專利名稱：中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒基因診斷試劑盒，尤其涉及一種中華絨螯蟹蟹瘟病毒基 因診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
河蟹產(chǎn)業(yè)是加入世貿(mào)組織后我國(guó)淡水產(chǎn)業(yè)中頗具前景的產(chǎn)業(yè)之一。近年來(lái)， 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是池塘養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，水產(chǎn)病害的發(fā)生也日趨頻繁，其
中如"黑鰓病"和"顫抖病"等，是目前河蟹養(yǎng)殖危害最大的兩種病害，主要集 中于江蘇、安徽等長(zhǎng)江流域各省，在浙江、廣東、河南等地也時(shí)有發(fā)生。由于目 前對(duì)這些病害的病因缺乏研究，無(wú)法進(jìn)行對(duì)癥治療，往往導(dǎo)致養(yǎng)殖的河蟹大量死 亡；勉強(qiáng)生存下來(lái)的河蟹也由于在生病期間錯(cuò)過(guò)了最佳生長(zhǎng)期，品質(zhì)欠佳。對(duì)河 蟹病原研究工作的滯后已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。在研究河 蟹病害的過(guò)程中，從湖北省某養(yǎng)殖場(chǎng)分離到一株病毒^5CV (frioc力eirsi/7e/wis Cholera Virus),中華絨螯蟹蟹瘟病毒。目前對(duì)病毒病尚無(wú)治療辦法。因此，建 立靈敏準(zhǔn)確的早期檢測(cè)技術(shù)對(duì)于預(yù)防疾病，減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。目前沒(méi) 有關(guān)于此種病毒檢測(cè)技術(shù)的專利和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診 斷試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
根據(jù)中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因組的RNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引 物，采用RT-PCR的方法，可以對(duì)中華絨螯蟹蟹是否感染蟹瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)。 1、中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒(簡(jiǎn)稱本試劑盒)
4本該試劑盒主要由以下幾種試劑組成
試劑A液組織勻漿緩沖液，為Tris-NaCl-EDTA緩沖液； 試劑B液RNA提取液，為Trizol液；
試劑C液中華絨螯蟹蟹瘟病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物 ￡sCV-R，其序列為5' - ACACGCTGAATATCGCACTTG;
試劑D液PCR反應(yīng)底其中含有特定引物^sCV-F及feCV-R，其序列為 ￡sCV-F 5' - ACTCAAAGCCCCAGACTACCT， ￡sCV-R 5' - ACACGCTGMTATCGCACTTG;
試劑E液陽(yáng)性對(duì)照，為feCV陽(yáng)性DNA模板，長(zhǎng)度為481bp。
2、 本試劑盒的獲得方法 本試劑盒的所有試劑均購(gòu)自商業(yè)化公司。
3、 本試劑盒的用途
本試劑盒的用途就在于能檢測(cè)出中華絨螯蟹蟹苗種、成蟹及親蟹是否攜帶蟹 瘟病毒。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果
1、 本發(fā)明能快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出中華絨螯蟹蟹苗種、成蟹及親蟹是 否攜帶蟹瘟病毒。
2、 本發(fā)明適用于檢測(cè)中華絨螯蟹蟹瘟病毒。
具體實(shí)施例方式
一、本試劑盒的幾種試劑的組成
1、 試劑A液、試劑B液為常用試劑。
2、 試劑C液
試劑C液是中華絨螯蟹蟹瘟病毒毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每管組成為 4 Pl 5X RNA反轉(zhuǎn)錄緩沖液， 2 ii 1 10mM MgCl" 8. 5 ul RNase Free H20， 1u1 10mM dNTP Mixture, 1U1 lu RNsin，1P1 lu M-MLV ReverseTranscriptase,
lul 10 pM foCV-R,其序列為5' - ACACGCTGMTATCGCACTTG。
3、 試劑D液
試劑D液是PCR反應(yīng)液，每管組成為 2 mM MgCl2,
5 ul 10X PCR緩沖液， 41 ul ddH20， 2 u T叫，
10 pM ^5CV-R及f5CV-F;其序列為
￡sCV-F 5' _ ACTCAAAGCCCCAGACTACCT， ￡sCV-R 5' - ACACGCTGAATATCGCACTTG。 引物應(yīng)有足夠的含量， 一般應(yīng)不少于8 pM。
4、 試劑E液
試劑E液是陽(yáng)性對(duì)照，為￡sCV陽(yáng)性DNA模板，病毒RNA聚合酶基因核 酸序列為481bp。
二、本試劑盒的使用方法如下 待檢組織勻漿
稱取冰凍或新鮮樣品待檢組織100mg，加入150ul試劑A,用研磨小棒研磨 將組織冰浴研碎；
1、 待檢組織病毒RNA的提取
加入1 ml試劑B，混勻，冰上靜置15分鐘。加入200 u 1氯仿，振搖15 秒，靜置10分鐘。在4'C以12000g離心15分鐘。將上層液相轉(zhuǎn)至一個(gè)新的1. 5ml 離心管中。加入500 wl異丙醇后-2(TC沉淀30分鐘。在4°C 12000g離心10 分鐘，1 ml 70%乙醇洗滌RNA沉淀然后離心5分鐘。室溫自然干燥10-20 分鐘，用10 Pl無(wú)RNA酶的水溶解。
2、 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄
取1 u 1病毒RNA溶液加入含試劑C的反應(yīng)管，在PCR儀或者水浴中進(jìn)行以 下反應(yīng)
42 °C 60分鐘0°C 5分鐘
3、 PCR反應(yīng)
取1 u 1反應(yīng)溶液加入含試劑D的反應(yīng)管，混勻后在PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng): 94°C 2分鐘
1個(gè)循環(huán)； 94 °C 1分鐘 55 °C 1分鐘 72 °C 2分鐘
30個(gè)循環(huán)； 72 °C 7分鐘 12'C 停止反應(yīng)；
4、 反應(yīng)結(jié)束后取10 u 1反應(yīng)液加1 u 1 10XDNA加樣緩沖液混勻后進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增產(chǎn)物.如出現(xiàn)約481bp的反應(yīng)產(chǎn)物，說(shuō)明待檢樣品 攜帶^sCV病毒。
—、 試驗(yàn)結(jié)果
已經(jīng)用本發(fā)明對(duì)中華絨螯蟹是否被病毒感染進(jìn)行檢測(cè)，得出有效、可靠的檢 測(cè)結(jié)果。
如圖l， PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果是
右 200bp ladder DNA分子量Marker; 中陰性對(duì)照； 左 PCR產(chǎn)物。序列表
〈110>中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
〈120〉中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒
<140〉
〈141>
<160〉 1
〈210〉 1
〈211> 111
〈212> DNA
〈213〉中華絨螯蟹蟹瘟病毒(￡"'oc/ w> w'/7e"w's Cholera Virus, ￡sCV) 〈400〉
ACTCMAGCCCCAGACTACCTAGGGGATGGCGGMAAATCATCAGMGTG50
GAACGCAAGGCGGATTTGACGTCTCCGAAAATTTTGAAGAATTATCATTC100
TGCAGCAATAAGTACGTACAAAATTTTATCGGTCCAGCCGTATCAGAGTA150
CAGAAACGATGGCATAACCATGCAGCAAAAGGACCGGTATCGAAGMTAA200
TGTGGATGCCAGCACGACCACATGCTGAAATATTCGGAAAACTTGGATGC250
ACGTTAAAAATTCATACATCTGTGGCTTACGACTCACAGCGTGCAATATC300
CGACACCTATTCAAMCTGCTCTCCTACCTAATACTCTACCCTCACTTCC350
TAACTGTGCGCGCTTTTTGCCTACTAATGCTTTCCACCCTGGCAMTCCC400
GCAACTAACTTTTCACTATTCGGACGCAMTATGACCTAAATTGCGACAC450
TTCCACCATTTCAAGTGCGATATTCAGCGTG48權(quán)利要求
1、中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒，其特征在于由以下試劑組成試劑A液組織勻漿緩沖液，為Tris-NaCl-EDTA緩沖液；試劑B液RNA提取液，為Trizol液；試劑C液中華絨螯蟹蟹瘟病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物EsCV-R，其序列為5′-ACACGCTGAATATCGCACTTG；試劑D液PCR反應(yīng)底其中含有特定引物EsCV-F及EsCV-R，其序列為EsCV-F 5′-ACTCAAAGCCCCAGACTACCT，EsCV-R 5′-ACACGCTGAATATCGCACTTG；試劑E液陽(yáng)性對(duì)照，為EsCV陽(yáng)性DNA模板，長(zhǎng)度為481bp。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒，其特征在 于所述的試劑C液是中華絨螯蟹蟹瘟病毒毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每管組成為 ul 5X RNA反轉(zhuǎn)錄緩沖液， 2 u1 10mM MgCl" . 5 P 1 RNase Free H20, 1u1 10mM dNTP Mixture, 1y1 lu RNsin,1 U1 lu M-MLV ReverseTranscriptase，lul 10 pM ￡sCV-R,其序列為5' - ACACGCTGAATATCGCACTTG。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒，其特征在 于所述的試劑D液是PCR反應(yīng)液，每管組成為 mM MgCl" ul 10X PCR緩沖液， 41 ul ddH20，2 u Taq, pM f5CV-R及￡5CV-F;其序列為￡sCV-F 5' - ACTCAAAGCCCCAGACTACCT,￡sCV-R 5^ - ACACGCTGAATATCGCACTTG。 引物應(yīng)有足夠的含量， 一般應(yīng)不少于8 PM。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒，其特征在 于所述的試劑E液是陽(yáng)性對(duì)照，為￡sCV陽(yáng)性DNA模板，病毒RNA聚合酶基 因核酸序列為481bp。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種中華絨螯蟹蟹瘟病毒基因診斷試劑盒，涉及一種病毒基因診斷試劑盒。本試劑盒由以下試劑組成試劑A液是組織勻漿緩沖液，為Tris-NaCl-EDTA緩沖液；試劑B液是RNA提取液，為Trizol液；試劑C液是中華絨螯蟹蟹瘟病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物EsCV-R；試劑D液是PCR反應(yīng)底其中含有特定引物EsCV-F及EsCV-R；試劑E液是陽(yáng)性對(duì)照，為EsCV陽(yáng)性DNA模板，長(zhǎng)度為481bp。本發(fā)明能快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出中華絨螯蟹蟹苗種、成蟹及親蟹是否攜帶蟹瘟病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101538617SQ20091006143
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者張叔勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所