專利名稱：一種快速篩選加氧酶微生物或加氧酶基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選加氧酶微生物或者加氧酶基 因的方法。
背景技術(shù)：
生物催化以其高度的化學(xué)、區(qū)域、立體選擇性和反應(yīng)條件溫和，后處理容易，能耗 低等優(yōu)勢(shì)成為當(dāng)今化工生產(chǎn)和相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展潮流，并已成功應(yīng)用于許多領(lǐng)域。生物 酶是生物催化技術(shù)的核心，新型高效催化酶的獲得成為該領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。目前，加氧酶的 開(kāi)發(fā)利用還非常有限，其中重要的原因之一就是傳統(tǒng)加氧酶的篩選方法存在許多局限，使 得很難篩選到高效、高選擇性的加氧酶菌株和基因。本發(fā)明提到的加氧酶，包括環(huán)氧化酶和芳環(huán)雙加氧酶，如萘雙加氧酶等，目前其篩 選方法主要有三類。一類是通過(guò)利用唯一碳源篩選菌株。由于環(huán)境樣品可利用同一碳源的 微生物種群非常豐富，這種方法在篩選過(guò)程中往往會(huì)得到大量的微生物，而目標(biāo)產(chǎn)加氧酶 菌株很難從中篩選到，特別是在處理特殊環(huán)境樣本時(shí)，如加氧酶豐富的活性污泥，極易受到 其他功能微生物的干擾，如瓊脂利用型細(xì)菌，假陽(yáng)性率很高。一類是直接用薄板層析、高壓 液相或氣相等分析手段檢測(cè)所篩目標(biāo)加氧酶的催化產(chǎn)物，如苯乙烯環(huán)氧化酶篩選中，通過(guò) 測(cè)定產(chǎn)物苯乙烯環(huán)氧的生成來(lái)檢測(cè)酶的存在(例如，Park et al. (2005)Korean J. Chem. Eng.，22 (3)，418 424)。這種方法通量低，耗時(shí)長(zhǎng)，更重要的是，由于采用天然底物，其氧 化產(chǎn)物在微生物體內(nèi)往往會(huì)被下游多個(gè)酶迅速連續(xù)代謝，很難捕捉到中間的目標(biāo)加氧酶的 催化產(chǎn)物，導(dǎo)致漏檢率極高。第三類是根據(jù)加氧酶氧化其他易檢測(cè)的底物來(lái)間接證明酶的 存在，如加氧酶(環(huán)氧化酶，P450單加氧酶等)篩選中可用1-氫吲哚為底物，通過(guò)檢測(cè)顏 色生成來(lái)獲知加氧酶的存在(如，Hellemond et al. (2007) Appl. Environ. Microbiol., 73(18)，5832 5839)。這種方法已被應(yīng)用于重組酶的篩選，而針對(duì)環(huán)境樣本篩選天然源微 生物則尚未見(jiàn)報(bào)道。此方法較為直觀簡(jiǎn)便，但以1-氫吲哚為底物，顯色時(shí)間長(zhǎng)，多達(dá)4天以 上，而且產(chǎn)物為靛藍(lán)和靛玉紅的混合物，導(dǎo)致形成的藍(lán)色淺，產(chǎn)物摩爾吸光系數(shù)較低，與大 腸桿菌菌體的黃色混合后呈黃綠色，不易識(shí)別，極易造成加氧酶有益資源的漏篩。有文獻(xiàn)報(bào) 道4-取代吲哚經(jīng)氧化偶聯(lián)后由于4位的位阻原因無(wú)法生成4，4’- 二取代靛玉紅，只能生成 單一的產(chǎn)物4，4’ - 二取代靛藍(lán)，這個(gè)特點(diǎn)顯示出4-取代吲哚在顯色反應(yīng)方面的應(yīng)用潛力 優(yōu)于 I-氫吲哚(Polychronopoulos et al. (2004) J. Med. Chem.，47，935 946 ；Wu etal. (2005)Chem. Biodivers. ,2,51 65)。在重組酶細(xì)胞色素P4502A6的定向進(jìn)化研究中，報(bào) 道了利用4-氯吲哚開(kāi)展突變子篩選的方法，但是迄今為止，也尚未見(jiàn)報(bào)道針對(duì)環(huán)境樣品篩 選天然源微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從環(huán)境樣品中快速篩選加氧酶的方法，即在篩選培養(yǎng)基中 加入4-取代吲哚，經(jīng)加氧酶氧化生成可直接觀察的藍(lán)色物質(zhì)4，4’- 二取代靛藍(lán)，從而簡(jiǎn)便、快速、靈敏的從環(huán)境樣品中篩選出目的加氧酶。本發(fā)明的具體方案是1.環(huán)境樣品中篩選產(chǎn)加氧酶菌株產(chǎn)加氧酶菌株篩選包括以下步驟為①富集環(huán)境樣品環(huán)氧化酶富集采用苯乙烯或環(huán)己烯或?qū)︿灞揭蚁┗蚣谆揭蚁?為唯一碳源；萘雙加氧酶富集選用萘或者蒽為唯一碳源；并添加無(wú)機(jī)鹽，30°C震蕩培養(yǎng)富 集環(huán)境樣品5 15天。②以無(wú)機(jī)鹽、唯一碳源、4-取代吲哚以及0. 01% 0. 的酵母粉制備瓊脂固體 培養(yǎng)基，富集的環(huán)境樣品涂布于培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)1 5天，出現(xiàn)藍(lán)色菌落，將藍(lán)色菌落以相同 組分的培養(yǎng)基分離，純化，獲得產(chǎn)目標(biāo)加氧酶的微生物菌株。無(wú)機(jī)鹽可為常用的M9無(wú)機(jī)鹽(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，中文版，第三版，下冊(cè)，頁(yè) 碼1595 1596)或者文獻(xiàn)報(bào)道的 M12 無(wú)機(jī)鹽(Hartmans et al. (1989)Appl. Environ. Microbiol.，55(11)，2850 2855)。唯一碳源的濃度為0. 05 8mM。4-取代吲哚濃度為0.05 ImM，4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4_吲哚甲酸甲酯或 4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟吲哚或4-甲氧基吲哚。2.環(huán)境樣品構(gòu)建的元基因組庫(kù)中篩選加氧酶基因包括以下步驟①構(gòu)建環(huán)境樣品的元基因組文庫(kù)以CTAB法從環(huán)境樣品中提取總DNA，并純化，將 純化好的總DNA酶切，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，回收1 IOKb之間的片段；載體質(zhì)粒以 相同酶酶切，并用去磷酸化酶(CIP)處理。將回收得到1 IOKb之間的DNA片段連入載體， 連接產(chǎn)物經(jīng)醇沉處理，用去離子水溶解，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建環(huán)境樣品元基因 組文庫(kù)。②從元基因組文庫(kù)中篩選加氧酶基因?qū)⒃蚪M文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌，涂布于固體篩選平板上。培養(yǎng)基組分為 LB固體培養(yǎng)基中加入4-取代吲哚、IPTG 0. 2 ImM和載體相應(yīng)的抗生素。轉(zhuǎn)化子在篩選 平板上生長(zhǎng)1 2天或者于4°C再放置1 5天，可出現(xiàn)藍(lán)色重組菌落，挑出，得到含有加氧 酶基因的重組子。環(huán)境樣品基因組文庫(kù)可以是環(huán)境樣品基因組總DNA直接構(gòu)建的文庫(kù)，也可以是經(jīng) 樣品富集后構(gòu)建的目標(biāo)加氧酶文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建中選用的載體為pBluescript SK或pBluescript KS或pUC18或pUC19 或pKK233或pKK223或pET_28或pET_32載體；文庫(kù)篩選中宿主大腸桿菌為DHl或DH5 α 或 DHlOB 或 JM109 或 MC1061 或 BL21 (DE3)或 XL-Blue。本發(fā)明利用許多加氧酶可以將4-取代吲哚氧化，生成單一的深藍(lán)色物質(zhì)4，4’_ 二 取代靛藍(lán)，其產(chǎn)物單一，摩爾吸光系數(shù)高，因此大大提高了篩選靈敏度?？梢愿咄?，簡(jiǎn)便， 快速，靈敏的篩選環(huán)境樣品中存在的加氧酶資源。本方法可用于篩選環(huán)氧化酶和芳環(huán)雙加 氧酶，如萘雙加氧酶等多種加氧酶。


圖1為篩選平板；
4
圖2為純化平板；圖3為篩選菌株進(jìn)化樹；圖4為篩選菌株環(huán)氧化酶進(jìn)化樹；圖5為整細(xì)胞轉(zhuǎn)化4-取代吲哚后的萃取物照片，其中(1)為4-溴吲哚，(2)為 4_氟吲哚，⑶為4-吲哚甲酸甲酯，(4)為4-甲氧基吲哚，(5)為4-甲基吲哚，(6)為4-氯 吲哚。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1以4-氯吲哚為底物篩選產(chǎn)環(huán)氧化酶菌株于某污水處理廠取活性污泥樣品，富集于含有M12無(wú)機(jī)鹽和苯乙烯(濃度為2mM) 的培養(yǎng)基中，30°C，225rpm培養(yǎng)10天。將富集培養(yǎng)液稀釋至篩選平板上(M12+苯乙烯 2mM+4-氯吲哚0. ImM+O. 01%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養(yǎng)3天，每支平板上可見(jiàn)多 個(gè)成片藍(lán)色菌斑(圖1)，挑出，繼續(xù)純化(圖2)，得到11株純菌株。實(shí)施例2以4-甲基吲哚為底物篩選產(chǎn)環(huán)氧化酶菌株樣品及富集方法同實(shí)施例1，將富集培養(yǎng)液稀釋至篩選平板上(M9+苯乙烯 2mM+4-甲基吲哚0. 2mM+0. 05%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養(yǎng)3天，出現(xiàn)藍(lán)色菌斑，繼 續(xù)純化，得到15株純菌株。實(shí)施例3以4-引哚甲酸甲酯為底物篩選產(chǎn)環(huán)氧化酶菌株樣品及富集方法同實(shí)施例1，將富集培養(yǎng)液稀釋至篩選平板上(M9+苯乙烯 3mM+4-引哚甲酸甲酯0. 3mM+0. 06%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養(yǎng)4天，出現(xiàn)藍(lán)色菌 斑，繼續(xù)純化，得到12株純菌株。實(shí)施例4以4-溴吲哚為底物篩選產(chǎn)環(huán)氧化酶菌株取自另一污水處理廠樣品，富集方法同實(shí)施例1，將富集培養(yǎng)液稀釋至篩選平板上 (M9+苯乙烯3mM+4-溴吲哚0. 2mM+0. 05%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養(yǎng)4天，出現(xiàn)深 藍(lán)色菌斑，繼續(xù)純化，得到10株純菌株。實(shí)施例5篩選菌株碳源利用情況實(shí)施例1、2、3、4篩選的菌株，分別以苯乙烯和苯乙烯環(huán)氧為唯一碳源培養(yǎng)，分別 為M12+苯乙烯5mM ；M12+苯乙烯環(huán)氧3mM。24h后，所有菌株均能在兩種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，即 篩選菌株能以苯乙烯和苯乙烯環(huán)氧為唯一碳源，具有苯乙烯至苯乙烯環(huán)氧這一代謝途徑， 因此可產(chǎn)生這一途徑所需的環(huán)氧化酶。實(shí)施例6產(chǎn)環(huán)氧化酶菌株的16S rRNA鑒定實(shí)施例1、2、3、4篩選的菌株是可利用苯乙烯、苯乙烯環(huán)氧為唯一碳源生長(zhǎng)， 并使4-取代吲哚變藍(lán)的菌株。為驗(yàn)證這些菌株為目的菌株，對(duì)其進(jìn)行16S rRNA鑒 定。以細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA序列。引物為F :5，-AGAGTTTGATCCTCGCTCAG, R 5‘-GGTCTACCTTGTTACGACTT,得到擴(kuò)增片段大小為1498bp。經(jīng)比對(duì)，其基因序列有數(shù)十個(gè)堿 基差異。其中，實(shí)施例1有三種16S rRNA序列不同的菌株，實(shí)施例2、3所得菌株與實(shí)施例 1完全相同(實(shí)施例1和2、3來(lái)自同一活性污泥樣品)，而實(shí)施例4則有二種16S rRNA序 列不同的菌株。經(jīng)比對(duì)分析，所篩菌株全部為假單胞菌屬。選擇實(shí)施例1、2、3篩選的16S rRNA序列不同的三株菌WLS1-1、WLS1-5、WLS1_8和實(shí)施例4篩選的WLS4_1、WLS4_9作進(jìn)化
5樹分析。圖3為篩選菌株進(jìn)化樹，其中Pseudomonas sp. VLB 120為已報(bào)道的具有環(huán)氧化酶 功能的假單胞菌，所篩菌株與VLB 120菌株已報(bào)道的16S rRNA基因序列相似度均>99%， 證明采用本發(fā)明篩選的菌株為產(chǎn)環(huán)氧化酶的假單胞菌。實(shí)施例7環(huán)氧化酶基因特征片段的驗(yàn)證經(jīng)實(shí)施例6鑒定，篩選菌株為假單胞菌。為進(jìn)一步證實(shí)這些菌株含有環(huán)氧化 酶基因序列，將上述5株篩選菌擴(kuò)增環(huán)氧化酶基因StyA部分特征片段。根據(jù)NCBI基 因庫(kù)中報(bào)道的假單胞菌環(huán)氧化酶序列，設(shè)計(jì)引物，F(xiàn) 5 ’ -ATGAAAAAGCGTATCGGTATTG ； R 5，-TTCTCGAAGGGCGAGTTTTC, PCR擴(kuò)增得到488bp片段，命名為styAsp。圖4為篩選菌株特 征片段styAsp-Ι和styAsp-2與已報(bào)道的假單胞菌來(lái)源的環(huán)氧化酶的相似度分析，其相應(yīng) 片段相似度為97% 100%。因此，采用本發(fā)明篩選的菌株為產(chǎn)環(huán)氧化酶(苯乙烯單加氧 酶)的假單胞菌菌株。實(shí)施例8以4-甲基氧吲哚為底物篩選產(chǎn)萘雙加氧酶的菌株樣品來(lái)源同實(shí)施例1，富集于含有M12無(wú)機(jī)鹽和萘(濃度為7mM)的培養(yǎng)基 中，30°C，225rpm培養(yǎng)12天。將富集液稀釋至篩選平板上(M12+萘7mM+甲氧基吲哚 0. 6mM+0. 06%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養(yǎng)7天，平板上有藍(lán)色菌斑出現(xiàn)，分離、純化 得到23株純菌株(編號(hào)為NPCL-I至NPCL-23)。實(shí)施例9以4-氟吲哚為底物篩選產(chǎn)萘雙加氧酶的菌株樣品來(lái)源同實(shí)施例4，培養(yǎng)方法同實(shí)施例8，篩選底物為4-氟吲哚(濃度為 0. 3mM)，將藍(lán)色菌斑分離純化得到15株菌株(編號(hào)為NPF-I至NPF-15)。實(shí)施例10篩選菌株以萘為唯一碳源生長(zhǎng)情況實(shí)施例8、9篩選的菌株以萘為唯一碳源培養(yǎng)，即M12+萘5mM，結(jié)果顯示所有菌株均 能以萘為唯一碳源生長(zhǎng)，可產(chǎn)萘雙加氧酶。實(shí)施例11產(chǎn)萘雙加氧酶菌株的16S rRNA鑒定為驗(yàn)證實(shí)施例8和9得到的菌株為產(chǎn)萘雙加氧酶的菌株，任選其中標(biāo)號(hào)為NPCL-2、 NPCL-5、NPF-7、NPF-11的4株進(jìn)行16S rRNA鑒定。其中NPCL-5鑒定為銅綠假單胞菌屬細(xì) 菌，NPCL-2、NPF-7、NPF-11為伯克霍爾德菌屬細(xì)菌。這兩類菌均有產(chǎn)萘雙加氧酶的報(bào)道，進(jìn) 一步證明采用本發(fā)明方法篩選到的菌株為產(chǎn)萘雙加氧酶的菌株。實(shí)施例12萘雙加氧酶基因特征片段的驗(yàn)證對(duì)實(shí)施例11所述的4株菌的萘雙加氧酶基因進(jìn)一步驗(yàn)證，分別擴(kuò) 增PAH基因，該基因?yàn)楦锾m氏陰性細(xì)菌降解PAHs類化合物的環(huán)羥基化雙加氧酶 (ring-hydroxylating-dioxygenase, RHD) α 亞基白勺部分基因。PAH 基因擴(kuò)增采用簡(jiǎn)并弓丨物，F(xiàn) :5，-GAGATGCATACCACGTKGGTTGGA ;R 5，-AGCTGTTGTTCGGGAAGAYWGTGCMGTT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 306bp。表1篩選菌株P(guān)AH基因片段驗(yàn)證
權(quán)利要求
一種快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征在于包含以下步驟①富集環(huán)境樣品環(huán)氧化酶富集采用苯乙烯或環(huán)己烯或?qū)︿灞揭蚁┗蚣谆揭蚁槲ㄒ惶荚?；萘雙加氧酶富集選用萘或者蒽為唯一碳源；并添加無(wú)機(jī)鹽，30℃震蕩培養(yǎng)富集環(huán)境樣品5～15天；②以無(wú)機(jī)鹽、唯一碳源、4 取代吲哚以及0.01％ 0.1％的酵母粉制備瓊脂固體培養(yǎng)基，富集環(huán)境樣品涂布于培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)1 5天，出現(xiàn)藍(lán)色菌落，將藍(lán)色菌落以相同組分的培養(yǎng)基分離，純化，獲得產(chǎn)目標(biāo)加氧酶的微生物菌株。
2.一種快速篩選加氧酶基因的方法，其特征在于包含以下步驟①構(gòu)建環(huán)境樣品的元基因組文庫(kù)以CTAB法從環(huán)境樣品中提取總DNA，并純化，將純化 好的總DNA酶切，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，回收1 IOKb之間的片段；載體質(zhì)粒以相同 酶酶切，并用去磷酸化酶(CIP)處理；將回收得到1 IOKb之間的DNA片段連入載體，連接 產(chǎn)物經(jīng)醇沉處理，用去離子水溶解，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建環(huán)境樣品元基因組文 庫(kù)；②從元基因組文庫(kù)中篩選加氧酶基因?qū)⒃蚪M文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布于固體篩選平板上；培養(yǎng)基組分為L(zhǎng)B固體 培養(yǎng)基中加入4-取代吲哚、IPTG 0. 2-lmM和載體相應(yīng)的抗生素；轉(zhuǎn)化子在篩選平板上生長(zhǎng) 1-2天或者于4°C再放置1-5天，出現(xiàn)藍(lán)色重組菌落，挑出該藍(lán)色重組菌落，得到含有加氧酶 基因的重組子。
3.權(quán)利要求1所述的快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征是無(wú)機(jī)鹽為常用的M9無(wú) 機(jī)鹽或者M(jìn)12無(wú)機(jī)鹽；唯一碳源的濃度為0. 05-8mM。
4.權(quán)利要求1所述的快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征是4_取代吲哚濃度為 0. 05-lmM, 4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4-吲哚甲酸甲酯或4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟 吲哚或4-甲氧基吲哚。
5.權(quán)利要求2所述的快速篩選加氧酶基因的方法，其特征是4_取代吲哚濃度為 0. 05-lmM, 4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4-吲哚甲酸甲酯或4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟 吲哚或4-甲氧基吲哚。
6.權(quán)利要求2所述的快速篩選加氧酶基因的方法，其特征是環(huán)境樣品基因組文庫(kù)為 環(huán)境樣品基因組總DNA直接構(gòu)建的文庫(kù)或?yàn)榻?jīng)樣品富集后構(gòu)建的目標(biāo)加氧酶文庫(kù) ’文庫(kù) 構(gòu)建中選用的載體為pBluescript SK或pBluescript KS或pUC18或pUC19或pKK233或 ΡΚΚ223或ρΕΤ-28或ρΕΤ_32載體，宿主大腸桿菌為DHl或DH5 α或DHlOB或JM109或MC1061 或 BL21(DE3)或 XL-Blue。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選加氧酶微生物或者加氧酶基因的方法。本發(fā)明快速篩選加氧酶微生物的方法包含用唯一碳源富集環(huán)境樣品和將富集環(huán)境樣品涂布于培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)、分離和純化，獲得產(chǎn)目標(biāo)加氧酶的微生物菌株；快速篩選加氧酶基因的方法包含構(gòu)建環(huán)境樣品的元基因組文庫(kù)和從元基因組文庫(kù)中篩選加氧酶基因。本發(fā)明具有篩選靈敏度高，可高通量、簡(jiǎn)便、快速地篩選環(huán)境樣品中存在的加氧酶資源。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101942497SQ20091005992
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者劉艷, 吳中柳, 張志剛, 張超 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所