專利名稱：：控制水稻纖維素合成的基因bc1l4作為水稻遺傳改良的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)控制水稻纖維素合成和產(chǎn)量的基因5C7丄4的克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。本發(fā)明利用T-DNA標(biāo)簽技術(shù)，利用正向遺傳學(xué)的方法，從水稻T-DNA插入突變體庫(kù)中得到了一個(gè)控制水稻纖維素合成和結(jié)實(shí)率的基因5C"4，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了5C7Z4基因的功能。本發(fā)明還涉及利用該基因或其功能類似物改變細(xì)胞壁組分如纖維素、木質(zhì)素、半纖維素及成分，從而促進(jìn)秸桿資源的有效利用。
背景技術(shù)：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，它養(yǎng)育了全球近半數(shù)的人口，如何提高水稻的產(chǎn)量是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的重要問(wèn)題。除生產(chǎn)稻谷外，水稻的秸桿還可以作為一種可再生的生物能源加以利用。隨著石油資源的日趨衰竭，世界能源危機(jī)正威脅著人類社會(huì)的進(jìn)步。發(fā)展可再生能源，尤其是利用生物質(zhì)能，引起了全球的廣泛關(guān)注。纖維素是水稻秸桿的主要成分之一，它是世界上最豐富的天然有機(jī)物，蘊(yùn)藏著植物界碳含量的50%以上，植物光合作用的大部分能量以纖維素的形式儲(chǔ)存下來(lái)。人類一旦掌握了釋放出存儲(chǔ)在纖維素中能量的技術(shù)，能源危機(jī)便可迎刃而解。利用纖維素資源生產(chǎn)生物乙醇被認(rèn)為是解決能源危機(jī)的最為理想的辦法。纖維素通過(guò)酶法或者化學(xué)轉(zhuǎn)化,可降解成葡萄糖、木糖等物質(zhì)，進(jìn)一步通過(guò)工業(yè)發(fā)酵，形成生物乙醇替代石油，這是人類利用植物源能源的最初設(shè)想。但是由于纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維素大分子的降解一直是生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的難點(diǎn)，目前圍繞著提高纖維素的轉(zhuǎn)化率開(kāi)展了多方面研究，如重整天然纖維素的結(jié)構(gòu)，降低結(jié)晶度，脫木質(zhì)素等等，一旦解決了纖維素轉(zhuǎn)化的難題，人類在利用植物源能源方面將取得突破性進(jìn)展(張衛(wèi)明等，生物質(zhì)能的利用和能源植物的開(kāi)發(fā)。2007，南京師大學(xué)報(bào)，30:68-74)。天然纖維素以微纖絲的形式存在。纖維素微纖絲由一種不分支的e-i,4-D-葡萄糖鏈組成，每條鏈含有幾千到上萬(wàn)個(gè)葡萄糖分子。每條纖維素微纖絲約3納米厚，由36條平行的葡萄糖鏈包裝而成。葡萄糖鏈之間通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(Taylor等，Cellulosebiosynthesisanddepositioninhigherplants.2008,Newphytologist,178:239-252)。由于纖維素微纖絲結(jié)構(gòu)致密，使得纖維素難以降解。近年來(lái)，人們通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞壁合成突變體的研究，發(fā)現(xiàn)一些纖維素合成突變體具有非結(jié)晶態(tài)的纖維素組成，這種非結(jié)晶態(tài)的纖維素很容易被降解。所以通過(guò)對(duì)纖維素合成相關(guān)基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蚬こ谈脑欤梢匀藶榈馗脑焯烊焕w維素的結(jié)構(gòu)，降低纖維素結(jié)晶度，從而效利用纖維素生物能源。利用突變體資源，人們已經(jīng)克隆了幾個(gè)纖維素合成相關(guān)的基因。例如，CEXW基因是最早克隆的纖維素合成酶基因，它的突變能引起細(xì)胞壁纖維素含量的減少，并引起大量非結(jié)晶態(tài)纖維素的積累(Arioli等，MolecularanalysisofcellulosebiosynthesisinArabidopsis.1998,Science,279:717-720);KOiWUG乂雄因編碼一種e-l，4葡萄糖酶，它突變后導(dǎo)致植物纖維素含量的減少及結(jié)晶度的降低(Nicol等，Aplasmamembrane-boundputativeendo-l，4-beta-D-glucanaseisrequiredfornormalwallassemblyandcellelongationinArabidopsis.1998，EMBOJ，17:5563-5576);《(95/70/基因突變后能導(dǎo)致纖維素合成受阻及纖維素沉積方向的雜舌L(Pagant等'K05/7DJencodesanovelplasmamembraneproteinnecessaryfornormalsynthesisofcelluloseduringcellexpansioninArabidopsis.2002，PlantCell,14:2001-2013);擬南芥中的CO別"基因突變能引起植株纖維素含量的下降及其排列方向的雜亂(Schindelman等，COBRAencodesaputativeGPI-anchoredprotein,whichispolarlylocalizedandnecessaryfororientedcellexpansioninArabidopsis.2001,GenesDev，15:1115-1127)。這些基因突變體的一個(gè)共同特征就是纖維素含量和結(jié)晶度的下降，利用這一特點(diǎn)人們可以通過(guò)基因工程手段改變天然纖維素的結(jié)構(gòu)，使其易于降解，生產(chǎn)生物能源。COiWi4編碼一種糖磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬于一個(gè)植物特有的蛋白質(zhì)超家族。CO說(shuō)"家族在擬南芥中有12個(gè)成員，在水稻中有l(wèi)l個(gè)成員，在玉米中有9個(gè)成員(Roudier等，TheCOBRAfamilyofputativeGPI-anchoredproteinsinArabidopsis.Anewfellowshipinexpansion.2002，PlantPhysiol,130:538-548;Li等，S^/TTZECf/iM7，whichencodesaCOBRA-ikeprotein,affectsthemechanicalpropertiesofriceplants.2003，PlantCell,15:2020-2031;Brady等，CombiningExpressionandComparativeEvolutionaryAnalysis.TheCO￡;t4GeneFamily.2007，PlantPhysiol,143:172-187)。除CO^L4外，該家族的多個(gè)成員參與植物細(xì)胞壁及纖維素生物合成，如AC(9Si^、Oy5C7和Zm5^2,這些基因突變后分別引起擬南芥、水稻和玉米植株莖桿機(jī)械力的降低禾卩纖維素含量的減少(Persson等,Identificationofgenesrequiredforcellulosesynthesisbyregressionanalysisofpublicmicroarraydatasets.2005，ProcNatlAcadSciUSA,102:8633-8638;Li等，丑/f/T7XfiCC/丄A//,whichencodesaCOBRA-likeprotein,affectsthemechanicalpropertiesofriceplants.2003，PlantCell,15:2020-2031;Ching等，Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycell.2006，Plants224:1174-84)。本發(fā)明通過(guò)T-DNA標(biāo)簽技術(shù)首次從水稻突變體庫(kù)中分離克隆5C7丄4基因，該基因編碼一個(gè)COBRA-like蛋白，突變體表型分析及互補(bǔ)分析表明5C/i^基因在控制水稻產(chǎn)量和纖維素合成過(guò)程中起重要作用。對(duì)該基因的研究有助于人們了解水稻生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，利用現(xiàn)代基因工程方法，改造纖維素含量和結(jié)構(gòu)，提高谷物的產(chǎn)量，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的能源型新品種，對(duì)于減緩能源危機(jī)和食品危機(jī)具有雙重意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個(gè)利用突變體克隆的調(diào)控水稻纖維素合成和產(chǎn)量的基因萬(wàn)C7i^的應(yīng)用，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述的基因轉(zhuǎn)化到水稻植物體內(nèi)，以調(diào)控植物的纖維素結(jié)構(gòu)或/和水稻產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人克隆得到一個(gè)控制水稻纖維素合成基因BC1L4,該基因BC1L4是下列核苷酸序列之一O序列表SEQNO:1中所示的DNA序列；或2)編碼與1〉編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明克隆的水稻5C"4基因的T-DNA插入失活突變體表現(xiàn)為分蘗少、矮化、纖維素含量降低和結(jié)實(shí)率下降，正常功能的5C7i4基因轉(zhuǎn)化該突變體后植株恢復(fù)植株纖維素含量，植株結(jié)實(shí)率正常(見(jiàn)實(shí)施例1-3)。此外，50￡#基因與幾個(gè)纖雄素合成相關(guān)基因共表達(dá)，它們之間存在一種負(fù)反饋的調(diào)節(jié)模式，為基因工程操作纖維素合成提供了研究機(jī)理(見(jiàn)實(shí)施例4)。本發(fā)明還提供了一種利用SC化4基因進(jìn)行高效植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體，如圖3A所示的互補(bǔ)載體pCg001(見(jiàn)實(shí)施例3所示)。本發(fā)明還有一種含有以上表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞。本發(fā)明克隆的5C/W基因可用于與其它調(diào)控元件，如組成型啟動(dòng)子(如CaMV35S啟動(dòng)子)或器官特異性啟動(dòng)子融合構(gòu)建基因表達(dá)載體'通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、反義RNA或RNAi等技術(shù)人為調(diào)控水稻結(jié)實(shí)率及調(diào)節(jié)纖維素合成和降解，從而達(dá)到有效增強(qiáng)水稻產(chǎn)量和提高秸桿的利用率的目的。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下1.利用已有的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)(突變體庫(kù)的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表論文，見(jiàn)Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome,PlantJ(2003):418-427;Zhang等,Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary,PlantJ(2007):947-959)篩選得到一個(gè)分蘗少、矮化、結(jié)實(shí)率低的突變體6c/，突變體的篩選鑒定方法見(jiàn)實(shí)施例1第1部分中詳細(xì)描述。2.通過(guò)測(cè)定纖維素含量測(cè)定和纖維素染色，發(fā)現(xiàn)在6c7W突變體中纖維素含量明顯下降，表明該基因能夠調(diào)控水稻纖維素的合成(見(jiàn)實(shí)施例2)。3.采用Tail-PCR方法(Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T陽(yáng)DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary,PlantJ(2007):947-959)分離突變體的側(cè)翼序列，通過(guò)序列分析顯示T-DNA插入SC7丄4基因(LOC—Os05g32110,www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/index.shtml)的編碼序列中(實(shí)施例1第2部分)。4.通過(guò)T-DNA插入與突變性狀的共分離驗(yàn)證(按實(shí)施例1的第3部分T-DNA插入與突變表型的共分離檢測(cè)執(zhí)行)及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例3)證明本發(fā)明獲得的候選基因5C7^/的失活是引起k^/4突變表型的原因。5.利用本室的CREP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pD搜索￡C"4基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)SC"4基因與幾個(gè)纖維素合成相關(guān)基因共表達(dá)；利用定量RT-PCR技術(shù)分析6c/突變體和野生型植株中幾個(gè)纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)^C7i^基因的突變能引起一系列纖維素合成基因表達(dá)量的上升(見(jiàn)實(shí)施例4)。更詳細(xì)的技術(shù)發(fā)明細(xì)節(jié)將由下述實(shí)施例給出。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明利標(biāo)簽發(fā)克隆基因快速、高效。2.本發(fā)明提供了一個(gè)調(diào)控水稻纖維素合成、影響水稻產(chǎn)量的基因￡C^>/及其編碼蛋白。該基因?qū)τ谒纠w維素合成分子機(jī)理的研究具有重要的理論價(jià)值。3.將含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能的DNA片段進(jìn)行改造，導(dǎo)入植物體，可以人工提高水稻的產(chǎn)量及改變細(xì)胞壁纖維素的含量和結(jié)構(gòu)，從而為有效利用纖維素資源提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明作限定。圖l.水稻&"/4突變體的表型。(A)野生型植株(WT)與6"W突變體成熟期的表型，6"W突變體與野生型相比分蘗較少、矮化。(B)野生型植株(WT)與^/W突變體穗部的表型差異，6"W突變體穗變小、結(jié)實(shí)率降低。圖2.野生型植株(WT)和6c/W突變體的纖維素含量。(A)6c/W突變體纖維素含量較對(duì)照明顯降低，減少約24%。標(biāo)準(zhǔn)誤取自5次生物學(xué)重復(fù)。(B-E)對(duì)野生型(B、D)與6c/W突變體(C、E)的第二節(jié)間進(jìn)行Calcofluor(fluorescentbrightener28;Sigma)纖維素染色，可見(jiàn)6c/"突變體顏色較淺，即纖維素含量較少。圖3.5C1W基因與突變表型的共分離驗(yàn)證。(A)SC/L4基因的結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位點(diǎn)分析。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經(jīng)標(biāo)出，方框表示5C/Z^基因的外顯子，方框之間的線條表示內(nèi)含子，T-DNA插入在第四個(gè)外顯內(nèi)。LB和RB分別代表T-DNA的左邊界和右邊界。PI，P2表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位于T-DNA上的邊界引物。(B)T1代共分離實(shí)驗(yàn)?zāi)z圖。植株基因型的確定純合T-DNA插入植株當(dāng)P2和P3配對(duì)時(shí)可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，由于T-DNA插入片段太大，PI與P2配對(duì)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；野生型植株由于無(wú)T-DNA插入，故P2和P3配對(duì)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，但PI與P2配對(duì)擴(kuò)增能得到目標(biāo)產(chǎn)物；而SC/Z>/雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株用PI和P2配對(duì)以及P2和P3配對(duì)時(shí)都可以得到目的產(chǎn)物。W代表野生基因型的植株，H代表雜合基因型的植株。M代表純合基因型的植株。植株表型20個(gè)Tl代單株中第4、5、6、14株為突變表型。由圖可知突變植株的基因型均為SC/W純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生或雜合型，這一結(jié)果表明突變表型與5CLL4基因內(nèi)的T-DNA插入共分離。圖4.功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。(A)互補(bǔ)載體pCg001結(jié)構(gòu)示意圖，該載體的構(gòu)建說(shuō)明見(jiàn)實(shí)施例3中的第1部分，即將基因5C7W的啟動(dòng)子和全長(zhǎng)基因通過(guò)Hindffl酶切后克隆到載體pCAMBIA2300(購(gòu)自CA朋IA公司，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新質(zhì)粒。pC2301空載體作為陰性對(duì)照。(B)功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)空載體的植株仍為突變表型，而轉(zhuǎn)5CIW基因的植株恢復(fù)野生型表型，即丑C化4基因能互補(bǔ)突變體的突變表型。左邊是野生型，中間是空載體轉(zhuǎn)化株，右邊為恢復(fù)正常表型的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化株。圖5.幾個(gè)纖維素合成相關(guān)基因在野生型和fcJ"突變體中的表達(dá)差異?？梢?jiàn)所有檢測(cè)的纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平在6c似突變體中都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這反映了纖維素合成過(guò)程中的一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:丑C7厶4基因的分離克隆1.6c7W突變體的獲得所用的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)由本申請(qǐng)人所在作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用載體pFX-E24.2-15R構(gòu)建而成的(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.2003,35:418-427;Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007，_P/awf,49:947-959)。該突變體庫(kù)已向全世界公開(kāi)(http:y7rmd.ncpgr.cn/),可以通過(guò)常規(guī)手續(xù)索取。2005年，從TO代突變體庫(kù)(見(jiàn)http:Wrmd.ncpgr.cn/,Zhang等，RMD:aricemutantdatabaseforfunctionalanalysisofthericegenome,NucIAcidsRes(2006):D745-D748)挑選出2000份水稻轉(zhuǎn)基因品種"中花ll號(hào)(為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的常用水稻品種)"的種子，經(jīng)浸種、催芽等常用步驟后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料種兩行，每行10株，為一個(gè)家系。種植密度為5寸X8寸，種植地點(diǎn)為湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山地區(qū)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的試驗(yàn)田，按常規(guī)的水稻種植方法進(jìn)行田間管理。經(jīng)過(guò)大田篩選共獲到60個(gè)分蘗性狀突變的家系，主要包括分蘗多、分蘗少及分蘗角度等類型的突變體。其中，有一個(gè)家系的突變體表型為分蘗少、矮化、穗小、結(jié)實(shí)率降低(如圖l)，申請(qǐng)人把這個(gè)突變體命名為6c7W。2.分離6c7W突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列利用Tail-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)技術(shù)(Liu等，ThermalsymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomalwalking.1995，Genomics,25:674-681;Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007,PlantJ,49:947-959)分離了這個(gè)家系的側(cè)翼序列。根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況確定插入位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該側(cè)翼序列位于水稻的第5染色體上，插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于水稻基因組注釋網(wǎng)站(http:〃rice.plantbiology.msu.edu/)上的一個(gè)基因(登錄號(hào)LOC_Os05g32110)，該基因?yàn)镃OBRA蛋白家族的一個(gè)成員，命名為5C7H5C/W基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，T-DNA插入第4個(gè)外顯子中(見(jiàn)圖3A)。利用Tail-PCR方法(文獻(xiàn)參見(jiàn)本實(shí)施例)分離得到的6c/W突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列如下cgggggggatttcgtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatccttcctgctgtgtatctctctcatcattttataatgacacaattgtgaactgcccaacatgctcttgtggctgcc犯犯caatgggac卿tcctggaagctgtgt3aagtg3gtt3ataaaaccaaaactcttacttcgcttcttgttgaggcccaacttttctgc犯冊(cè)ttgctaacaagttccatgcatttccacagtgagaattcaccttatttacaatctgccattgatggccctggcaaatggaccggtcagcctcttgtccaatgtacttctcacatgtgcccgatcagaatccactggcatgtgaaactcaactataaggaatattggagagtgaagatcacgattacgaacttcaact3ccgcatgaatt3cacacagtggaatttggtcgctcaacatcctaacttc犯taatatcacccagctgtttagcttcaactax;aagcc3ctt3ctccatatggaagcaagataagtaagtcaatttacaaactgttctcctttatttaagaaaattggagtgcacttgtaatacgttccttcatctcactcgtcctactctctatcggtgatcgaagtttattctttgaggtatatatgatactgcgatgattctgggg卿taagttctataacgatgtgctcatgagagctgggtccacttgg3tatgcacacgtcag犯ctttcttctgcggaaggattctg3ggatcttcctctttggagaggggatgggcccttccccagcaccgcgtgtacttc幼tggatg3t犯ttggtgtcatgccgcccttcgggatgcatctccattggttggcttatggcaggttctctctggacaaaagcaaccattggaccctcggggggtgtggctatttcc犯attcgggtgggcctacUtgcggggcttaggcgatggagtggaggggatcccg卿aattttcgggggactttcaatgttgcaggcccatgtgggggacactgccaacaaatacttggtctactcgtcgttc卿g3.5C7i^基因的突變導(dǎo)致植株矮小、結(jié)實(shí)率低的表形為了證實(shí)分蘗少、矮化、結(jié)實(shí)少的突變表型是由于BCZ4基因內(nèi)的T-DNA插入引起，本發(fā)明對(duì)20個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因植株(其中，第4、5、6、14株為突變表型)進(jìn)行了T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列與突變表型的共分離檢測(cè)。共分離檢測(cè)的具體步驟為(1)在5C7丄4基因T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)基因組引物P1(5，墨CTGGGACTACCAACAAGACA-3，)和P2(5，誦AGTTAGGATGTTGAGCGACC-3，)，在T陽(yáng)DNA上設(shè)計(jì)一條載體引物P3(5，-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3'),如圖3A。在T1代植株中，5C"純合T-DNA插入植株只有當(dāng)P2和P3配對(duì)時(shí)才可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，由于T-DNA插入片段太大，P1與P2配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物無(wú)法得到；野生型植株由于沒(méi)有T-DNA的插入，所以P2和P3配對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有產(chǎn)物，但可以利用引物P1與P2配對(duì)擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物；而5CLW雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株則P1和P2配對(duì)以及P2和P3配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。(2)應(yīng)用CTAB法(參fi^Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandthepreciselocationoftheS5locusinthemolecularmap.1997，TAG，95:809-814)從20株T!代單株中分別抽提總DNA作為模板，用(1)中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20pL，具體包含DNA模板1^iL;10倍體積的Taq7酶反應(yīng)緩沖液2nl;2mMdNTP1.5nL;25mM鎂離子1.2pL;10pM引物0.2pL;0.3單位Taq酶，加雙蒸水至20inL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下94°C5min;94。C45sec，53。C45sec，72°C1.5min，28cycles;72'C5min，25'Clmin。(3)將反應(yīng)產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)凝膠上的帶型判定各個(gè)單株的基因型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20株T!代單株中，4株突變體表型植株的基因型均為5C7W純合T-DNA插入，而其他13株表型正常的植株基因型為野生或雜合型(如圖3B)。這表明6c7W突變體的突變表型是由于5C7丄4基因內(nèi)的T-DNA插入造成，且該突變體為隱性突變體。實(shí)施例2:fiCIL4基因控制水稻纖維素的合成由于COBRA家族的多個(gè)成員參與植物纖維素的合成，且一些纖維素合成酶的突變體也具有同6c/"相似的表型(Tanaka等，Threedistinctricecellulosesynthasecatalyticsubunitgenesrequiredforcellulosesynthesisinthesecondarywall.2003,PlantPhysiol,133:73-83)。為了確定5C7丄4基因是否參與水稻纖維素的合成，本發(fā)明測(cè)定了6c7W突變體與野生型植株莖桿的纖維素含量。結(jié)果如圖2A所示，6c/W突變體的莖桿纖維素含量較野生型明顯降低，減少程度約為24%。另外，為了確定6d/4突變體纖維素的減少是否位于特定的細(xì)胞，申請(qǐng)人對(duì)突變體與對(duì)照的第二節(jié)間橫切片進(jìn)行了calcofluor染色。Calcofluor(fluorescentbrightener28;Sigma)染色能使纖維素在紫外光照射下發(fā)出綠色熒光，而熒光的強(qiáng)弱直接反映了纖維素含量的多少。結(jié)果如圖2B-E所示突變體(圖2C、E)與野生型(圖2B、D)有明顯的顏色差異，突變體的顏色相對(duì)于野生型染色要較淺，這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明6c7W突變體的纖維素含量都減少了。所以可以得出5C"4基因參與水稻莖桿纖維素的合成，而纖維素合成的障礙可能就是導(dǎo)致6c/W突變體分蘗少、矮化、結(jié)實(shí)率下降等突變表型的原因。纖維素含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)具體步驟如下:(I)將突變體與對(duì)照的莖桿第二節(jié)取下，液氮磨成細(xì)粉，在50mMPH7.2的磷酸緩沖液中洗3次，70%的乙醇70°C提取1小時(shí)，重復(fù)兩次,真空烘干。每份材料各取5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。(2)樣品中加入500nL乙酸-硝酸試劑，混勻，沸水煮30分鐘。離心，棄上清，加lml水重懸。離心，棄上清，力口lml丙酮。離心，棄上清，干燥，力口800^L67%的硫酸室溫溶解1.5小時(shí)，取10nL稀釋至lml。(3)再取40^L加160^L水，冰凍，加400nL蒽酮(0.02克蒽酮溶于10ml濃硫酸，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前冰箱中冷卻2小時(shí)以上)，沸水浴16分鐘，冰上放2-3分鐘，室溫放置5-10分鐘，測(cè)定A620處的吸光度。(4)將0.02克watermanpaper紙溶于800pL67%的硫酸，加水到200ml，分別取20nl、40nl、60^1加水至200nl，其余步驟同(3)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出突變體與對(duì)照樣品中的纖維素含量。纖維素染色步驟如下用0.005%的calcofluor(fluorescentbrightener28;購(gòu)自Sigma公司)將野生型與突變體的切片(10um厚)染色2分鐘，在熒光顯微鏡(DM4000B，Leica^Germany)下觀察、拍照。實(shí)施例3:轉(zhuǎn)化BC7Z^基因?qū)е峦蛔凅w纖維素含量升髙，1.5C7丄4基因互補(bǔ)載體的構(gòu)建互補(bǔ)載體pCgOOl的構(gòu)建方法如下以pCAMBIA2301載體為骨架載體(購(gòu)自CAMBIA公司，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用HindIII酶切"日本晴"(一個(gè)公開(kāi)報(bào)道的水稻品種)BAC克隆OSJNBa007犯05,得到一系列將酶切片段，其中包括目的片段含整個(gè)5C/W基因編碼區(qū)及ATG前約1.9kb和終止密碼后約1.2kb，如圖4A。將酶切片段與HindIII酶切的去磷酸化的的載體質(zhì)粒pCAMBIA2301連接(所使用的內(nèi)切酶、堿性磷酸酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，連接酶購(gòu)自Promega公司，具體用法與用量參考該產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū))。連接產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為1800V,具體操作參考該儀器的使用說(shuō)明書(shū))導(dǎo)入大腸桿菌(購(gòu)自Promega公司)中，加800ulLB復(fù)蘇45分鐘，取250ul涂于含卡那霉素、X-gal及IPTG的LA平板，37。C溫箱培養(yǎng)14-16小時(shí)(LA與LB配方參考J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)。挑白色單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，通過(guò)PCR篩選陽(yáng)性克隆、酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證后得到目的克隆。把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌￡/"/05(購(gòu)自CAMBIA公司)菌株中。2.遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(參照Hiei等，Efficienttransformationofrice(Oy加s加VaL.)mediatedby爿gro6ac化"'i/附andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.1994,PlantJ,6:271-282)將互補(bǔ)載體pCg001導(dǎo)入6c/W突變體的愈傷，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有G418(購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司)抗性的愈傷、分化、生根及煉苗移栽大田得到轉(zhuǎn)基因植株(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑及配方見(jiàn)申請(qǐng)人已經(jīng)公開(kāi)的專利，
專利名稱：為水稻木質(zhì)素合成基因FC1及應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?00610018105.5;公開(kāi)號(hào)CN1995346)。按照相同的遺傳轉(zhuǎn)化方法將空載體pCAMBIA2301導(dǎo)入6c/"突變體的愈傷，得到的轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對(duì)照。本實(shí)施例研究結(jié)果顯示，將互補(bǔ)載體pCg001導(dǎo)入&/突變體的愈傷，共獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化苗96株，其中39株陰性,為突變表型，57株為陽(yáng)性，55株恢復(fù)正常生長(zhǎng)；獲得空載體轉(zhuǎn)化子30株，均為突變表型，如圖4B。以上結(jié)果表明分蘗少、矮化、結(jié)實(shí)率低的突變表型確實(shí)是由于5CLW基因突變而造成。為了檢測(cè)互補(bǔ)后代的遺傳穩(wěn)定性，本實(shí)施例隨機(jī)選取14份T0代互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株，利用Southern雜交(具體操作參考Wu等,Developmentofenhancertraplinesforftmctionalanalysisofthericegenome.2003,PlantJ，35:418-427)分析了這些互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，其中有5份互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株為單拷貝，這5份單拷貝互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株有3份獲得了Tl代種子。大田種植單拷貝家系的Tl代，其中恢復(fù)正常生長(zhǎng)的植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，而未恢復(fù)正常表型的植株均為轉(zhuǎn)基因陰性植株。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明te/W突變體的突變表型確實(shí)是由于5C/i^基因的突變而造成的。實(shí)施例4:fiC7i^基因與其它纖維素合成相關(guān)基因的關(guān)系及其實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明利用本申請(qǐng)人所在作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室CREP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:Vcrep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl),分析了5CIW基因與水稻基因組中所有其他基因的表達(dá)相關(guān)性。如表1所示，萬(wàn)C/W基因與9個(gè)基因具有很高的表達(dá)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)>0.88)，其中的5個(gè)基因(C￡&4/,C￡&4S,C五i人C￡&43,和CSLF6)或其同源物已經(jīng)被顯示參與纖維素的合成(Burton等，TheCe"genefamilyofbarley.Quantitativeanalysisoftranscriptsrevealstwogroupsofco-expressedgenes.2004，PlantPhysiol,134:224-236;Zhou等，OsGLUl，aputativemembrane-boundendo-l，4-beta-D-glucanasefromrice,affectsplantinternodeelongation.2006,PlantMolBiol,60:137-151;Burton等，TheGeneticsandTranscriptionalProfilesoftheCelluloseSynthase-Likei/vCs/FGeneFamilyinBarley.2008，PlantPhysiol,146:182卜1833)。5CL^基因與這些纖維素相關(guān)基因的共表達(dá)進(jìn)一步說(shuō)明5C7i^基因是水稻纖維素的合成中必需的基因。表1gC/W基因和水稻中其它基因的表達(dá)相關(guān)性分析(相關(guān)系數(shù)>0.88的基因被顯示)基因登陸號(hào)(水稻基因組注釋網(wǎng)站，相關(guān)系數(shù)基因注釋http:〃rice.plantbiology.nisu.edu/index.shtml)LOC_Os05g08370LOC_Os07gl0770LOC_Os05g04380LOC_Os03g526300.916443890.9150778420.W3083011CESA1CESA8peroxidase1precursor0.902740106endo-1，4-beta-glucanaseCel1LOC一Os02g335500.902465467VAMPproteinSEC22LOCJ3s07g241卯0.895753078CESA3LOC一Os04g475200.889758525auxin-independentgrowthpromoterLOC—Os08g063800.889380865CSLF6LOC—Os06g036400.887354336proteinbindingprotein為了調(diào)查其他纖維素合成基因的表達(dá)在&c7W突變體中是否被影響了，申請(qǐng)人利用常用的定量RT-PCR方法檢測(cè)了8個(gè)基因的表達(dá)水平，其中包括5個(gè)與5C/W共表達(dá)的基因(0&4/,C￡X4&C五",C￡&43,CS丄M)和三個(gè)在水稻中已經(jīng)克隆的纖維素合成酶基因(C五&HC￡&47,C五&49)。如圖5所示，C五&4i和CE&49的表達(dá)在te/W突變體中表達(dá)水平比野生型顯著升高了。盡管其他CESA基因、CiX7和C^:尸6的表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著的^變化，但它們的平均表達(dá)水平在6c/W突變體中也比野生型都有所提高。在&c7/4突變體中纖維素合成相關(guān)基因表達(dá)水平的上升反應(yīng)了纖維素合成過(guò)程中可能存在一種負(fù)反饋機(jī)制，即通過(guò)提高其它纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)k:7W突變體中的纖維素?fù)p失。定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)具體步驟參照Huang等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行(Huang等，Down-regulationofa5TZfiVT/yVfi9湖77QVyKl^L47i9A^relatedhistonedeacetylasegene,fls5y77,inducesDNAfragmentationandcelldeathinrice,PlantPhysiol(2007):1508-1519)。具體步驟如下(1)RNA材料準(zhǔn)備:取野生型與te7W突變體植株抽穗期第二節(jié)間的樣品，每種樣品各取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。(2)RNA樣品的抽提及反轉(zhuǎn)錄見(jiàn)參考文獻(xiàn)(Huang等'Down-RegulationofaS/Z:￡iVr7^FOiM477CWi￡G(/i^rcy2-RelatedHistoneDeacetylaseGene,OsvS77V,InducesDNAFragmentationandCellDeathinRice,PlantPhysiol(2007):1508-1519)。(3)定量RT-PCR在ABI7500定量PCRsystem(AppliedBiosystems，美國(guó))上進(jìn)行，采用2—A"相對(duì)定量的方法進(jìn)行表達(dá)量的比較。25nL反應(yīng)體系包含1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，12.5pL尸re肌'x￡T(Takara)，0.5wlRoxReferenceDyeII(Takara)及0.2^M引物。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下95°C/10sec;95'C/5sec,60°C/40see,40cycles。所有定量RT-PCR引物參見(jiàn)表2。表2本發(fā)明中使用的定量RT-PCR引物基因名稱正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')"""C￡&4_/TTGACTTGCACGATCGATACGTCCCACATAAACTGGACCCTGC￡&43GCATTTTTGCTACTGGCATCCTCCCTGGAACAAAGCAAAGAGC五認(rèn)GTTCGATGGCATTGATCGCACCACATAAACCGGACCTTGGAC五&47CCGGATGGATGATTCTTGTTGCCCCCAAAACACTTTTATCCCTGTTGAAGGTGCTGGATTCGATGAGAGTGGAGGCAACAAACGC雄9AGGCCATCCATGTCATCAGCTTTGAACCCCGTTAGGATGTCCTCACAGAGGTGCATCAATCCCCGGACATCTTTGAAGCCATCAC鮮6GCTCATGATCACCCCCATCATAGAAGTTGAAGAACACGCCGCG5孤/ACCGGCAAAGCCACTATTTGCCATCTGGCCCATCATCTCTA5CACCCCAACCTCAACAACGTCAAACATGCCGGTGTCGTTGAT5C7丄7GTGCAATGCCTCAGAGGATTCAAGCAATACGAAGGCCGAAG5C/ZJAAGTTGTCAGGTTCCACGGTGGCTTTCCTCAGCGTGACAACA5C7丄6CAATGACTTGCTCATGACGGCAAGGCCCAGCCTTTCTCAAAGBC"7CATCACCGAGGTCTTCAGCTTAGCCCATAGAACATCGCCGTA5C，ACTTCAGTCTTATGGCGCCTGTCATCAGAACTTGAGTCGCCCC/6/一/"AACCAGCTGAGGCCCAAGA_ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA通過(guò)植物基因工程技術(shù)可以將5C/￡4基因在水稻中特定組織部位或特定時(shí)期異位表達(dá)，通過(guò)調(diào)控5C7丄4基因的時(shí)空表達(dá)模式及表達(dá)量達(dá)到調(diào)控水稻產(chǎn)量和纖維素含量的目的。另外，還可以利用5C7丄4基因借助基因工程方法對(duì)植物纖維素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，培育纖維素結(jié)晶度低、易于降解新型能源型植物，從而提高植物秸桿的利用效率。本發(fā)明所涉及到的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑及配方如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine,6-節(jié)基腺嘌呤)；KT(Kinetin,激動(dòng)素)；NAA(Napthaleneaceticacid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，卩引哚乙酸)；2，4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid,2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KN03)28.3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0g硫酸銨((NH4)2S04)4.63g硫酸鎂(MgS04.7H20)1.85g氯化鈣(CaCl2.2H20)1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)J碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸錳(MnS04'4H20)0.44g硫酸鋅(ZnS04'7H20)0.15g室溫下溶解并定容至IOOOml。3)Fe2EDTAJfc存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeS04'7H20)2.78g在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70。C，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA'2H20)3.73g在它們都溶解后混合在一起，7(TC水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4'C保存?zhèn)溆谩?)維生素t!:存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素Bl(ThiamineHC1)0.1g維生素B6(PyridoxineHC1)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至lOOOml,4'C保存?zhèn)溆谩?)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4N03)硝酸鉀磷酸二氫鉀硫酸鎂氯化鈣室溫下溶解并定容至IOOOml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀硼酸硫酸錳(MnS04'4H20)硫酸鋅(ZnS04'7H20)鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20)硫酸銅(CuS04'5H20)氯化鈷(CoCl2'6H20)0.083g0.62g2.23g0.86g0.025g0.0025g0.0025g16.5g削g1.7g3.7g4.4g室溫下溶解并定容至IOOOml。7)2，4-DC存液(1rag/ml)2,4-D100mg.lmlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,室溫保存。8)6-BAJC存液(lmg/ml)6-BA100mg.1milN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml,室溫保存。9)NAAjfc存液(lmg/ml)NAA100mg.lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,4'C保存?zhèn)溆谩?0)IAA撥液(lmg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,4'C保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml,滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?3)IN氫氧化鉀忙存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至lOOml,室溫保存?zhèn)溆谩?4)KT貯存液(lmg/ml)KT100mg.1milN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAJt存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-DJC:存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至IOOOml,分裝到50ml三角瓶(25ml>,封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAje存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2,4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至卯Oml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至IOOOml,分裝到50ml三角瓶(25m1/，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素!t存液(100X)2.5ml2,4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至iJ5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250nlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液OOX)12.5mlN6mix母液(100X)Fe2+EDTA貯存液(100X)維生素貯存液(100X)2，4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉1.25ml2.5ml2.5ml0.75ml0.2g5g1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250piAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿),5)懸浮培養(yǎng)基5ml0.5ml0.5ml1ml0.2ml0.08g2gN6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJC存液(100X)維生素貯存液(100X)2，4-D貯存液CH蔗糖加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值至lj5.4,分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入lml葡萄糖貯存液和100plAS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJt存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH25ml2.5ml2.5ml2.5ml0.625ml0.15g"g1.75g封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250nl50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。瓊脂粉加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值至U6.0，7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(ioox)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAAJt存液50nlIAA貯存液50piCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250pl50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100ralN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAlt存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA)d存液2mlKTIC存液2mlNAAJt存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCHlg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝至ijlOOml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTAJt存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后室溫保存?zhèn)溆谩?4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2)15分(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度26il'C。愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度26士rc。預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫度26士rc。農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28'C;(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD60()0.8-1.0;(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度19-20。C。愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗漆愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm,第二次以后為250ppm)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26'C，5—7周。生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26'C。移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。在溫室煉苗約2周左右后，再移載大田。序列表<110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>控制水稻纖維素合成的基因BC1L4作為水稻遺傳改良的應(yīng)用<130〉〈141〉2009-05-13〈歸1〈170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211>2851〈212>DNA<213>水稻(Oryzasativa)<220〉<221>gene〈222>(1)..(2851)<223>〈220〉〈221>exon〈222>(2559)..(2848)〈223〉〈220〉<221〉exon〈222〉(2158)..(2438)〈223>〈220〉〈221〉exon〈222〉(1907).(2066)<223〉<220><221〉exon〈222〉(1053)..(1509)<223〉<220〉〈221>exon<222>(689).(768)〈223〉〈220〉<221>exon<222>(1)..(103)17〈223〉<400〉18tggcggtgggggga>gccggg3gctcc卿tecgtggcgccgtgctgc48MetAlaValGlyGlyAlaGlySerSerArgSerValAlaProCysCys151015tgctgcgccgtgctgetcgcggcggcgctgetcttctccgcgccggcc96CysCysAlaValLeuLeuAlaAlaAlaLeuLeuPheSerAlaProAla202530accacaggtttccccggctctcgctccttctctctctctctctctgtttgcgcctgc153ThrThrcagctcgtgccgtgccggtctcagatccatgcgccggcccgatcgecgaggctctcgact213犯ctttcacga_gttgtg3cc3cgag3tttgggc幼tgcgatcccctcctgsctgtgtcgg273tggctccagttcggtgtgtcggtggctttttttttttttttgaattccgattcgtttcat333cagtaattcagttcgtttcgctcctgcttttgccag犯ttcttggagcagattaggtagc393agtaattcagttcgtttcgctcccgcttgaceggattettggatcaggttaggtagctta453gatccattgagaggagcacgcatggagcttccttcccacactaatcagtgcccaaggtga513cacgatataacgtttcccttc鄉(xiāng)卿ggcctaactcatggttcaggatcgaattcga^agggcttattcttgstatgcaaaaaattccc3tctgccgaaactcttttttttccagatcgctgctaatttgttttcctctaaategggat573acccccattt633tgcagag690GlugettatgatgcgctggatccaaatggaaacateAlaTyrAspAlaLeuAspProAsnGlyAsnlieacgataa犯tgggac738ThrlieLysTrpAsp404550gttatgtcgtggactcctgatggctatgttgtaagtagcaaccccacaccValMetSerTrpThrProAspGlyTyrVal556078818aaaaaatgc3tcttgt3ttgttcgttcaaa犯aatccatctgcatcttgtttccccaact848attattaggccataattttattttatttgatactactacaagttgtctttgaagtacaaa908gttgatagcataaccagcagctggtcagaaacatatgcagcaatt犯caataataaacac968gagttttatgtcagcatattatggatactctgattatcttgtatatgtgtgtcatgattt1028ccccccaaaatgtttcttgtgcaggetgtggtcacgatgttcaactatcaaAlaValValThrMetPheAsnTyrGin6570c犯ttcGinPhegca犯gAlaLyscsgggcGinGly卿ga/tLysAsp120caaateGinlie135gacccaAspProgggactGlyThreggArg卿LysAsp105cccProC3CHisgagGlu90tgcCys8caThratelie75gtcValteaSergttValgetAlateaSeraccThrcagGinattlie卿LysgttValasttgcAsnCysaatgetAsnAla155aac肌gAsnLys170tgcCys140getAlaThrgcaAlatggTrpttcPhegatAsp125LyscctProtegSertctSergttValLys110ctgLeugetAlatecSeraagLysgggGly3tgMet95ggtGlycttLeuggaGlytggTrp80gttValggcGlyccgProgttValttcPhettgLeu175C3gGinggaGly3CgThrggcGlyC3gGin160cctPro3t3lie145ateliesagLysctgLeugcaAlacccPro3CCThr130肪tAsn3gtSer33CAsngggGlycagGinC3CHis115ccaPro8C3Thrgt3ValttcPhetggTrp3CCThr100tgcCysac￡iThr85actThrtgcCystacTyrtttPheggtGlyactThr18033CAsnsacAsncttLeu165cttLeutggTrpgagGlu38gLysatgMetC3gGin150getAla1079112711751223127113191367卿Lys1415gccccaggtcctgggtacacgtgcgggcgtgetatgattgtcaggcct1463AlaProGlyProGlyTyrThrCysGlyArgAlaMetlieValArgPro185190195actaagtttttcaceggggatgggcgcagagcaacccaagetetaa1509ThrLysPhePheThrGlyAspGlyArgArgAlaThrGinAlaLeu200205210gtaagtagctcatctgttgttctttaatgtttaataccaattgetttcattctttgagga1569aatgcatttgcagcctaaacaacaattgeatggttgaactaggttaccttatgtgtaggg1629Usgtasgaagatgt犯tctgttg朋ggg3犯g卿ttgttctc犯agtg3gatgagtcc1,aactgtg犯taatagttg3taataggttatattacttggcatgttggcctaatagaatsc1749agctaattcagttaatattattctctagcaaat幼tattcgtca肪tgc3gscstgeste1809a/tagtggctccatatagaagttaaatttgtcaaaatctt3taccat3肪gttcatttttg1869ttttttgtttcttaacaaaaataaaatctgtttgcagtgacatggaatgtgacc1923MetThrTrpAsnValThr215tgcacatacteccaatttcttgetcagaagactccttectgctgtgta1971CysThrTyrSerGinPheLeuAlaGinLysThrProSerCysCysVal220225230235tctetcteateattttataatgacacaattgtgaactgcccaacatgc2019SerLeuSerSerPheTyrAsnAspThrlieValAsnCysProThrCys240245250tcttgtggctgcc犯咖aatgggacasgtcctgga柳tgtgta幼2066SerCysGlyCysGinAsnAsnGlyThrSerProGlySerCysValAsn255260265gtgagttaat幼aacc犯aactcttacttcgcttcttgttgaggcccascttttctgcaa2126犯ttgct幼c卿ttccatgcatttccacagtgag肌tteaccttatttacaa2179GluAsnSerProTyrLeuGin270tctgccattgatggccctggc犯atggaccggtcagcctcttgtccaa2227SerAlalieAspGlyProGlyLysT卬ThrGlyGinProLeuValGin275280285290tgtacttctcacatgtgcccgateagaatecactggcatgtgaaaetc2275CysThrSerHisMetCysProlieArglieHisTrpHisValLysLeu295300305幼ctataaggaatattggagagtgaagateacgattacgaacttcaac2323AsnTyrLysGluTyrTrpArgValLyslieThrlieThrAsnPheAsn310315320taccgcatgaattacacacagtgg犯tttggtcgetcaacatcctaac2371TyrArgMetAsnTyrThrGinTrpAsnUuValAlaGinHisProAsn325330335ttcaataatateacccagctgtttagettcaactacaagccacttact2419PheAsnAsnlieThrGinLeuPheSerPheAsnTyrLysProLeuThr340345350ccatatggaageaagataagtaagtcaatttacaaactgttctccttta2468ProTyrGlySerLyslie355360ttt犯gaaaattggagtgcacttgtaatacgttcctttatctctctctctctctctcttt2528ctctgatgaagtttattccttctattttagatgatactgcgatgUctgggga2581AsnAspThrAlaMetPheTrpGly365gtt卿ttctataacgatttgetcatgcaagetggtccacttggaaat2629ValLysPheTyrAsnAspLeuLeuMetGinAlaGlyProLeuGlyAsn370375380gcacagteagaacttcttctgcgtaaggattecaaggacttcaccttt2677AlaGinSerGluLeuLeuLeuArgLysAspSerLysAspPheThrPhe385390395400gac卿ggatgggccttcccacaccgcgtgtscttc肪tggtgataatAspLysGlyTrpAlaPheProHisArgValTyrPheAsnGlyAspAsn4054104152725tgtCysgtcValatgMetccaPro420cctProccgProgatAspgcaAlat￡ltTyr425ccatggttgcctProTrpLeuPro肪tAsn430gCEl3gtAlaSer2773cctctgacaaaacaaccattgacaetcteggttttggtattttegattProLeuThrLysGinProLeuThrLeuSerValLeuValPheSerlie4354404452821gtgValttgLeu450getAlaactThrttgLeuctggetLeuAla455tatTyrgCElAlatga28512權(quán)利要求1、一種控制水稻纖維素合成的基因BC1L4在水稻遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于，所述的水稻纖維素合成的基因BC1L4是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中所示的DNA序列；或2)編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)水稻纖維素合成基因BC1L4的克隆及應(yīng)用。具體涉及利用水稻T-DNA插入突變體庫(kù)分離克隆水稻纖維素合成基因BC1L4，通過(guò)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和纖維素含量測(cè)定等實(shí)驗(yàn)證明BC1L4基因具有控制水稻纖維素合成和結(jié)實(shí)率的功能。BC1L4基因?qū)儆贑OBRA基因家族，該家族成員在植物纖維素的合成中起重要作用。本發(fā)明克隆的基因具有調(diào)節(jié)水稻秸稈纖維素含量和產(chǎn)量的能力。本發(fā)明在利用基因工程技術(shù)有目的地改善提高水稻的產(chǎn)量、改善植物的材質(zhì)、提高秸稈資源的利用率等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/82GK101544988SQ20091006204公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日發(fā)明者代曉霞,吳昌銀,張啟發(fā),游常軍申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)