專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻抗病相關(guān)基因OsWRKY45-1和它在水稻抗病性改良中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因Os『欣M5-7的分離克
隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。Os『i in^5-7基因是水稻抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子。抑制&『欣y"-7 基因功能后，水稻抗白葉枯病和抗細(xì)菌性條斑病(細(xì)條病)的能力顯著提高。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類(lèi)繁多，包括病毒、細(xì)
菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖， 引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資 源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(lèi)(1)
抗病基因，又稱(chēng)i (resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類(lèi)基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與 病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996; Baker等，1997; Jia等，2000; Dangl和Jones，2001; Nimchuk等，2001)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)， 是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基
因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因大約只有30個(gè)；(2) 抗病基因具有病原種類(lèi)和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔儯?br> 一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植 物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)、阻止信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類(lèi)基因的共同特 點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的
差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000; Schenk等，2000; Zhou等，2002)。 目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)
的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開(kāi)發(fā)的基因資源(1)由 于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類(lèi)基因是具有持久抗性的 基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒(méi)有病原特異性，因此它們是具有廣譜 抗性的基因資源；(3)這類(lèi)基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou 等，2002; Chu等，2004)，這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用機(jī)理、以及單個(gè)抗病相關(guān)基 因是否會(huì)引起水稻抗病表型的改變都不清楚。
水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。水稻白葉枯病由白葉枯病菌(Xfl"Aowowcw oa加e pv. o^zae)引起，是世界上對(duì)水稻危害最大的細(xì)菌 性病害(過(guò)崇儉，1995)。另外，水稻細(xì)條病由細(xì)條病菌Qfa^/iomo"asoo^aepv. oo^'co/a) 引起，也是水稻的重要病害。因此，了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻的 抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來(lái)的損失。
分離克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)水稻抗病機(jī)理研究的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比， 抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過(guò)抑制作為抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子 的抗病相關(guān)基因的功能進(jìn)行水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。 這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個(gè)抗病相關(guān)基因完整DNA片段，并通過(guò)抑制目 標(biāo)基因的功能鑒定該基因在抗病反應(yīng)過(guò)程中所起作用，為利用這個(gè)基因改良水稻品種或其它 植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。這個(gè)基因被命名為Os『欣1^5-7。
本發(fā)明涉及分離一種包含Os『欣y"-/基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段賦予水稻 對(duì)由白葉枯病菌和細(xì)條病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO: l所示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行分析表明它是一個(gè)含有WRKY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。 抑制序列表SEQIDNO: 1所示序列的表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病和細(xì)條病的抗性。
可以采用已經(jīng)克隆的Os『欣W5-7基因作探針，從cDNA和基因組文庫(kù)中篩選到本發(fā)明 的基因或同源基因。同樣，采用PCR (polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、 mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的Os『欣W5-7基因以及任何感興趣的一段DNA或與其 同源的一段DNA?？梢圆捎眠z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)抑制Qs『欣W5-7基因的功能，產(chǎn)生同時(shí)抗白葉枯 病和抗細(xì)條病的轉(zhuǎn)基因植株。采用這種技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達(dá)到的。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了 Os『/^T"-7基因的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用過(guò)程以 及該基因的特點(diǎn)。


序列表SEQ ID NO:l. Of『i in^5-7基因的序列和它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。 圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因Os『欣M5-7以及驗(yàn)證Os『欣y"-7基 因功能的流程圖。
圖2. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和Os『/^:W5-7基因的結(jié)構(gòu)。"ATG"和"TGA"分別是翻譯起始密碼和 終止密碼。數(shù)字示每一種結(jié)構(gòu)的核苷酸數(shù)目。
圖3. Os『欣1^5-7基因和它的等位基因Qs『欣y"-2編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列對(duì)比。 數(shù)字表示對(duì)應(yīng)的最后一個(gè)氨基酸的位置。黑色方框表示兩個(gè)蛋白質(zhì)存在差異的氨基酸殘基位 點(diǎn)。圖4.用定量反轉(zhuǎn)錄一PCR (quantitativereverse transcription-PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)白 葉枯病菌PX061侵染后感病水稻品種牡丹江8和抗病水稻株系Rb49中基因的 表達(dá)模式。對(duì)照是接種PX061前的樣品，沒(méi)經(jīng)過(guò)任何處理；其它是接種PX061后不同時(shí)間 點(diǎn)的樣品。每個(gè)樣品中Os『iWQ^5-7基因的表達(dá)量是相對(duì)于接種前牡丹江8樣品中 Os『7 in^5-/基因的表達(dá)量。
圖5.遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301的結(jié)構(gòu)。
圖6. To代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D113UM)中的Os『i /n^5-/基因表達(dá)量和對(duì)白葉枯病菌株 PX061的反應(yīng)相關(guān)。對(duì)照為水稻品種牡丹江8 (遺傳轉(zhuǎn)化的受體)。遺傳轉(zhuǎn)化植株中 C^『欣F45-7基因的表達(dá)量是相對(duì)于對(duì)照牡丹江8中Os『/^W5-7基因的表達(dá)量。星號(hào)(*) 表示與對(duì)照相比，遺傳轉(zhuǎn)化基因植株的病斑面積顯著(尸<0.05)增大。
圖7(包含圖7A和圖7B).超量表達(dá)Os『/ /n^5-7基因的兩個(gè)1代家系D113UM10 (見(jiàn) 圖7A)和D113UM11 (見(jiàn)圖7B)中的0 『欣1^5-/基因的表達(dá)量與表型共分離。對(duì)照為水 稻品種牡丹江8 (遺傳轉(zhuǎn)化的受體)。遺傳轉(zhuǎn)化植株中(^『欣^5-/基因的表達(dá)量是相對(duì)于對(duì) 照牡丹江8中05『/^^5-/基因的表達(dá)量。星號(hào)(*)表示與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的病斑面 積顯著(尸<0.05)增大。
圖8 (包含圖8A和圖8B) . Os^R/n^5-基因T-DNA插入突變體2C-50229中T-DNA插 入位點(diǎn)(見(jiàn)圖8A)和突變體驗(yàn)證分析(見(jiàn)圖8B)。數(shù)字表示T-DNA插入位點(diǎn)和PCR引物的 相對(duì)位置。"ATG"是翻譯起始密碼。箭頭w45F2、 w45Rl、 RB1分別表示用來(lái)驗(yàn)證突變體是 否正確的PCR引物；其中w45F2和w45Rl引物是根據(jù)Os『/^W5J基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)的， 它們分別位于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)；RB1是根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。"717"和"301" 分別表示引物w45F2和w45Rl與T-DNA插入位點(diǎn)間的核苷酸數(shù)目，"100"表示引物w45Rl 和翻譯起始位點(diǎn)ATG間的核苷酸數(shù)目。
圖9.三個(gè)丁2代T-DNA插入突變體(2C-50229)家系中的0$『欣}^5-/基因表達(dá)減少或 消失與植株對(duì)白葉枯病菌株P(guān)X086的抗性增強(qiáng)相關(guān)。對(duì)照為粳稻品種Dongjin (遺傳轉(zhuǎn)化的 受體)。突變體植株中Os『iJ/0^5J基因的表達(dá)量是相對(duì)于對(duì)照Dongjin中asW^AT45J基因 的表達(dá)量。星號(hào)(*)表示與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積顯著(尸<0.01)減小。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆C^『欣MU基因以及驗(yàn) 證Qs『欣W5-7基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和下面的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確 定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改 變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例l: Os^7 JO^/5-i基因的序列和結(jié)構(gòu)分析 1. OsWi iQ^5位點(diǎn)不同等位基因的確定巳有研究者報(bào)道as『欣W5在苯并噻二唑(benzothiadiazole)(又稱(chēng)苯并[1, 2， 3]噻二唑 -7-羧酸甲酯)誘導(dǎo)的水稻抗稻瘟病反應(yīng)中扮演一個(gè)非常重要的角色(Shimono等，2007)。本 發(fā)明的申請(qǐng)人根據(jù)來(lái)源于粳稻(Oo^^^'rassp.^pom'ca)品種日本晴(一個(gè)公開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的 水稻品種)中的Os『i^:W5基因(Shimono等，2007)序列設(shè)計(jì)了 PCR引物w45F4 (5'-ATGGTACCGCCTACGCATCATCTCCTTC-3')(下劃線(xiàn)代表K;wl限制性?xún)?nèi)切酶消化位點(diǎn))和 w45R4 f5'-CAGGATCCTTATGGCACAACATTTAGCA-3')，分別從粳稻品種牡丹江8 (—個(gè)公 開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的水稻品種)禾I3Dongjin (—個(gè)公開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的水稻品種)以及秈稻(C^za>sfl"va ssp. /"Am)品種明恢63 (—個(gè)公開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的水稻品種)、珍汕97 (—個(gè)公開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的 水稻品種)和93-11 (—個(gè)公開(kāi)報(bào)道應(yīng)用的水稻品種)擴(kuò)增了該基因。利用PCR引物w45F4、 w45R4 、 w45F6 (5'-ATCACAAAGCATAGCATCATCT-3') 、 w45R6(5'-CTCAGCACCTCCTCCTGGTCGG-3')和美國(guó)Applied Biosystems公司的測(cè)序試劑盒，以雙脫 氧核苷酸末端終止法(美國(guó)Applied Biosystems公司)分別從PCR擴(kuò)增片段兩端測(cè)序。序列 比較發(fā)現(xiàn)牡丹江8和Dongjin中的Os『欣W5等位基因的序列與日本晴中的as『/ /a^5基因 序列完全一致；而明恢63、珍汕97和93-11中的Os『欣I^5等位基因序列一致，但是與日 本晴、牡丹江8和Dongjin中的Qs『/ i0^5基因存在差異。為了區(qū)分這一對(duì)核苷酸序列不同 的等位基因，我們將日本晴、牡丹江8和Dongjin中的Os『欣M5基因命名為05『欣}^5-/， 明恢63、珍汕97和93-11中的等位基因命名為Os『欣1^5-2 (發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200810197309.9，
發(fā)明者王石平, 增 陶 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)