果分析
1，未檢出突變您的檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)EGFR基因第18-21號外顯子上存在突變； 2.檢出突變您的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)EGFR基因第18-21號外顯子上存在突變。
本發(fā)明對EGFR基因第18-21號外顯子上進(jìn)行檢測，相應(yīng)位點特異性引物的設(shè)計以及 用于序列測定的實驗方案、試劑以及報告生成系統(tǒng)，通過同時檢測分析個體的EGFR基因 第18-21號外顯子上是否存在突變來評估用于治療癌癥個體的表皮生長因子受體酪氨酸激
酶抑制劑類藥物的有效性。
采集樣本的類型為血清樣本，采用硅膠吸附法抽提DNA具有所需樣品量少，抽提質(zhì)量
穩(wěn)定，抽提產(chǎn)物純度高，操作簡便的特點。
利用本發(fā)明對超過100例以上中國人群樣本的檢測結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進(jìn)行的 EGFR基因第18-21號外顯子上基因型檢測檢出率可達(dá)99%以上，結(jié)果可重復(fù)性達(dá)到100%。
本發(fā)明的優(yōu)點是可用于檢測癌癥個體的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物。


圖1為7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖2為EGFR基因第18號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖3為EGFR基因第19號外顯子實驗無突變結(jié)果示意9圖4為EGFR基因第20號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖； 圖5為EGFR基因第21號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖； 圖6為EGFR基因第18號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖； 圖7為EGFR基因第19號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖； 圖8為EGFR基因第20號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖； 圖9為EGFR基因第21號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例
一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制藥物療效的檢測方法，具體步驟為 步驟1.采集被測者血清或腫瘤組織樣本； 步驟2.基因組DNA的抽提方法-
采用硅膠吸附法抽提步驟1中被測者DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像 法對DNA濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢 測；
步驟3.基因分型
將每一個被測者樣本分別放入4個反應(yīng)孔，4個反應(yīng)孔分別檢測EGFR基因18-21號 外顯子突變情況，采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點 進(jìn)行基因型進(jìn)行確定
步驟3-l，反應(yīng)體系配置
在每一個反應(yīng)孔中加入PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng) 體系總體積為20ul，其中，PCR試劑(天根生化KT202-12) 5ul，正向引物和反向引物各 0.4ul， 20ngM的步驟2得到的EGFR DNA模板3W，去離子水11.2ul;
EGFR基因第18外顯子正向和反向引物
正相弓l物ttccaaatgagctggcaagt
反向弓l物gtcaatggcccctttcataa
EGFR基因第19外顯子正向和反向引物
正相弓l物ccccagcaatatcagcctta
反向弓l物agtgctgggt卿tgccagt
EGFR基因第20外顯子正向和反向引物正相弓l物gcacagcttttcctccatga 反向弓l物gatgggacaggcactgattt EGFR基因第21外顯子正向和反向引物 正相弓l物actaacgttcgccagccata 反向弓l物tcattcactgtcccagcaag 步驟3-2， PCR反應(yīng)條件
將反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95'C預(yù)熱15分鐘；再進(jìn) 行35個循環(huán)的95。C、 45秒；6(TC、 45秒；72°C、 60秒；72°C、 7分鐘后降溫至4。C;
步驟3-3，將反應(yīng)孔在PCR擴(kuò)增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，有肉眼可見清晰白色 條帶即可進(jìn)入下一步
a. lwtM瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；
b. 2000bpDNA標(biāo)記物6ul
c. 步驟3-2的PCR產(chǎn)物4ul加入電泳緩沖液lul
d. 電泳電壓120v
e. 電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳7個樣本PCR后產(chǎn)物，25ng/ul的電泳結(jié)果圖，目的條帶800bp左右； 如圖1所示，為7個樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。 步驟3-4，純化
終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0. 2U SAP+ PCR產(chǎn)物純化試劑2. 5U EXON1/ 7ul;
在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH20 3 . 82 5ul、 PCR產(chǎn)物純化試劑SAP (promega M8201 ) 0.05ul 、 PCR產(chǎn)物純化試劑EXONl (NEB M0293V)0. 125ul、步驟3-3的PCR產(chǎn)物3ul;反應(yīng)條件為37°C 、 60min; 80°C、 15min; 4'C恒溫保存；
步驟3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進(jìn)行測序，引物濃度為luM， ABI 3730測序儀； 步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產(chǎn)物、測序試劑BigDye(PE
Applied Biosystems 4337574 )、四種dNTP、 luM測序引物，18-21號外顯子測序引物分
另ij為ttccaaatgagctggcaagt ; ccccagcaatatcagcctta ; gcacagcttttcctccatga ;
actaacgttcgccagccata;
步驟3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、測序試
劑用量、PCR反應(yīng)條件；
11步驟3-5-3，取一塊反應(yīng)板，標(biāo)上模板名、測序引物名、日期；步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用一個反應(yīng)孔；
步驟3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0. 5ul的BigDye、 1.4ul的dNTP、 2ul的測序引物、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0. lul的去離子水ddH20;體系分裝好后，上離心機(jī)，達(dá)900轉(zhuǎn)/分即停；
步驟3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96。C10秒；再進(jìn)行25個循環(huán)的96°C、 10秒；50°C、 5秒；60°C、 4分鐘；60°C、 4分鐘后降溫至4'C恒溫保存；
步驟3-5-7，擴(kuò)增結(jié)束后，在每孔加入lul 125mM乙二胺四乙酸EDTA;
步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進(jìn)行沉淀，不得超過24小時；
步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機(jī)，3650轉(zhuǎn)/分，4。C離心30分鐘；
步驟3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul 70wt%乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4t;離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風(fēng)干，室溫放置20分鐘；
步驟3-5-11，每孔加入8ul 95wty。甲酰胺與ddH20混合物；步驟3-5-12，在ABI 3730上進(jìn)行結(jié)果讀取，用軟件Chromas査閱測序檢測結(jié)果18-21每個外顯子都2類結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；如圖2所示，為EGFR基因第18號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖；如圖3所示，為EGFR基因第19號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖；如圖4所示，為EGFR基因第20號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖；如圖5所示，為EGFR基因第21號外顯子實驗無突變結(jié)果示意圖。圖6為EGFR基因第18號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖；圖7為EGFR基因第19號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖；圖8為EGFR基因第20號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖；圖9為EGFR基因第21號外顯子實驗突變結(jié)果示意圖。被測者EGFR基因第18-21號外顯子的圖片與上述正常結(jié)果相同，均無突變。
步驟4.最后得出檢測結(jié)果，給出結(jié)果分析如下大量研究表明EGFR基因第18-21號外顯子的突變與表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物治療癌癥療效有密切關(guān)系。EGFR突變使EGFR酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點的某些關(guān)鍵基團(tuán)發(fā)生重構(gòu)，增強(qiáng)了與ATP或其競爭性抑制劑吉非替尼(gefitinib，又稱易瑞沙，Iressa)的相互作用，個體使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物治療腫瘤效果佳，相反如果EGFR18-21號外顯子不存在突變，那么個體使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物治療腫瘤效果不佳。您的檢測結(jié)果中不存在EGFR基因第18-21號外顯子突變。
12序列表
〈110〉上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
〈120>EGFR基因突變篩查評估分子耙向藥物療效的檢測方法〈歸12
<210〉 1〈211〉 600<212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400> 1
taccaacttctgtcaagctctgt卿g犯ggcgtacatttgtccttccaaatgagctggc60
aagtgccgtgtcctggcacccaagcccatgccgtggctgctggtccccctgctgggccat120
gtctggcactgctttccagc3tggtg鄉(xiāng)gctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgt180
CCCCCCC3gCttgtggagcctcttacaccc觀tgg卿agctccc犯cceLagctctcttg240
aggatcttgaagg3犯ctgaiattca^a犯gatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggc300
acggtgtataaggtaaggtccctggcacaggcctctgggc tgggccgcagggcctctcat360
ggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttactct420
ttgtttcac"tgagtgtttgggaaactccagtgtttttcccaagttattgag￡lgga￡L3tCt480
ceigteLettcEigtggtcctgtggLg￡LCC2L￡LttCggcattttta540
tgaaaggggccattgaccttgccatggggtgcagcacagggcgggaggagggccgcctct600
〈210> 1
〈211〉 600
<212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400〉 2
aggctttaca agcttgagattcttttatcttgtgattcgtggagccc33c60
agctgcagggctgcgggggcgtcacagcccccagcaatatcagccttaggtgcggctcca120cagccccagtgtccctcaccttcggggtgcatcgctggta￡LC￡ltCC3CCCagatcactgg180
gcagcatgtggcaccatctc8LC33ttgCC8gttaacgtcttccttctctctctgtcatag240
ggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaaga300
g犯gC33C3tctccgaaagcatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtg360
tgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagctgctctgc420
tctagaccctgctcatctccacatcctaaatgttcactttctatgtctttccctttctag480
ctctagtgggtataactccctccccttagagacagcactggcctctcccatgctggtatc540
caccccaaaaggctgg犯acaggcaattactggcatctacccagcactagtttcttgaca600
〈210〉 1
〈211〉 600
〈212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)
〈400> 3
cgtccctgtgctaggtcttttgcaggcacagcttttcctccatgagtacgtattttgaaa60
ctcaagatcgcattcatgcgtcttcacctggsaggggtccatgtgcccctccttctggcc120
accatgcgaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggcca160
gcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagc240
tcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaa300
atattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgc卿tcgcaaaggta￡LtC3ggg￡L￡Lg360
gg卿tacggggagggg卿taaggagccaggatcctcacatgcggtctgcgctcctggg420
atagc犯g3gtttgccatggggatatgtgtgtgcgtgcatgcagcac3cacacattcctt480
tattttggattca3tcaagttgatcttcttgtgcacaaatcagtgcctgtcccatctgca540
"tg"tggaaactctcalcaatcagctacctttgaag犯ttttctctttattgagtgctcagt600
<210〉 1〈211〉 600〈212〉 DNA
〈213〉人(Homo sapiens)<400〉 4
C3gC3gCgggttacatcttctttcatgcgcctttccattctttggatcagtagtcactsLa 60cgttcgccagccataagtcctcgacgtggag鄉(xiāng)ctc卿gcctggcatgaacatgaccc120
tg犯ttcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagc3gggtcttctct180
gtttcagggcatg￡Lact￡icttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggC8LgCCag240
gaacgtactgcgcagcatgtcaagatcacag3ttttgggCtggccaaact300
gctgggtgcgaataccatgcaaagtaaggaggtggcttta360
ggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtt420
taacacatgcgctctccagacattctgggtgagctcgcagcagctgctgc480
tggcagctgggtccagccagggtctcctggtagtgtgagccagagctgctttggg￡l￡LC6Lg540
tacttgctgggacagtgaatgaggatgttatccccaggtgatcattagcaaatgttaggt600
〈210>5〈211>20〈212〉腿<213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第18號外顯子序列擴(kuò)增的正向引物。<400〉5
ttccaaatga gctggcaagt 20
〈210>6<211〉20〈212〉腿<213>人工序列
〈220>〈223〉用于EGFR基因第18號外顯子序列擴(kuò)增的反向引物。<400〉6
gtcaatggcc cctttcataa 20
〈210〉7<211〉20〈212>腿<213〉人工序列
〈220〉
〈223>用于EGFR基因第19號外顯子序列擴(kuò)增的正向引物。<400〉7
ccccagcaat atcagcctta 20
〈210>8<211〉20〈212〉 DNA<213>人工序列
〈220>
〈223〉用于EGFR基因第19號外顯子序列擴(kuò)增的反向引物。〈400〉8
agtgctgggt agatgccagt 20
<210〉9〈211>20〈212> DNA
16〈213〉人工序列 〈220>
〈223〉用于EGFR基因第20號外顯子序列擴(kuò)增的正向引物。 <棚>9
gcacagcttt tcctccatga 20
〈210>10 〈211〉20 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220>
〈223〉用于EGFR基因第20號外顯子序列擴(kuò)增的反向引物。 <400>10
gatgggacag gcactgattt 20
<210>11 〈211〉20 <212>廳 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第21號外顯子序列擴(kuò)增的正向引物。 〈400〉11
actaacgttc gccagccata 20
17〈210〉12 〈211>20 〈212> DNA <213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于EGFR基因第21號外顯子序列擴(kuò)增的反向引物。 <400>12
tcattcactg tcccagcaag 20
權(quán)利要求
1、一種EGFR基因突變篩查評估分子靶向藥物療效的檢測方法，其特征在于，具體步驟為步驟1.采集被測者血清或腫瘤組織樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1中被測者DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像法對DNA濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入4個反應(yīng)孔，4個反應(yīng)孔分別檢測EGFR基因18-21號外顯子突變情況，采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增、凝膠電泳技術(shù)檢測純度、測序技術(shù)對這些位點進(jìn)行基因型進(jìn)行確定步驟3-1，反應(yīng)體系配置在每一個反應(yīng)孔中加入PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng)體系總體積為20ul，其中，PCR試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步驟2得到的EGFR DNA模板3μl，去離子水11.2ul；EGFR基因第18外顯子正向和反向引物正相引物ttccaaatgagctggcaagt反向引物gtcaatggcccctttcataaEGFR基因第19外顯子正向和反向引物正相引物ccccagcaatatcagcctta反向引物agtgctgggtagatgccagtEGFR基因第20外顯子正向和反向引物正相引物gcacagcttttcctccatga反向引物gatgggacaggcactgatttEGFR基因第21外顯子正向和反向引物正相引物actaacgttcgccagccata反向引物tcattcactgtcccagcaag步驟3-2，PCR反應(yīng)條件將反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)熱15分鐘；再進(jìn)行35個循環(huán)的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘后降溫至4℃；步驟3-3，將反應(yīng)孔在PCR擴(kuò)增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，有肉眼可見清晰白色條帶即可進(jìn)入下一步a.1wt％瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNA標(biāo)記物6ulc.步驟3-2的PCR產(chǎn)物4ul加入電泳緩沖液1uld.電泳電壓120ve.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖；步驟3-4，純化終濃度PCR產(chǎn)物純化試劑0.2U SAP+PCR產(chǎn)物純化試劑2.5U EXON1/7ul；在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH2O 3.825ul、PCR產(chǎn)物純化試劑SAP 0.05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EXON10.125ul、步驟3-3的PCR產(chǎn)物3ul；反應(yīng)條件為37℃、60min；80℃、15min；4℃恒溫保存；步驟3-5，將純化后的每一個反應(yīng)孔進(jìn)行測序，引物濃度為1uM，ABI 3730測序儀；步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產(chǎn)物、測序試劑BigDye、四種dNTP、1uM測序引物，18-21號外顯子測序引物分別為ttccaaatgagctggcaagt；ccccagcaatatcagcctta；gcacagcttttcctccatga；actaacgttcgccagccata；步驟3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、測序試劑用量、PCR反應(yīng)條件；步驟3-5-3，取一塊反應(yīng)板，標(biāo)上模板名、測序引物名、日期；步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應(yīng)，用一個反應(yīng)孔；步驟3-5-5，在每一個反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0.1ul的去離子水ddH2O；體系分裝好后，上離心機(jī)，達(dá)900轉(zhuǎn)/分即停；步驟3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96℃10秒；再進(jìn)行25個循環(huán)的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分鐘；60℃、4分鐘后降溫至4℃恒溫保存；步驟3-5-7，擴(kuò)增結(jié)束后，在每孔加入1ul 125mM 乙二胺四乙酸EDTA；步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進(jìn)行沉淀，不得超過24小時；步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機(jī)，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心30分鐘；步驟3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風(fēng)干，室溫放置20分鐘；步驟3-5-11，每孔加入8ul 95wt％甲酰胺與ddH2O混合物；步驟3-5-12，在ABI 3730上進(jìn)行結(jié)果讀取，用軟件Chromas查閱測序檢測結(jié)果18-21每個外顯子都2類結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；步驟4，結(jié)果分析(1).未檢出突變您的檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)EGFR基因第18-21號外顯子上存在突變；(2).檢出突變您的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)EGFR基因第18-21號外顯子上存在突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及EGFR基因突變篩查評估分子靶向藥物療效的檢測方法，其特征在于，具體步驟為采集被測者血清或腫瘤組織樣本，進(jìn)行基因組DNA的抽提，對EGFR基因第18-21號外顯子進(jìn)行檢測，相應(yīng)位點特異性引物的設(shè)計以及用于序列測定的實驗方案、試劑以及報告生成系統(tǒng)，通過同時檢測分析個體的EGFR基因第18-21號外顯子是否存在突變，來評估用于治療癌癥個體的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物的有效性。本發(fā)明的優(yōu)點是可用于癌癥個體表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101654701SQ20091005620
公開日2010年2月24日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者傅詠南, 毛丹丹 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司