專利名稱：一種高對映體選擇性環(huán)氧化物水解酶及其編碼的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白腐真菌黃孢原毛平革菌(戶/7a"m^aete cA，o印on'臓 BKM-F1767)來源的具有對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶，包括這種環(huán)氧化物水解酶的核苷酸序列及重 組環(huán)氧化物酶，以及重組酶在手性環(huán)氧化物外消旋混合物拆分及不對稱催化方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)氧化物水解酶(Epoxide hydrolase EC 3.3.2.3)是一類催化環(huán)氧化物水解生成相應(yīng)的鄰二醇的一類酶 的總稱，在酶學(xué)分類上，環(huán)氧化物水解酶與酯酶，蛋白酶，脂肪酶，脫鹵素酶等同屬于a/p折疊類水解 酶(Fretland and Omiecinski, 2000)。環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，并在多種動物，植物，細菌 及真菌中發(fā)現(xiàn)(Barth ef a/. 2004a，b)，在不同的生物體內(nèi)發(fā)揮不同的生理功能，主要包括參與哺乳動物 內(nèi)源或外源毒性物質(zhì)的分解代謝；植物中參與角質(zhì)的合成，并與某些脅迫反應(yīng)(干旱脅迫，病原體侵染) 相關(guān)；在昆蟲中，參與昆蟲激素的代謝并控制昆蟲的發(fā)育。此夕卜，在人體內(nèi)環(huán)氧化物水解酶與多種疾病， 如炎癥反應(yīng)、癌癥、高血壓等有相(Morisseau and Hammock, 2005)。
光學(xué)純的環(huán)氧化物及其鄰二醇是有機合成工業(yè)中的重要的中間體，在制藥，精細化工，農(nóng)藥等領(lǐng)域 具有廣泛的用途(Archdas. andFurstoss, 1998)。目前光學(xué)純的環(huán)氧化物或鄰二醇的制備主要有不對稱化學(xué) 催化和生物轉(zhuǎn)化兩種方法。在化學(xué)催化中，應(yīng)用合適的催化劑進行不對稱環(huán)化反應(yīng)或水解反應(yīng)可以獲得 某一構(gòu)型環(huán)氧化物及其鄰二醇，但是也存在著許多問題，如催化反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)底物狹窄、催化劑 中重金屬污染等。生物轉(zhuǎn)化依賴于環(huán)氧化物水解酶在催化環(huán)氧化物水解的過程中對底物具有特異的立體 化學(xué)選擇性，這一特點使環(huán)氧化物水解酶在反應(yīng)過程中對手性環(huán)氧化物不同的對映異構(gòu)體具有不同的反 應(yīng)速率，在一定的反應(yīng)條件下利用催化反應(yīng)動力學(xué)的差異，可以將某一環(huán)氧化物外消旋混合物中的某一 構(gòu)型的對映體水解而保留另一構(gòu)型的對映體從而獲得單一構(gòu)型的環(huán)氧化物，不但實現(xiàn)手性環(huán)氧化物水解 酶的動力學(xué)拆分，而且利用這種立體化學(xué)選擇性也可獲得特定構(gòu)型的鄰二醇產(chǎn)物(De Vries and Janssen， 2003)。與化學(xué)催化相比較而言，酶催化過程條件溫和，幾乎無環(huán)境污染，符合"綠色化學(xué)"的趨勢，因此 利用環(huán)氧化物水解酶對制備光學(xué)純的環(huán)氧化物或鄰二醇是一種極具潛力的方法(Archelas. and Furstoss, 2001)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)光學(xué)純的手性環(huán)氧化物及其鄰二醇逐漸得到重 視并逐漸成為研究熱點。
微生物是環(huán)氧化物水解酶的重要來源。由于微生物豐富的多樣性、生長速度快、易于培養(yǎng)和產(chǎn)量高 等優(yōu)點，從微生物來源獲得環(huán)氧化物水解酶是目前主要的途徑，大量的研究集中在從微生物中篩選滿足 工業(yè)應(yīng)用要求的環(huán)氧化物水解酶，并且取得了一些進展(Steinreiber and Faber， 2001)。國內(nèi)外有大量關(guān) 于產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶微生物篩選，環(huán)氧化物酶純化及基因克隆，表達的文獻報道。而且從自然界微生物 中篩選到一些對特定環(huán)氧化物具有高對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶，并對這些酶的催化性質(zhì)進行了系 統(tǒng)的分析。不同來源的環(huán)氧化物水解酶在底物特異性、對映體選擇性、催化效力等方面存在顯著的差異 (Smit and Labuschagn6, 2006)。目前在市場上己有來源于黑曲霉Usp"gz7/ws m'ge。，放射土壤桿菌 Ugro&a"OT'wmrac /ok cto"),紫紅紅球菌(i tocfococcws t^oc/ocAtom)及人的環(huán)氧化物水解酶酶制劑產(chǎn) 品出售，但是一方面這些環(huán)氧化物水解酶的底物作用范圍有限，另一方面這些酶制劑產(chǎn)量小并且價格十 分昂貴，無法滿足大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的要求。除了直接從自然界中篩選之外，利用分子進化技術(shù)對天然的 環(huán)氧化物水解酶進行改造以提高天然環(huán)氧化物水解酶酶的酶學(xué)性質(zhì)尤其是對映體選擇性，通過一系列改 造也獲得了一些酶學(xué)性質(zhì)得到顯著改善的突變酶。
黃孢原毛平革菌(iVraieroc/jaefe c/H^sosporz.""1)屬于白腐擔(dān)子真菌'c/uysos/w7'm附是研究木質(zhì)素 降解機制的模式生物，在戶c/^^m;w/ww中存在多個可能的環(huán)氧化物水解酶編碼基因，這一方面說明 環(huán)氧化物水解酶參與的代謝的復(fù)雜性，另一方面也提供一個篩選具有高對映體選擇性環(huán)氧化物水解酶的 來源。由于有研究表明真菌來源的環(huán)氧化物水解酶往往對底物具有較高的對映體選擇性(Smit， 2004)。因 此，從P cV^o^ori"w中可能篩選到具有高對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶。本發(fā)明首次從尸. a，o印on'w"克隆表達了一個環(huán)氧化物水解酶基因，并對重組酶的催化性質(zhì)進行了詳細的分析研究。結(jié)果表明，該環(huán)氧化物水解酶對供試的幾種環(huán)氧化物表現(xiàn)出不同的水解效率，而且也對幾種供試的R/S型 對映體表現(xiàn)出程度不同的水解。因此，該環(huán)氧化物水解酶在環(huán)氧化物的手性折分和不對稱催化方面具有 極大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
為了尋找能夠滿足生物催化要求具有高對映體的環(huán)氧化物水解酶，本發(fā)明通過基因工程技術(shù)從白腐
真菌黃孢原毛平革菌〔P. C/77^0^0T^"7)獲到一個對多種類型的環(huán)氧化物具有催化活性并對環(huán)氧苯乙烷
具有高對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶PchEHA。本發(fā)明從尸cA，o^oh, BKM-F1767克隆獲得了該 環(huán)氧化物水解酶PchEHA基因完整的編碼區(qū)序列，將編碼區(qū)序列克隆到pMD18-T載體中，并對PchEHA 編碼區(qū)進行了序列測定，如序列表SEQ ID NOl所示，PchEHA編碼區(qū)長1005 bp,編碼334個氨基酸殘基。 本發(fā)明的另一個目的是提供包括環(huán)氧化物水解酶PchEHA基因的表達載體，在獲得完整正確的 PchEHA編碼區(qū)序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建了含PchEHA基因編碼區(qū)的原核表達質(zhì)粒pET28EHA。將pET2犯HA 轉(zhuǎn)化五.co/!'BL(DE3)菌株,獲得了表達PchEHA的基因工程菌株五.co/Z BL(DE3)/pET28EHA,該菌株經(jīng)過 培養(yǎng)，基因誘導(dǎo)表達操作獲得了具有生物學(xué)活性的重組環(huán)氧化物水解酶，因此，本發(fā)明的再一目的是提 供了包含SEQ ID N02所示氨基酸序列的重組環(huán)氧化物水解酶。所以包含本發(fā)明所述基因的表達載體及 細胞株系均屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明中的環(huán)氧化物水解酶的氨基酸序列不僅包括SEQIDN02所示的序列，而且包括由SEQID N02所示的序列經(jīng)過一個或數(shù)個氨基酸殘基突變、添加、缺失衍生出的且具有與PchEHA相同催化性質(zhì) 的蛋白質(zhì)。除此之外本發(fā)明中SEQ ID NOl所示環(huán)氧化物水解酶基因序列可以通過常規(guī)的分子生物學(xué)操 作連接于各種商品化的表達載體和其他表達載體上，并在適宜的宿主細胞中實現(xiàn)表達，從而獲得包含 SEQ ID N02所示氨基酸序列的重組酶。因此本發(fā)明亦提供了構(gòu)建包含SEQ ID NOl所示序列及其衍生 序列的其它表達質(zhì)粒的可能，包括原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)的表達質(zhì)粒。因此利用這些表達載體構(gòu)建的包含 SEQ ID NOl序列或由PchEHA衍生的序列的表達質(zhì)粒中的環(huán)氧化物水解酶編碼序列亦屬于本發(fā)明的保 護范圍。
本發(fā)明中的重組酶可以通過將pET28EHA轉(zhuǎn)化￡. c^BL(DE3)菌株，并對準(zhǔn)化細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后， 從宿主細胞中純化得到重組的環(huán)氧化物水解酶。獲得的重組蛋白對多種環(huán)氧化物表現(xiàn)出催化活性，對測 試的環(huán)氧化物表型出不同程度的對映體選擇性，并且對環(huán)氧苯乙烷兩種不同構(gòu)型的對映體表現(xiàn)出高的對 映體選擇性。因此本發(fā)明中的重組環(huán)氧化物水解酶可以應(yīng)用于手性環(huán)氧化物外消旋混合物的動力學(xué)拆分， 制備光學(xué)純的環(huán)氧化物，除此之外，本發(fā)明中的高對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶還可應(yīng)用于環(huán)氧化物 的不對稱催化。


圖1環(huán)氧化物水解酶的誘導(dǎo)表達和純化結(jié)果圖。其中泳道1是蛋白質(zhì)Marker;泳道1是五.co/i BL21(DE3)/pET28EHA未誘導(dǎo)的上清蛋白；泳道3是經(jīng)IPFG誘導(dǎo)后的上清蛋白；道3是經(jīng)親和層析純 化后重組酶。
圖2重組環(huán)氧化物水解酶對幾種環(huán)氧化物的水解。水解反應(yīng)體系為150 nl的0.1 M Tris-HCl緩沖 液(pH9.0);反應(yīng)溫度37。C，時間30min。重組環(huán)氧化物水解酶的用量分別是10， 20和40嗎(從左到 右)；底物濃度分別為環(huán)氧苯乙垸30mM (A)，環(huán)氧氯丙烷12 mM (B) ， 1,2-環(huán)氧丁烷120mM (C)。 水解反應(yīng)起始時的數(shù)量計為100%。
圖3重組環(huán)氧化物水解酶對四種11-/5-型環(huán)氧化物對映體的選擇性水解。水解反應(yīng)在150 pl的O.l M Tris-HCl緩沖液(pH9.0);反應(yīng)溫度37 。C,時間30min。 11-/3-型底物濃度分別為環(huán)氧苯乙烷30mM (A)， 環(huán)氧氯丙烷15mM (B) , 1,2-環(huán)氧丁烷200mM (C)，對甲苯磺酸縮水甘油酯12 mM (D)。水解反應(yīng)起始 時的數(shù)量計為100%。對環(huán)氧苯乙烷底物，重組酶的用量左圖為20pg，右圖為40^ig;對其他環(huán)氧化物底物，酶的用量左圖為60船右圖為120嗎。
圖4重組環(huán)氧化物水解酶對R-ZS-型環(huán)氧苯乙烷(上圖)和R/S型對甲苯磺酸縮水甘油酯(下圖) 的水解動力學(xué)。水解反應(yīng)在150)J的0.1MTris-HCl緩沖液(pH9.0);反應(yīng)溫度37 。C;對R-ZS-型環(huán)氧 苯乙烷底物，酶的用量為10嗎，對R/S型對甲苯磺酸縮水甘油酯，酶的用量為40昭；〇表示(R)型環(huán)
氧化物，o表示(s)型環(huán)氧化物。
具體實施例方式
實施例l:從i c/z/ywwpoWtfw中克隆環(huán)氧化物水解酶PchEHA編碼區(qū)序列 c/z 7 m/W7'ww BKM-F1767的培養(yǎng)及RNA提取將P. c/w"c pon'iOT BKM-F1767接種于PDA平 板上，38。C培養(yǎng)5天，待平板上形成大量的分生孢子后，用0.P/。的無菌Tween-20溶液將孢子從平板上 洗下，渦旋分散后紗布過濾。濾過液4000 rpm離心5 min，用無菌水洗滌2次，重新懸浮孢子，將濃度 調(diào)節(jié)到A,-l.O。將制備好的孢子懸液50mL的Kirk低氮培養(yǎng)基中，分別接種3ml孢子懸液，39。C充 氧靜置培養(yǎng)，設(shè)置3個平行樣，在培養(yǎng)后第48 h和72 h，過濾收集菌絲體用于提取細胞總RNA。尸. c/i，o5pon',總RNA使用TRIZOL試劑盒(Iiwitrogen公司)提取，操作步驟參照試劑盒說明書進行， 將提取的RNA用DNase I (TakaRa公司)處理除去DNA后，溶解于去離子甲酰胺中，—20 °C條件下保存。 RNA的質(zhì)量和濃度分別用甲醛變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定。
RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄參照寶生物工程(大連)有限公司Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒的操作說明 進行，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品為模板，釆用常規(guī)PCR方法從中擴增PchEHA， PCR引物設(shè)計參考聯(lián) 合基因研究所(Joint Genome Institute,〗GI)中尸/z朋erac/K^e c/!r;^aypor/Mm v2.0數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的P. c/^mspon'ww RP78中的 一 個環(huán)氧化物水解酶基因序列(Phchrl/scaffold—15:590151-59130 , gene model:fgeneshl_pg.C—scaffold_15000173)。引物序列為(由上海生物工程有限公司合成)。 上游序列5'-CGGATCCATGGACGCGAGCCTCTTCAAG-3'(畫線部分為萬amHI位點)
下游序列5'-CAAGCTTCTACTGTCCTCCTGAGGCGAAGC-3'(畫線部分為歷"dIII位點)
PCR反應(yīng)反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3分鐘，94。C變性30s， 56 °C退火30s ， 72 °C延伸1分鐘， 循環(huán)30次，最后72 °C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用0.8°/。瓊脂糖電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒(上海 生工)回收目標(biāo)片段，將回收的片段連入pMD18-T載體中(TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化￡. co/!'JM109感受態(tài)細 胞，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒用SamHI和Mmffll (TaKaRa公司)進行酶切驗證，重組質(zhì)粒中插 入序列再經(jīng)測序鑒定，得到含PchEHA編碼區(qū)序列的質(zhì)粒pTEHA。 PchEHA編碼區(qū)序列如序列圖SEQ ID NOl所示，推導(dǎo)的氨基酸序列如SEQ IDN02所示。
實施例2:環(huán)氧化物水解酶PchEHA表達載體的構(gòu)建
用SamH I和M d III對質(zhì)粒pTEHA進行雙酶切，瓊脂糖電泳檢測后回收其中環(huán)氧化物_Pc/2EHA的 編碼區(qū)片斷，將pET-28a (+) (Novagen公司〉用丑鵬H I和歷"d III進行酶切并進行膠回收以制備載體。 將回收的環(huán)氧化物Pc/zEHA的編碼區(qū)片斷與制備的pET-28a ( + )載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co// JM109，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)電泳檢測確定含有插入片斷的 質(zhì)粒用AwHI和歷"dm進行酶切鑒定。從而得到含PchEHA的表達質(zhì)粒，并將其命名為pET28EHA。
實施例3:環(huán)氧化物水解酶PchEHA在大腸桿菌中的表達及純化
將重組表達質(zhì)粒pET28EHA轉(zhuǎn)化￡. co/i BL21 (DE3)感受態(tài)細胞得到表達重組酶的基因工程菌株￡. coZ!'BL21 (DE3)/pET28EHA、過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)表達操作參照PET System操 作手冊。具體步驟為將含有pE28EHA的五.co" BL21(DE3)單菌落接種于3 ml LB液體培養(yǎng)基(含50 ng/ml 卡那霉素)中，37 °C條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；取2.5 ml培養(yǎng)液(1%)接入到250 ml新的LB液 體培養(yǎng)基中(接種8瓶，共2 L), 37 。C條件下；220 r/min振蕩培養(yǎng)至ODaro約為0.5;加入0.5 mM IPTG, 在18。C條件下誘導(dǎo)表達；培養(yǎng)16—20h后，離心10分鐘(4000 r/min)收集菌體，將細菌細胞重懸于25 ml細胞破碎緩沖液中[20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 10% glycerol (V/V)];將細 胞懸液置于冰水中，用壓力細胞破碎儀或超聲波破碎細胞，在4。C條件下10000 rpm/min離心5 min， 轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中。對裂解液上清進行SDS-PAGE (12%)檢測重組蛋白的表達(見附圖l)。
重組環(huán)氧化物水解酶PchEHA的純化使用通用電器公司〔GE)的AKTA primer層析系統(tǒng)。簡要操作 步驟如下用10x柱體積(CV)水洗滌HitrapTM柱(Amersham公司)，將0.1 mol/L的NiS04過柱，流 速1 mL/min;電導(dǎo)指示平衡后，用10xCV水洗滌，再用10xCV的緩沖液A
0。/。甘油(V/V)]平衡，流速為1 mL/min;平衡完成后將細胞破碎液上 清上樣(上樣前10000 r/min離心5分鐘)，流速為1 ml/min。用10xCV的緩沖液A洗脫雜蛋白，流速為 lml/min;然后利用混合梯度洗脫目標(biāo)蛋白，洗脫液中咪唑濃度從0 mM漸升到500 mM，洗脫流速為1 ml/min，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液。收集的洗脫液放入透析袋中在1 L透析液(50 mM磷酸鉀鹽緩沖液， pH7.5, 1 mM DTT, 0.1 mMEDTA)中透析24 h,中間換透析液次。透析后將洗脫液凍干，保存于4 。C, 稱取適量凍干的蛋白質(zhì)溶于保存緩沖液[IOO mM磷酸鉀鹽緩沖液，pH 7.5, 50%甘油(V/V)]。利用 SDS-PAGE (12%)檢測重組蛋白的純度以及蛋白質(zhì)濃度，定量以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Alphalmager軟件 分析計算。環(huán)氧化物水解酶誘導(dǎo)表達及純化過程見附圖1。
實施例4:重組環(huán)氧化物水解酶PchEHA的酶學(xué)性質(zhì)鑒定
環(huán)氧化物水解酶活性測定方法參照文獻[唐燕發(fā)等，分析科學(xué)學(xué)報(2002) 18:142-145]進行，其原理 為4-(對硝基)芐基吡啶與環(huán)氧化物反應(yīng)后生成的中間體經(jīng)堿化可產(chǎn)生藍色、紫色或棕色芳甲烷類染料,利 用此顯色反應(yīng)可測定環(huán)氧化物的含量。以不含環(huán)氧化物水解酶的樣品為空白對照，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線 計算反應(yīng)后體系中剩余的環(huán)氧化物的量，從而根據(jù)環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧化物減少的量來計箅環(huán)氧化 物的酶活性。具體步驟為:在1.2ml的反應(yīng)體系(O.lMTris-HCl)中，加入適量的環(huán)氧苯乙烯，環(huán)氧氯 丙烷，環(huán)氧丁烷，對甲苯磺酸縮水甘油(四種底物均溶于二甲基亞砜中)及其R-ZS-型兩種對映體，最后 加入適量的重組酶啟動水解反應(yīng)。在不同的反應(yīng)時間，從反應(yīng)體系中取出15(Hil的反應(yīng)液，加入等體積 的50mmolZL4-(對硝基)芐基吡啶；混合均勻后，在80 。C水浴反應(yīng)10 min,立即置于流水中冷卻至 室溫。吸取200 ^反應(yīng)液加入到2.8 ml的0.1 M磷酸鉀鹽緩沖液(pH=8.0)中，混合均勻，再加入1 ml 試劑B (40 Q/。三乙胺(v/v)顯色。測定A565的光密度值并記錄數(shù)據(jù)。
實驗結(jié)果表明PchEHA對環(huán)氧苯乙烯，環(huán)氧氯丙烷，環(huán)氧丁烷均具有活性(見附圖2)，并且對這 些環(huán)氧化物的R/S型對映體表現(xiàn)出不同程度的催化選擇性(如附圖所示3)。進一步的動力學(xué)分析表明， 重組的環(huán)氧化物水解酶對&-/8-型環(huán)氧苯乙烷兩種對映體表現(xiàn)出高度的選擇性，因為對R型對映體的催 化活性明顯大于S-型(如附圖4上所示)，因此可以應(yīng)用于環(huán)氧苯乙烷類環(huán)氧化物外消旋混合物的動力 學(xué)拆分，用以制備光學(xué)純的環(huán)氧化物對映體。但該酶對R/S型對甲苯磺酸縮水甘油酯的選擇性較低(如 附圖4下所示)，這也反映了環(huán)氧化物水解酶對不同底物的特異性。
以環(huán)氧苯乙烷為底物，對PcliEHA的酶學(xué)性質(zhì)進行了分析，結(jié)果表明該酶的最適反應(yīng)溫度為40。C， 最適pH值為9.0。在濃度為2 mM的條件下，金屬離子Mg2+, Al3+, Mn2+, Ca2+, Ba2+, Fe2+, Fe3+, <202+對 PchEHA酶的催化活性影響不明顯，而Cu2+, Hg2+, 0(12+對PchEHA具有較強的抑制作用。在反應(yīng)體系有 機溶劑含量為10% (V/V)的條件下，丙酮，二甲基亞砜，乙醇，甲酰胺對酶催化活性影響不明顯，甲 醇，乙腈對酶活性具有中等強度抑制作用，PchEHA對金屬離子鰲和劑(EDTA-Na2， 5 mM)不敏感，氧化 劑過氧化氫(H202， 5mM)對酶活性具有較弱的抑制作用。
參考文獻
(1) Archelas, A and Furstoss, R.(〗998) Epoxide hydrolases: new tools for the synthesis of fine organic chemicals, 7)'ewd5 5!'ofec/wioL 16:108-16.
(2) Archelas， A and Furstoss, R. (2001) Synthetic applications of epoxide hydrolases. Cwrr. 0/5!'m. CTzewj. _B!'oZ. 5:112-119.
(3) Barth， S.; Fischer, M.; Schmid, R. D.， Pleiss， J. (2004a) The database of epoxide hydrolases and
6haloalkane dehalogenases: one structure, many functions. 5fo/"ybnwa"os 20, 2845-2847.
(4) Barth, S.; Fischer, M.; Schmid, R. D.; Pleiss，丄(2004b). Sequence and structure of epoxide hydrolases: a systematic analysis.尸r她z'肌55:846-855.
(5) De Vries， E. J.; Janssen, D. B. (2003) Biocatalytic conversion of epoxides. C群.說'她c/wo/. 14:414420.
(6) Fretland, J.; Omiecinski, C.丄(2000) Epoxide hydrolases: biochemistry and molecular biology. CTze肌
129,41-59.
(7) Morisseau， C.; Hammock, B. D. (2005) Epoxide hydrolase: mechanisms， inhibitor designs, and biological ro]es.^打w, i ev. P/2a廠mc Tbx/co/. 45:311-333.
(8) Smit, M. S. (2004) Fungal epoxide hydrolases: new landmarks in sequence-activity space, rrazcfe 5/o&c/2to/. 22:123-129
(9) Smit， M. S.; Labuschagn6, M. (2006) Diversity of epoxide hydrolase biocatalysts. Cw/r, Org. C/^tw/s/tj 10:1145-1161.
(10) Steinreiber, A.; Faber， K. (20010 Microbial epoxide hydrolases for preparative biotransformations. Cwzr.
萬/她c/z"o/. 12:552-558.序列表
<110>四川人學(xué)
<120> —種高對映體選擇性環(huán)氧化物水解酶及其編碼的基因
<160>2
<210> 1 <211>麵 <212> DNA
<2]3>黃孢原毛平革菌BKM-F1767 (i5c/z,7 w;wn'wm BKM-F1767)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1005)
<400> ]
ATGGACGCGAGCCTCTTCAAGGACTTCAAGACCTCCCGCGGCTTCAACTACCACTACTTC60
TACTCGCCCGCGAAGGGCCCGAGGCCCACGCTCTTCTTCCTCCATGGGAACCCCAGCGTC120
GCCACGGATTGGC;CGCAGATCGTGCCGCACTTCACAAGCAGGGGTTACGGtgtcctcgcg180
CCCGACATGCTGGGATACGGAGACACCGACAAGCCGACGGACCCGGCGTTGTATGTCTCG240
AGCGGCATGTGCAGGAACCTCGTCGACCTCCTGGACCATGAGGGCCTCGAGAAGGTCATC300
GCAATCGGCCATGACTGGGGCTGCTTGTCGGTCTCGCGACTGGCGAGCTATTATCCCGAA360
CGGGTCATCGCGTATGCCTTCCTTGCAGCGTCCTTCATCGGCCCCATCCCGCCCATCCCC420
TTCGACGCTTTCCTGGAATACATCAAGCAGCAGGTGGGGTACGAGCTGTACGGCTACTGG480
AAGTTCTACAGC(.;AGCCTGGCCTGGACCAGTTCGTGCGGGACCACTTGGATACGTTCCTG540
AGTATCCTCTGGCCCAGCGACCCCGCCGTCTGGAAGACGCGTCTCGCGCCGACGGGCGCG600
ctgaagcag，'CCGCGCTCGAG(;(;CTGGACGgcgccgctcgcgccgtacatcactgaggaa660
TTCAAGAAGCA(XACGTCGAGC;TTTTCAATAAGAACGGCTTTGAGGCGCCCGCATGCTAC720
TACAGGATCATGACGAGCGGGCTGCAGGCGGAGGACGACAAACAAATCCTACCGGAGCGT780
GCGGTCCCGCCGAAAGATGCGCCCGTGTTCTTCGGCGCGGCMACAAGGACTACATTTGC840
ATCCCCGCGTTGGCGTATGCGACGTTCAAGAAGGACGAGTGGAAGGACCACAAGATCACG900
ATCAAGGAGTACGACGCGGACCACTGGCTGATCCTCTCCCATGCAGACCAGGTCAGTCGG960
gacctggaggc(;tggattga(;(;(;cttcgcctcaggaggacagtag1005
8<160>2
<210〉 2
<211> 334
<212> RPT
<213〉黃孢原毛平革菌BKM-F1767 (尸力a"ei"oc/ sefe c/ /yOT印ori咖BKM-F1767) <220>
<223> (1).. . (334)
<400> 1
MetAspAla SerLeu PheLys AspPhe LysThr Ser Arg Gly Phe
151015
AsnTyrHis Tyr卩he TyrSer ProAla LysGly Pro Arg Pro Thr
202530
LeuPhePhe LeuHis GlyAsn ProSer ValAla Thr Asp Trp Ala
354045
GinlieVal ProHis PheThr SerArg GlyTyr Gly Val Leu Ala
505560
ProAspMet LeuGly TyrGly AspThr AspLys Pro Thr Asp Pro
657075
AlaLeuTyr ValSer SerGly MetCys ArgAsn Leu Val Asp Leu
808590
LeuAspHis GluGly LeuGlu LysVal lieAla lie Gly His Asp
95100105
TrpGlyCys LeuSer ValSer Arg Leu AlaSer Tyr Tyr Pro Glu
110115120
Arg Val]:].e AlaTyr AlaPhe LeuAla AlaSer Phe lie Gly Pro
125130135
lieProPro liePro Phe Asp AlaPhe LeuGlu Tyr lie Lys Gin
140145150
GinValGly 丁yrGlu Leu Tyr GlyTyr TrpLys Phe Tyr Ser Glu
155160165
ProGlyLeu AspGin PheV il ArgAsp HisLeu Asp Thr* Phe Leu
170175180
SerlieIn TrpPro SerAsp ProAla ValTrp Lys Thr Arg Leu
185190195
AlaProThr GlyA]a LeuLys GinSer AlaLeu Glu Gly Trp Thr
200205210
AlaProLeu AlaPro Tyrlie ThrGlu GluPhe Lys Lys His His
215220225
ValGluVal PheAsn LysAsn GlyPhe GluAla Pro Ala Cys Tyr
230235240
TyrArg':1 1 e MetThr SerGly LeuGin AlaGlu Asp Asp Lys Ginlie Leu Pro Phe Gly Ala Tyr Ala 丁hr Ile Lys G3.u Asp Gin Val Ser G丄y Gly
Glu Ala Phe Tyr Ser Gin
245 250 255
Arg Ala. Va,l Pro Pro Lys Asp Ala Pro Val Phe 260 270 275
Asn Lys Asp Tyr lie Cys lie Pro Ala Leu Ala 275 280 285
Lys Lys Asp Glu Trp Lys Asp His Lys lie Thr 290 295 300
Asp Ala Asp His Trp Leu lie Leu Ser His Ala 305 310 315
Arg Asp Leu Glu Ala Trp lie Glu Gly Phe Ala 320 325 330
權(quán)利要求
1.一種來源于真菌黃孢原毛平革菌BKM-F1767株系(Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767)的編碼環(huán)氧化物水解酶的基因，其具有(a)序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)根據(jù)遺傳密碼簡并性由SEQ ID NO1所示核苷酸序列衍生的具有編碼與序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同的多核苷酸序列。
2. 由權(quán)利要求1所示的基因編碼的環(huán)氧化物水解酶，其特征為(a)序列表SEQ ID N02所示的氮基酸序列以及具有與SEQ ID N02所示氨基酸序列至少90%同源性的蛋 白質(zhì)。(c) 將SEQIDN02所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、添加等突變所衍生的具有 相同催化性質(zhì)的蛋白質(zhì)(酶)。
3. —種用于表達權(quán)利要求1所述的編碼環(huán)氧化物水解酶基因的工程菌株。其是將權(quán)利要求1所述的基因 經(jīng)過克隆、轉(zhuǎn)化到埃希氏大腸桿菌(&c&n'c/n'aco/z') BL21(DE3)菌株所獲得的表達重組環(huán)氧化物水解酶 的工程菌株五. // BL21 (DE3)/ pE28EHA 。
4. 權(quán)利要求2所述的環(huán)氧化物水解酶在手性環(huán)氧化物外消旋混合物動力學(xué)拆分及其在環(huán)氧化物的不對稱 催化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公布了利用RT-PCR方法克隆一種來源于真菌黃孢原毛平革菌BKM-F1767株系(Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767)中的環(huán)氧化物水解酶基因(PchEHA)，公布PchEHA編碼區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列。提供了含有該基因的克隆質(zhì)粒pTEHA和重組表達質(zhì)粒pET28EHA，以及包含PchEHA基因的基因工程菌株大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28EHA，并由此制備的重組環(huán)氧化物水解酶。本發(fā)明中的重組環(huán)氧化物水解酶對多種類型的環(huán)氧化物具有催化活性，而且表現(xiàn)出不同程度的對映體選擇性，其中對環(huán)氧苯乙烷表現(xiàn)出高度的對映體選擇性。本發(fā)明中的重組環(huán)氧化物水解酶可以應(yīng)用于手性環(huán)氧化物外消旋混合物的動力學(xué)拆分及環(huán)氧化物的不對稱催化等領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/14GK101591664SQ20091005816
公開日2009年12月2日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者紅 馮, 張義正, 張琳豐, 念 李 申請人:四川大學(xué)