專利名稱：：一種抗cd25抗體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種改進的大規(guī)模培養(yǎng)工藝高效表達抗體的方法。
背景技術(shù)：
：器官移植是20世紀醫(yī)學(xué)的重大成就之一，是多種臟器終末性疾病目前唯一的治療手段。僅我國每年新增的肝、腎及心臟功能衰竭患者就達數(shù)百萬，其中大部分可通過器官移植延長生命。以腎移植為例，全球目前共累計施行了50余萬名腎移植術(shù)，在中國這一數(shù)字超過了3萬名。2000年中國的腎移植數(shù)突破5000例，僅次于美國，位居世界第二。面對每年新增20萬的尿毒癥患者，同種腎移植已經(jīng)成為治療慢性腎功能衰竭的一種非常重要的手段。我國近年來除傳統(tǒng)的腎移植外，心臟移植、肝臟移植呈加速增長態(tài)勢，2003年一年的肝臟移植例數(shù)超過2000例，比以往各年的總和還要多。影響器官移植療效的主要問題除供體短缺外，即為免疫排斥的問題；而免疫排斥又加重了本已短缺的器官來源。從供體器官來源來分，器官移植可分為同種同基因移植(如自體移植、孿生子之間的移植)、同種異基因移植、以及異種移植。目前絕大多數(shù)臟器移植均為同種異基因移植。由于人體主要組織相容抗原(MHC抗原)的高度多樣性，不可避免地造成供體臟器抗原與受體免疫系統(tǒng)不相容，手術(shù)后產(chǎn)生嚴重排斥反應(yīng)。為維持移植物的存活，移植術(shù)前及術(shù)后必須常規(guī)應(yīng)用免疫抑制劑，抑制免疫系統(tǒng)對移植物的攻擊能力。傳統(tǒng)的免疫抑制劑包括糖皮質(zhì)激素(強的松類)、環(huán)孢菌素A、硫唑嘌呤等小分子化學(xué)藥物。這些藥物的發(fā)明，對器官移植的發(fā)展起到了明顯的促進作用，然而，由于其特異性較低，對肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)的毒性較大，嚴重影響了移植受者的生存質(zhì)量，造成遠期并發(fā)癥如器官功能慢性喪失、易發(fā)感染及腫瘤性疾病等。隨著人們對于免疫應(yīng)答反應(yīng)過程的不斷研究，免疫排斥的機理得到進一步闡明，因此，近年來許多研究者試圖針對免疫排斥過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采取干預(yù)措施，試圖特異性地消除受者免疫系統(tǒng)針對移植物的免疫反應(yīng)，盡可能地保留機體的抗感染、抗腫瘤等免疫功能，同時減少其它毒副反應(yīng)的發(fā)生。急性排斥反應(yīng)是最常見的一種移植排斥反應(yīng)，在未經(jīng)治療者此反應(yīng)可發(fā)生在移植后數(shù)天之內(nèi)；而經(jīng)過免疫抑制治療者，可在數(shù)月或數(shù)年后突然發(fā)生，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、全身不適，移植物腫大和疼痛同時伴有移植物功能突然減退。急性排斥反應(yīng)屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的細胞免疫現(xiàn)象，是移植物的HLA抗原刺激受者T淋巴細胞使之分化增殖，產(chǎn)生大量具有特異性的致敏淋巴細胞，可直接殺傷或通過釋放各種淋巴因子殺傷靶細胞，排斥移植物?，F(xiàn)認為體液免疫也參與急性排斥反應(yīng)。組織病理學(xué)改變?yōu)檠軆?nèi)膜損傷和纖維素樣壞死伴單核細胞浸潤。急性排斥反應(yīng)經(jīng)過及時正確的處理，80-90%能被逆轉(zhuǎn)。白細胞分化抗原CD25，又稱Tac抗原，是白細胞介素-2(IL-2)受體的a亞單位(P55a，Ra亞單位)。T淋巴細胞表面IL-2受體由a(p55)、p(p75)、Y(p64)三個亞單位組成，a亞單位(又稱Tac或CD25)僅表達于激活淋巴細胞表面。正常的IL-2受體是由三個亞單位ou(3、Y三鏈以大量共價鍵組合而成，在靜息T細胞表面表達率很低，活化的T細胞表面則有較充分的表達。其a亞單位是可誘導(dǎo)的，不能被其他受體分占，只能構(gòu)成低親和力受體；卩和Y鍵則能構(gòu)成中等親和力受體，能被其他受體結(jié)合。(x、|3、Y三者的聚合體才能構(gòu)成完整的高親和力受體。作為IL-2的受體，CD25與IL-2結(jié)合后，雖不能傳導(dǎo)信息，但能啟動T細胞進入有絲分裂期。在腎移植受體內(nèi)，由于異體移植腎刺激機體免疫系統(tǒng)，由免疫細胞如T細胞、NK細胞、LAK細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-2能與經(jīng)抗原活化的T淋巴細胞表面的受體(CD25)相結(jié)合，誘導(dǎo)T細胞的快速增殖，產(chǎn)生排斥反應(yīng)。由于CD25主要表達于激活的T淋巴細胞，因此，如果能夠針對CD25分子，設(shè)計特異性的藥物，僅抑制這群T細胞的活性，或清除該群T細胞，則能夠在同種異體器官移植時，特異性地抑制針對移植物的免疫反應(yīng)。單克隆抗體技術(shù)由于其高度的特異性和耙向性，很自然地被列為首選方案。抗CD25單抗與Tac的特異性結(jié)合阻斷了IL-2與IL-2受體復(fù)合物的結(jié)合，從而抑制了IL-2通過高親和性IL-2受體誘導(dǎo)T細胞活化，也就抑制了排斥反應(yīng)過程中細胞免疫的關(guān)鍵通道。其發(fā)揮免疫抑制的主要機制是通過與IL-2受體Tac亞單位的結(jié)合競爭性地抑制IL-2依賴的T細胞增生；在體外可通過抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)引起抗Tac單抗介導(dǎo)的T細胞溶解(這可能是該藥免疫抑制的另一種機制)。間接的免疫調(diào)理機制如IL-2表達水平下調(diào)；通過Fc段及Fc受體相互作用，選擇性地滅活和破壞Tac陽性的淋巴細胞，導(dǎo)致反應(yīng)性T細胞集落被清除，從而增強或放大選擇性的免疫抑制效應(yīng)。然而，鼠源抗體在應(yīng)用于人體時會引起強烈的免疫反應(yīng)，嚴重阻礙了鼠源抗CD25單抗作為新型免疫抑制劑的療效。隨著人源化抗體技術(shù)的成熟，國外研究者對鼠源抗體進行了人源化改造，使其在保持原有特異性的同時，對人體的免疫原性大大降低，從而開發(fā)為理想的抗免疫排斥藥物(Immunosuppressionforneuralxenografts:acomparisonofcyclosporinandanti-CD25monoclonalantibody.HoneyCR,ShenH.JNeurosurg1999Jul;91(1):109隱13.Daclizumab.LindaR.W,DianaF.Drugs1999,58(6):1029-42.Placebo-controlledstudyofahumanizedanti-TACmonoclonalantibo"3yindualtherapyforpreventionofacuterejectionafterrenaltransplantation.CharpentierB，ThervetE.TransplantProc1998Jun;30(4):1331-2)。目前，F(xiàn)DA及歐盟已批準2個抗CD25的單克隆抗體，一種是人源化單抗(Daclizumab);另一種是人一鼠嵌合型抗CD25單抗(Basiliximab)。這兩個抗體均已成功地用于防止腎移植后的急性排異反應(yīng)。其治療指數(shù)寬，不良反應(yīng)小，半衰期長，Basiliximab半衰期約為6天，Daclizumab半衰期超過20天(Daclizumab:outcomeofphaseIIItrialsandmechanismofaction.DoubleTherapyandtheTripleTherapyStudyGroups.VincentiF,NashanB,LightS.TransplantProc1998Aug;30(5):2155-8Reductionofacuterenalallograftrejectionbydaclizumab.DaclizumabDoubleTherapyStudyGroup.NashanB,LightS,HardieIR，LinA,JohnsonJR.Transplantation1999Jan15;67(1):110-5Thesafetyandefficacyofatwo-dosedaclizumab(zenapax)inductiontherapyinlivertransplantrecipients.EckhoffDE,McGuireB,SellersM，ContrerasJ，F(xiàn)renetteL，YoungC，HudsonS，By腿JS.Transplantation2000May15;69(9):1867-72Resultsof3-yearphaseIIIclinicaltrialswithdaclizumabprophylaxisforpreventionofacuterejectionafterrenaltransplantation.BumgardnerGL，HardieI，etc.Transplantation2001Sep15;72(5):839-45.Daclizumab:areviewofitsuseinthemanagementoforgantransplantation.CarswellCI，PloskerGL,WagstaffAJ,BioDrugs2001;15(ll):745-73)。這兩種抗體都是利用基因工程技術(shù)，采用哺乳動物細胞發(fā)酵技術(shù)表達的重組蛋白。Daclizumab(商品名Zenapax)由美國ProteinDesignLabs公司開發(fā)，后將其授權(quán)給Hoffmann-LaRoche(羅氏)公司生產(chǎn)，已于1997年獲得FDA的批準，用于預(yù)防腎移植的急性排斥反應(yīng)。該抗體包含90y。的人IgG序列和10%的鼠序列，其中人序列由人IgGl的恒定區(qū)和Eu骨髓瘤抗體可變框架區(qū)組成，鼠序列由鼠抗Tac抗體的CDR構(gòu)成，分子量144KDa。鑒于Declizumab在臨床前及臨床研究中表現(xiàn)出確切的效果，Zenapax1997年12月10日獲得美國FDA批準上市，適應(yīng)癥為"預(yù)防同種異體腎移植患者的急性器官排斥反應(yīng)，可與包括環(huán)孢素和皮質(zhì)類固醇激素的免疫抑制方案合用"。ProteinDesignLabs在開發(fā)之初，選擇了NSO細胞作為宿主細胞，采用了無血清懸浮批次培養(yǎng)的方式。NSO作為宿主細胞，具有以下先天性的缺陷NSO宿主細胞的a-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶會產(chǎn)生具有高免疫原性的Galal，3-Gal(31，4-GlcNac，這種在人體內(nèi)不存在的糖基化修飾應(yīng)用于人體時，具有刺激機體產(chǎn)生診斷這類異種抗原的免疫反應(yīng)，從而降低藥物的療效，甚至發(fā)生嚴重的過敏反應(yīng)。NSO細胞中，糖基化末端的唾液酸形式主要為N-glyculyl-neuraminicacid(NGNA)(N-乙酰神經(jīng)氨酸)，與人體的N-acetyl-neuraminicacid(NANA)(N-乙酰神經(jīng)氨酸)不同，因此利用NSO細胞作為宿主細胞培養(yǎng)得到的抗CD25單抗用于人體后也具有潛在的免疫原性，可能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而影響療效甚至發(fā)生過敏反應(yīng)。NSO細胞內(nèi)具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒，在以該細胞作為宿主細胞的抗CD25單抗工業(yè)化制備的過程中，大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒分泌到培養(yǎng)上清中，如果終產(chǎn)品中殘留有未清除獲滅活的病毒，會導(dǎo)致臨床治療中不確定的風(fēng)險。因此下游的純化過程需要通過非常復(fù)雜的步驟去除或滅活上清中的病毒，而且這些步驟必須通過有效的驗證。
發(fā)明內(nèi)容為了克服利用NSO細胞作為宿主細胞培養(yǎng)抗CD25單抗的缺點，需要利用合適的宿主細胞并優(yōu)化培養(yǎng)條件從而減少細胞表達的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高其對人體的安全性。本發(fā)明的發(fā)明人利用CHO細胞作為宿主細胞，并按照2006年10月20日申請的專利申請?zhí)枮?00610147535.7發(fā)明名稱為《采用動物細胞流加培養(yǎng)方式高效表達重組蛋白的方法》中公開的三步流加法培養(yǎng)包含有抗CD25抗體序列的CHO細胞，與利用NSO細胞作為宿主細胞培養(yǎng)相比，結(jié)果顯示，獲得的與人體天然糖基化形式一致的抗體糖基化形式大大增加，從而降低了導(dǎo)致免疫原性的可能，而且半乳糖不完全修飾的比例也顯著降低。經(jīng)檢測證實，構(gòu)建的工程細胞中無內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，利用該工程細胞培養(yǎng)獲得的抗體沒有病毒的污染。本發(fā)明的發(fā)明人對培養(yǎng)方法進行進一步改進，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明公開了一種利用CHO細胞流加培養(yǎng)方式高效表達抗CD25抗體的方法，為三步流加培養(yǎng)法，即a)細胞培養(yǎng)溫度36。C一38。C，PH值6.5—6.9，培養(yǎng)24—48小時，當(dāng)動物細胞生長至2.0—3.5X106cells/ml時，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補加流加培養(yǎng)基，進行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1—0.3/天，流加培養(yǎng)時間72—96小時；b)細胞培養(yǎng)溫度降至32.5。C一35。C，PH值7.0—7.3，進行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1—0.2/天，流加培養(yǎng)時間120—144小時；c)停止流加，細胞培養(yǎng)溫度升至36。C一38。C，PH值7.0—7.3，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24—48小時，其特征在于步驟a)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3—12mmol/L和谷氨酰胺5.0—7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。更優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。通過對培養(yǎng)過程中培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化的比例進行檢測，結(jié)果表明無血清培養(yǎng)基中添加半乳糖可以顯著增加G2型糖基化的比例，從而降低由糖基化差異帶來的免疫原性及抗體的功能差異問題。培養(yǎng)過程及產(chǎn)品的病毒檢測通過一系列實驗進行，包括細胞形態(tài)觀察、紅細胞吸附試驗、傳代細胞培養(yǎng)、透射電鏡檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒、動物和雞胚試驗、動物抗體產(chǎn)生試驗、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定實驗，結(jié)果表明CHO細胞均為陰性，達到了本發(fā)明的目的。圖l:CHO細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測結(jié)果。圖2:NSO細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測結(jié)果。具體實施方式以下實施例、實驗例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實施例、實驗例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。實施例l真核表達載體的構(gòu)建抗體序列參見，中國發(fā)明專利申請?zhí)?9109618.3，發(fā)明名稱為《新的白細胞介素-2受體特異性免疫球蛋白》中公開的序列。表達載體的構(gòu)建方法參見中國發(fā)明專利申請?zhí)?2112493.0，發(fā)明名稱為《重組的抗CD25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》中公開的方法。實施例2人源化抗體的穩(wěn)定表達與純化參見中國發(fā)明專利申請?zhí)?2112493.0，發(fā)明名稱為《重組的抗CD25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》中公開的方法。實施例3優(yōu)化的大規(guī)模無血清培養(yǎng)采用專利200610147535.7"—種高效表達重組蛋白的方法"中三段流加法進行，培養(yǎng)過程中，發(fā)酵參數(shù)進行了以下的優(yōu)化在步驟l)中，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。實施例4優(yōu)化的大規(guī)模無血清培養(yǎng)采用專利200610147535.7"—種高效表達重組蛋白的方法"中三段流加法進行，培養(yǎng)過程中，發(fā)酵參數(shù)進行了以下的優(yōu)化步驟l)中，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3mmol/L和谷氨酰胺5.0mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.5-0.6g/L。實施例5優(yōu)化的大規(guī)模無血清培養(yǎng)釆用專利200610147535.7"—種高效表達重組蛋白的方法"中三段流加法進行，培養(yǎng)過程中，發(fā)酵參數(shù)進行了以下的優(yōu)化步驟l)中在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20mg/Lmg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖12mmol/L和谷氨酰胺7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在2.0g/L。對實施例35得到的產(chǎn)品進行檢測，結(jié)果表明，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度通過在線監(jiān)測，PID控制葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L，葡萄糖濃度在此范圍有利于葡萄糖的完全利用及較少的乳酸堆積，使培養(yǎng)過程pH維持在較好的狀態(tài)。實驗例l培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化比較按實施例3、實施例4、實施例5步驟進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后產(chǎn)物糖基化比較(利用BECKMAN毛細管電泳結(jié)合BECKMAN糖基化檢測試劑盒(BeckmanCoulter,477600)按說明書中的方法進行操作)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表格中數(shù)值為各種糖基化形式所占的百分含量，其中G2型為最完整的糖基化形式。各種糖基化形式的結(jié)構(gòu)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>無血清培養(yǎng)基中添加半乳糖，可以顯著增加G2型糖基化的比例，這種完全半乳糖化形式與人體內(nèi)天然的糖基化形式一致，從而降低由糖基化差異帶來的免疫原性及抗體的功能差異問題。實驗例2培養(yǎng)過程及產(chǎn)品的病毒檢測NSO及CHO(按實施例35步驟進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后得到的產(chǎn)物)細胞病毒檢測結(jié)果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>紅細胞吸附試驗—+傳代細胞培養(yǎng)—+透射電鏡檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(透射電子顯微鏡觀察)-+動物和雞胚試驗—+動物抗體產(chǎn)生試驗—+逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定—+相關(guān)實驗方法按國家食品藥品監(jiān)督管理局《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術(shù)審評一般原則》、《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》進行，方法參照《中華人民共和國藥典》三部附錄?！吨腥A人民共和國藥典》三部附錄IXM逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢査法。《中華人民共和國藥典》三部附錄xnc病毒外源因子檢查法?！吨腥A人民共和國藥典》三部附錄XIIH鼠源性病毒檢査法。逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測結(jié)果見圖1、圖2，結(jié)果表明，CHO細胞中未見逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，NSO細胞中，可見大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(圖中黑色的小點)。權(quán)利要求1.一種抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a)細胞培養(yǎng)溫度36℃-38℃，PH值6.5-6.9，培養(yǎng)24-48小時，當(dāng)動物細胞生長至2.0-3.5×106cells/ml時，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中補加流加培養(yǎng)基，進行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1-0.3/天，流加培養(yǎng)時間72-96小時；b)細胞培養(yǎng)溫度降至32.5℃-35℃，PH值7.0-7.3，進行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1-0.2/天，流加培養(yǎng)時間120-144小時；c)停止流加，細胞培養(yǎng)溫度升至36℃-38℃，PH值7.0-7.3，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24-48小時；其特征在于，在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20～100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3-12mmol/L和谷氨酰胺5.0-7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。2.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。3.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3mmol/L和谷氨酰胺5.0mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.5-0.6g/L。4.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖12mmol/L和谷氨酰胺7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在2.0g/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，在三段流加培養(yǎng)的基礎(chǔ)上在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20～100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3-12mmol/L和谷氨酰胺5.0-7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。利用本發(fā)明公開的培養(yǎng)方法可以減少細胞表達的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高培養(yǎng)產(chǎn)物對人體的安全性。文檔編號C12P21/08GK101624614SQ200910057759公開日2010年1月13日申請日期2009年8月14日優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日發(fā)明者何進秋,盛侯,郭亞軍,郭懷祖,錢衛(wèi)珠申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司