專利名稱：牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)基因pou1f1作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)尸Ot/丄F7基因片段作 為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
就我國奶牛的情況而言，高產(chǎn)良種奶牛相對缺乏，奶牛品種和遺傳品質(zhì)比較差，因此在我國需 加強(qiáng)高產(chǎn)奶牛的選育。家畜的重要經(jīng)濟(jì)性狀往往是受到遺傳和環(huán)境的作用，奶牛的產(chǎn)奶性狀(包括 產(chǎn)奶量、乳脂含量、乳蛋白含量、乳脂率、乳蛋白率等)主要是受遺傳因素控制，并受到環(huán)境因素 的影響。
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection, MAS) 技術(shù)進(jìn)行選育已經(jīng)成為可能，從遺傳上選擇有優(yōu)勢的等位基因，實(shí)施分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合， 不僅提高選種的相對準(zhǔn)確率和效率，而且可以進(jìn)行早期選擇、提高選擇強(qiáng)度、縮短世代間隔。應(yīng)用 分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)對于提高奶牛的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)是先進(jìn)有效的方法。將靈敏度極高的 一些DNA分析手段應(yīng)用于奶牛育種中，其主要目的是在DNA分子水平上尋找與奶牛產(chǎn)奶性狀密切相關(guān) 的遺傳標(biāo)記，用于奶牛的標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection, MAS)，實(shí)現(xiàn)早期選擇，加 快育種速度，奶牛分子育種是未來奶牛品種改良的主要手段。
垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子(Pituitary Specific Transcription Factor, POU1F1,或簡稱Pit-l)是POU結(jié)構(gòu) 域(PIT-OCT-UNC domain)中幾種同源(異型)蛋白之一，目前已被正式命名為POUIFl。 POU結(jié)構(gòu)域是 由一段DNA結(jié)合區(qū)域組成，包括一個(gè)POU特異性區(qū)域(POU-specific domain, POU-SD)和一個(gè)POU同 源性區(qū)域(POU-homeo-domain， POU-HD)。垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子POUIFI參與調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞生長與 發(fā)育，對垂體激素分泌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄起重要調(diào)節(jié)作用。
牛的尸OWW基因包含6個(gè)外顯子禾口5個(gè)內(nèi)含子，基因全長19654bp,其中mRNA全長1502bp，編 碼291個(gè)氨基酸。Moody等(1995)根據(jù)連鎖分析的結(jié)果，將牛的戶OL7^7基因定位于牛的l號染色體。 Woollard等(2000)人將戶OW尸7基因定位于牛lp21 22區(qū)域上。
Renaville等(1997a)在對89頭意大利荷斯坦奶牛Pit-l基因第6外顯子的Hinfl酶切結(jié)果分析表明A 等位基因與產(chǎn)奶量及角形、A等位基因與體深及后腿形狀、A等位基因與低脂肪率和高角等都存在 顯著相關(guān)。Tuggle和Freeman報(bào)道奶牛的POUlFl基因與乳脂率和乳蛋白率存在顯著相關(guān)。
Zwierzchowski等(2002)報(bào)道，他們對波蘭黑白花奶牛第6外顯子的HinfI酶切分析表明，A等 位基因與產(chǎn)奶量和乳成分存在顯著相關(guān)。DiStasio等(2002)對肉牛的POUlFl基因的第6外顯子的 Hinfl酶切分析表明，BB基因型與腰肉厚存在顯著相關(guān)。POUIFI蛋白是動物垂體前葉特異性表達(dá) 的一種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子(Tuggleetal， 1996) 。 POUIFI蛋白對垂體前葉胚胎發(fā)育以及生長 激素(Growth Hormone, GH)、催乳素(Prolactin， PRL)和促甲狀腺素亞P單位(Thyroid-Stimulating Hormone e， TSHP )基因的表達(dá)起決定性作用(Mangnlam et al. ， 1989; Rosenfeld et al. , 1991)。 POUIFI蛋白與垂體中的PRL基因、GH基因、TSHe基因及其POUlFl基因自身的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄。通過調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)而對動物的生長發(fā)育、繁殖和免疫等很多方面起重要的 作用。在多種垂體激素缺陷而導(dǎo)致侏儒的鼠和人類中，均可發(fā)現(xiàn)P0U1F1基因缺少活性(滕勇，經(jīng)榮 斌，宋成義.哺乳動物POUIFI基因?qū)ζ渖L發(fā)育的作用.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2004, 13(2): 11-15)。因此，POU1F1 基因的突變有可能導(dǎo)致垂體的發(fā)育不全和阻礙GH和PRL兩種激素的分泌。而這兩種激素是泌乳性狀 的主效基因，所以POUIFI基因是一種潛在的影響泌乳的基因。
迄今為止尚未見到有關(guān)利用POUIFI基因作為牛泌乳量及品質(zhì)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆牛戶OL7^V基因的部分DNA序列，尋找該基因突變位點(diǎn)以及多態(tài)性的 檢測方法，篩選適用于牛泌乳量及品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
與牛泌乳量及品質(zhì)性狀相關(guān)基因尸Of7/F/作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，按照以下步驟制備 用GENEBANK中提供的牛POU1F1 (登錄號NC—007299.3)基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物；從奶牛血 液中提取基因組總DNA， PCR擴(kuò)增，得到如序列表SEQ ID N0: 1所示的核苷酸序列。其中在序列表 SEQ ID NO: 1的第15640bp處有1個(gè)A15640-T15640的堿基突變，導(dǎo)致Hinf I -RFLP多態(tài)性。
申請人設(shè)計(jì)了擴(kuò)增上述與牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)的P0UIF1基因片段的引物對，同時(shí)該引物也是用 于檢測序列表SEQ ID NO: 1的第15640bp處A-T堿基突變的正、反向引物，該引物對的DNA序列 如下所示
正向引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'， 反向引物5' -MTGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'。 本發(fā)明為奶牛的分子標(biāo)記輔助育種提供了新的遺傳標(biāo)記。 更詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)如《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO: 1是本發(fā)明作為分子標(biāo)記的奶牛POU1F1基因的部分DNA序列。 圖1:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖.
圖2:對目的DNA片段PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果，圖中1一4泳道為PCR產(chǎn)物，長度為451bP; M泳道
DNA分子量標(biāo)記(100bp DNA ladder) 圖3:是奶牛POU1F1基因序列的Poulfl-歷"/1多態(tài)性的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1奶牛P0U1F1基因部分DNA序列的擴(kuò)增及其多態(tài)性檢測 1、奶牛P0U1F1基因部分DNA序列的擴(kuò)增 (1)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GENBANK提供的牛POUIFI基因(登錄號為NC—007299.3)的序列設(shè)計(jì)引物，序列信息如
下
上游引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' 下游引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'
(2)從奶牛血液中提取總DNA及檢測分析1) 從奶牛血液中分離白細(xì)胞；
2) 在含有白細(xì)胞的試管中加入lml的1XSET, 200uL的蛋白酶K (10mg/mL) ， 10%十二烷基磺酸鈉 (SDS) 100uL。置入恒溫水浴鍋37。C消化過夜；
3) 加入等體積的平衡酚，緩慢顛倒離心管10min，以使管內(nèi)溶液混勻，4°C 8000rpm離心10min;
4) 小心吸取上層含有DNA的上清液，移入另一離心管中，再次加入等體積平衡酚重復(fù)(4.)操作；
5) 同法吸取上清液，加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)，緩慢顛倒離心管10min， 4°C 8000rpm離心10min;
6) 吸取上清后加入氯仿/異戊醇(體積比24:1)，與以上相同的條件離心；
7) 吸取上清液，加入1/10體積的NaAc (3M， pH5.2)及2倍體積的無水乙醇(無水乙醇要預(yù)冷)， 振蕩離心管可見內(nèi)有白色的絮狀物，即DNA，于-20'C放置30分鐘；
8) 取出樣品，于12000rPm高速離心10min，小心倒掉上層無水乙醇；
9) 加入lmL 70%的乙醇洗滌沉淀，同樣12000rpm高速離心10min;
10) 小心棄去70%乙醇，在室溫下使殘留乙醇揮發(fā)，加入適量的TE溶解DNA;
11) 充分溶解后的DNA樣可在含有溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，同時(shí)在濃度測定儀 上測定濃度；將該DNA樣品存放于-20'C備用。
(3) PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系為10 ^iL: lOXBuffer 1.0 ^L， 25mMMg2十1.0 ^L， 4pM上游引物、下游引物(如 上所述)各0.5mL， 10mMdNTP0.2|iL， 5U4iLTaq酶0.2pL， 500ng/nLDNA0.8ML, ddH20 5.8(xL，
混勻、瞬時(shí)離心。
擴(kuò)增條件為94。C預(yù)熱12min —94。C變性30 s—65'C退火30 s—72'C延伸30 s (從第二步變 性到第四步進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，退火溫度在每個(gè)循環(huán)降1度)—94'C變性30 s—54'C退火30 s—72'C延 伸30s (從第五步變性到第七步進(jìn)行24個(gè)循環(huán))—72'C延伸10min—15'Cl0min， 4'C保存。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。 (4) PCR產(chǎn)物回收及測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)l. 2呢瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后 測序，測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長度為244bp和207bp。 2 PCR-SSCP檢測及其測序?qū)ふ襍NP位點(diǎn) (1) PCR-SSCP檢測
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取4uL擴(kuò)增產(chǎn)物中加入溴酚藍(lán)變性劑混合物(0.25%溴酚 藍(lán):變性劑=體積比為1:4) 10uL， 95。C變性15min。變性結(jié)束后立即將PCR管置于冰水混合物上 冰浴，防止DNA單鏈復(fù)性。然后在膠聯(lián)度為39:1的10%的聚丙烯酰胺凝膠上點(diǎn)樣進(jìn)行電泳檢測。 1) 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制(總體積35mL) 40%丙烯酰胺溶液 9mL 雙蒸水 19mL 5XTBE緩沖液 3.5mL
10% AP溶液 200 u L
5N,N，N' ,N'-四甲基 乙二胺(TEMED) : 20 UL
將以上溶液于小燒杯中混合搖勻。
2) 上樣、電泳
凝膠聚合后拔出梳子，用注射器吸取1XTBE緩沖液(購自上海亞培生物科技有限公司)沖洗 梳孔，以除去未聚合的膠液，使樣品容易沉降。組裝好電泳設(shè)備，用1%的瓊脂糖膠液封閉好玻璃板 與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。在上下緩沖槽中倒入足量1XTBE緩沖液，用50nL 微量進(jìn)樣器將PCR變性產(chǎn)物緩緩注入梳孔。上樣完畢后開啟電泳儀電源，在110V-120V恒壓下電泳 6-8小時(shí)，直至二甲苯氰電泳指示條帶遷移到凝膠底部。
3) 凝膠染色
電泳完畢，取下玻板，小心地將凝膠從玻板上剝離下來，放入雙蒸水中漂洗一次，然后浸入10% 乙醇溶液固定5-10min;用1%硝酸脫色3-8min,然后雙蒸水迅速漂洗一次，0. 2%硝酸銀晃動閉光染 膠15-25min;染色結(jié)束后用雙蒸水快速沖洗凝膠兩次(每次10s)，洗去凝膠表面殘留的硝酸銀溶 液。在染膠盒中倒入含3%化20)3和微量甲醛的顯色液，立即快速地晃動膠盒，避免析出的黑色銀顆 粒在凝膠表面沉積。顯色液顏色變暗時(shí)立即更換新鮮的顯色液。注意觀察顯色情況，目的條帶顯現(xiàn) 清晰后立刻將凝膠轉(zhuǎn)入3%的乙酸溶液，浸泡lOmin停顯。
4) 凝膠成像與電泳條帶分析
將目標(biāo)條帶清晰的凝膠在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描并保存電泳圖譜。根據(jù)電泳條帶判 斷基因型。
(2) PCR產(chǎn)物的純化和測序
在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL Ependorff管中，然后 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自日本TOYOBO公司，按照該試劑盒的說明書操作)純化PCR產(chǎn)物。純 化方法為在1. 5 ml離心管中加入400 u L吸附液，在凝膠完全溶解之前將其放置在室溫中，且不 時(shí)進(jìn)行攪拌，如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或溶膠難以溶解時(shí)，放入55'C水浴鍋溫浴5min，加入 30liL磁珠，經(jīng)常用漩渦混合器攪拌，并放置2min (室溫)，然后放入離心機(jī)(6000卬m, 5sec)， 加入600iiL洗凈液，攪拌10sec，離心(6000rpm, 5sec)，加入lmL 75%無水乙醇，攪拌10sec， 瞬時(shí)高速離心，徹底去除上清部分(打開微型試管的蓋子，55'C下放置5min，干燥)，加入 25uL-100uL蒸餾水，攪拌10sec,放置2min后離心(6000rpm， 5sec)，回收上清液。上清液中 含有回收的目的片段。
從兩個(gè)品種的樣品中分別挑選幾個(gè)DNA樣品送到上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。
(3) DNA序列比對及突變位點(diǎn)的鑒定 用測序獲得的基因序列進(jìn)行序列同源性比較，用DNAstar5. 01軟件SeqMan和MegAlign工具對
測序峰圖進(jìn)行分析，以鑒定和獲得該DNA序列的突變信息。 3、 PCR-RFLP診斷方法建立
(1) PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增如前面所述。(2) PCR產(chǎn)物酶切 設(shè)計(jì)的引物如下-
上游引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' 下游引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3
PI酶切反應(yīng)體系為lOuL:限制性內(nèi)切酶M"/1 0.2uL (lOU/uL), lOX緩沖液luL， PCR 產(chǎn)物2uL，加ddH20至10wL， 55。C條件下水浴酶切3 4小時(shí)。
(3) PCR-RFLP檢測
酶切產(chǎn)物檢測由于本試驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷較小，所以都用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行酶切結(jié)果檢測， 所用的丙烯酰胺膠聯(lián)度為29:1濃度為8%的凝膠。 每板膠35mL，配制方法
30%丙烯酰胺9.3mL
雙蒸水 18.42mL
5XTBE: 14mL
腦AP: 0.23mL
TEMED: 20 uL
酶切產(chǎn)物用8%丙烯酰胺凝膠電泳，緩沖液為1XTBE， 110V恒壓4小時(shí)，用銀染法染色，拍照，并 由帶型來判斷基因型，記錄基因型。結(jié)果如表1-3.
表l Poulfl-g/"/I變異位點(diǎn)在牛群中的等位基因頻率和基因型頻率
等位基因頻率
基因型 樣本數(shù) 基因型頻率
Allele frequency
Genotype Number Genotype frequency
_^_
AA 14 0.0526 0.2199 0.7801
AB 89 0.3346
BB 163 0.6128
合計(jì) 266 1.0
表l顯示出Poulf1-Hinf I變異位點(diǎn)在牛群中的等位基因頻率和基因型頻率，在266頭奶牛中， 其中BB基因型在該研究群體中的頻率最大，為0.6128、其次是AB基因型，為03346、而AA基因型最 低，為0.0526。等位基因A的頻率為0.2199，等位基因B的頻率為O. 7801。由此可以看出B為優(yōu)勢等 位基因。
表2 尸ou7/7基因g切/1酶切多態(tài)性與產(chǎn)奶量的統(tǒng)計(jì)分析
基因型隨-、w 樣本數(shù)產(chǎn)奶量
GenotypeNumbeMilk yield
AA146574.65±1217.16a
AB896167.64±1429.21a
BB1635987.69±1286.10b
7注具有相同字母表示差異不顯著(PX).05)，字母不同表示差異顯著(PO.Ol)。 表2看出三種基因型間對奶牛產(chǎn)奶量的影響沒有達(dá)到顯著差異(P>0. 05)，但是M型和BB型之間、 AB型和BB型之間達(dá)到了顯著差異(P〈0.05)。
表3 /^WW基因Hinfl酶切多態(tài)性與乳脂率和乳蛋白率的統(tǒng)計(jì)分析
記錄數(shù) Numble
基因型 Genetype
AA
AB
BB
乳脂率 Fat percent (%) 乳蛋白率 Protein percent (%)
132 3.995±0.197a 3.488i0.417b 3.674±0.447a'
132 2.963 ±0.458a 3.023 ±0.254a 3.018±0.237a
注具有相同字母表示差異不顯著(PX).05),字母不同表示差異顯著(PO.Ol)。 表3可知P0U1F1-Hinf I不同的基因型對乳脂率和乳蛋白率的影響有顯著的差異(P>0.05)。 M 型和AB型之間的差異達(dá)到了極顯著水平(P〈0. 01); AA型、AB型與BB型之間達(dá)到了顯著水平(P〈0. 05)。 乳蛋白率在不同基因型之間沒有顯著的差異(P>0.05)。 M型的個(gè)體乳脂率最高，AB型的最低。但 是AA型個(gè)體的蛋白率是最低的，AB型的蛋白率是最高的。
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〈222> (l).. (15954)
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<220>
〈221> primer—bind
<222> (15867).. (15882) <223> 〈220〉
〈221〉 primer—bind
〈222> (15432).. (15451) <223> 〈220>
<221> mutation
<222> (15640).. (15640)
<223>
〈400> 1
tcttctccgt ttctattctt ttgtgggaat gagttgccaa ccttttactt cgactgatac 60ctttatacctctgaattctgagtcttctgcaactctgcctctgataatgcatcccagtgc120
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C朋t33C3gtctacatgcggctgcgcctta3g3t3tC3ggstgggtgctttgaatcttgc240
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C33C3gtgggtaaaataatt3gatgttt犯atacactttattc3gatggt660
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18
權(quán)利要求
1、牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)的POUIF1基因片段作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第15640bp處有1個(gè)A15640-T15640的堿基突變，導(dǎo)致HinfI-RFLP多態(tài)性。
2、 一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)的P0UIF1基因片段，它的核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中檢測序列表SEQ ID NO: 1的第15640bp處A-T堿基突 變的正、反向引物對的DNA序列如下所示正向弓l物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3', 反向引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域。具體公開了一種奶牛泌乳量及品質(zhì)相關(guān)的POUIF1基因片段作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。所述基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第15640bp處有1個(gè)A15640-T15640的堿基突變，導(dǎo)致HinfI-RFLP多態(tài)性。同時(shí)公開了擴(kuò)增所述基因和檢測序列表SEQ ID NO1的第15640bp處A-T堿基突變的正、反向引物對的DNA序列。本發(fā)明為奶牛分子標(biāo)記輔助選擇提供了一種新標(biāo)記。
文檔編號C12N15/12GK101525664SQ20091006166
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者勇 余, 輝 劉, 劉興斌, 張淑君, 楊利國, 楊煥堂, 武防杰, 江一波, 胡修忠, 談宇青 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)