專利名稱：一種原核表達(dá)體系高表達(dá)堿性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原核表達(dá)體系高表達(dá)堿性蛋白的方法。
背景技術(shù)：
重組蛋白質(zhì)是指利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。絕大部分重組蛋白藥物是人體 蛋白或其突變體，主要作用機理為彌補某些體內(nèi)功能蛋白的缺陷或增加人體內(nèi)蛋白功能。 重組蛋白生產(chǎn)過程包括鑒定具有藥物作用活性的目的蛋白，分離或合成編碼該蛋白的基 因，然后將其插入合適的載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建能高效表達(dá)蛋白的菌種庫或細(xì)胞庫，最 后擴大規(guī)模應(yīng)用到發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器進(jìn)行大量的目的蛋白生產(chǎn)。 重組藥物的表達(dá)系統(tǒng)分為原核生物和真核生物表達(dá)系統(tǒng)。原核生物主要是大腸桿 菌表達(dá)系統(tǒng)，真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要有酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。原核 表達(dá)系統(tǒng)工藝成熟、成本低廉，但原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌比較適合于酸性蛋白的表達(dá)[Su Y，Zou Z，F(xiàn)eng S， et al. J Biotech. 2007， 129 :373-382]，帶有強正電荷的堿性重組蛋白本 身就不適合在大腸桿菌這種原核表達(dá)體系表達(dá)，即使其基因就算是被勉強轉(zhuǎn)錄、翻譯后，也 很容易招致細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的攻擊而破壞，得不到表達(dá)的產(chǎn)物，所以急需解決堿性重組 蛋白原核表達(dá)體系表達(dá)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題提供了一種原核表達(dá)體系高表達(dá)堿性蛋白的方法，為 堿性蛋白生物制備提供一條廉價、方便的生產(chǎn)途徑。 為此本發(fā)明公開了，一種原核表達(dá)體系高表達(dá)堿性蛋白的方法，包括如下步驟
a)重組堿性蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建；
b)重組堿性蛋白轉(zhuǎn)化體的制備；
c)重組堿性蛋白的表達(dá)；
d)重組堿性蛋白的酶切、純化； 其中，所述重組堿性蛋白為堿性蛋白和保護多肽或片段的融合蛋白，所述堿性蛋 白是指等電點為9-11的蛋白或C末端氨基酸序列帶有強正電荷的蛋白或/和N末端氨基 酸序列帶有強正電荷的蛋白。 本發(fā)明的發(fā)明思路為堿性蛋白和保護多肽或片段構(gòu)成融合蛋白，通過保護多肽或 片段的保護作用，避免堿性蛋白在原核細(xì)胞內(nèi)被蛋白水解酶降解，而得不到表達(dá)的產(chǎn)物。
堿性蛋白和保護多肽或片段的融合蛋白可具有下式R2-R1、 Rl-R2、 R1-L-R2-L-R1、 Rl-L-R2或R2-L-R1，其中Rl保護多肽或片段，L是接頭肽，R2是至少一個 堿性蛋白。接頭肽包括例如(GGGGS)N或(GGGS)N或(GGS)N，其中N是大于或等于1的整 數(shù)，G表示甘氨酸，S表示絲氨酸。最優(yōu)化為在堿性蛋白和保護多肽或片段融合蛋白中，堿性 蛋白和保護多肽或片段間帶有位點專一性蛋白酶識別位點，使保護多肽或片段可以被完全 去除。
在一些實施方式中，所述保護多肽或片段可為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione_S_transferase， GST)，轉(zhuǎn)錄延長因子(transcription elongation factor,Nus)，硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxB)或者是麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose-bindi卿rotein， MBP)等。 在一實施方式中，所述重組堿性蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白 (a)其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列
60%同源性的蛋白。 在一實施方式中，所述表達(dá)載體為pET43. la表達(dá)載體。 在一實施方式中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌。 在一實施方式中，所述酶為凝血酶、腸激酶或Xa因子。 在一實施方式中，所述純化采用鎳柱進(jìn)行親和層析分離純化。 另一方面，本發(fā)明還公開了按照上述制備方法生產(chǎn)的堿性蛋白。 本發(fā)明所提供原核表達(dá)體系高表達(dá)堿性蛋白的方法，為堿性蛋白生物制備提供一
條廉價、方便的生產(chǎn)方法。


圖1PCR擴增的多聚精氨酸-凋亡素基因片段1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜； 圖2表達(dá)質(zhì)粒R9-Apop-pET43. la構(gòu)建過程示意圖； 圖3表達(dá)的Nus-R9-Apoptin重組蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜； 圖4表達(dá)的Nus-R9-Apoptin重組蛋白Western雜交電泳圖譜； 圖5純化的重組Nus-R9-Apoptin重組蛋白SDS-PAGE電泳分析圖譜； 圖6不同濃度重組多聚精氨酸_凋亡素對Hela細(xì)胞的存活率的影響。
具體實施例方式
在本文，蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh， 1970)分析(GCG程序)石角定，其中參數(shù)g即creation penalty = 5，g即extension penalty = 0. 3。被分析的序列長度至少為15個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為15個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為50個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為50個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為100個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為100個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為250個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為250個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為500個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為500個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。
融合蛋白的表達(dá) 本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明中，使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"(transformant)，即帶有異源DNA分子的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明還包括通過合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白的方法。通過本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉(zhuǎn)化體和生物體。
用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達(dá)多核苷 酸的宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。 一般說來，多核苷酸和/或載體可用于 任何原核細(xì)胞，如大腸桿菌。有關(guān)適用于多種類型宿主細(xì)胞的適當(dāng)載體的例子可參見例 如F. Ausubel et al. ， Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)?？梢允褂煤羞@ 些多核苷酸的宿主細(xì)胞來大量表達(dá)可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。
已開發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例 如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補的同聚體序列片段。然后通過互補同聚體 尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。 含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。 用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的 DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3' ，5'-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其 聚合活性補平3'-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4 DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與大摩爾過量的接頭分子 一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?裂解這些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達(dá)載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容 的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內(nèi)切核酸酶位點的合成接頭。
多核苷酸插入物應(yīng)該可操作地連接于同表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)啟 動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導(dǎo)型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌 體A PL啟動子、大腸桿菌lac、 trP、phoA、 tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄 病毒LTR啟動子。其它適當(dāng)啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達(dá)重組載體進(jìn)一步含有轉(zhuǎn) 錄起始、終止位點，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。重組載體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的 編碼部分可包括位于起點處的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密 碼子(UAA， UGA或UAG)。 如上所述，表達(dá)載體可包括至少一個選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括用于大腸桿菌和其 它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不 限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基 和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。 為了有效地分離純化或分泌目標(biāo)蛋白，常常還可利用便于分離純化的標(biāo)簽蛋 白或標(biāo)簽多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)、六聚組氨酸肽(His. Tag)、蛋白質(zhì)A(protein A)和纖維素結(jié)合位點(cellulose binding domain)等。通過特殊性蛋白或多肽與目標(biāo)蛋白構(gòu)成融合蛋白的形式，表達(dá)后利 用所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽的特殊性質(zhì)可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和純化。如His. Tag與 Ni-ChelatingS印harose柱特異性結(jié)合。所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽可以在純化后用位點 特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和Xa因子等，以獲得目標(biāo)蛋白。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列經(jīng)本領(lǐng)域已 知的技術(shù)與一或多種異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強子)可操作相連?？梢赃x擇能調(diào)節(jié) 插入的基因序列的表達(dá)，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動子啟動的表達(dá)會升高；因此，可以控制經(jīng)基因改造的多肽的表 達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質(zhì)的機制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系以確保對表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行合乎需要的修飾和 加工。 通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述方 法描述于多個標(biāo)準(zhǔn)的實驗室手冊中，如Davis et al. ， Basic Methods In Molecular Biology (1986)。 編碼本發(fā)明的所述融合蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿 主中增殖。 一般說來，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載 體。如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對其進(jìn)行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。
通過眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載 體的細(xì)胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達(dá)重組載體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細(xì)胞， 使用如Southem(1975) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985)Biotech. 3， 208所述的 方法，檢測其DNA內(nèi)容物中DNA的存在?；蛘?，使用抗體檢測上清液中蛋白質(zhì)的存在。
通過眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的所述融合蛋白較 為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素 層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些 實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。 在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發(fā)明的所述融合蛋 白。在其它實施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發(fā)明的所述融合蛋白，所 述層析柱有Q s印harose FF柱、SP s印harose FF柱、Q s印harose High Performance 柱、Blue s印harose FF柱、Blue柱、Phenyl S印harose FF柱、DEAE S印harose FF、 Ni-ChelatingS印harose FF柱或Methyl柱等。 另外，可使用國際
發(fā)明者李素霞, 王富軍, 范立強, 趙健, 高鵬 申請人:華東理工大學(xué)