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一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法

文檔序號:573063閱讀:564來源:國知局
專利名稱:一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種基因工程重組微生物及其篩選方法。
技術(shù)背景隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展,人民生活水平的不斷提高,高品質(zhì)的生活越來越受到人們的關(guān)注, 這其中最重要的一條就是健康。但是經(jīng)濟的發(fā)展又伴隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,工作、生活 壓力的增大,運動的減少和居住生活環(huán)境的惡化等等對健康不利的因素,各種疾病特別是惡 性疾病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢,其中肝癌是我國常見惡性腫瘤之一,死亡率高,在惡性 腫瘤死亡順位中僅次于胃、食道而居第三位,在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占第二位,僅次于胃癌, 在我國每年死于肝癌約11萬人,占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。為了預(yù)防和治療這些惡性 疾病,全國每年花費大量的人力和物力,但收效甚微。據(jù)統(tǒng)計,全球現(xiàn)在有1500萬-2000萬人酗酒,其中10%-20%的人有不同程度的酒精性 肝病。在我國,也有不少人嗜好飲酒。據(jù)報道,適量飲酒對大多數(shù)人的健康并沒有損害,少 量飲用酒精性飲料,如葡萄酒,對身體還有一定的好處。但是,若長期過量飲酒,特別是飲 用高度酒,會使肝細胞反復(fù)發(fā)生脂肪變性、壞死和再生,最終導(dǎo)致肝硬化、肝癌。另外,根據(jù)報道乙醛脫氫酶的補充可以減少心肌缺血/再灌注損傷,減少心肌細胞由于缺 氧而引起的凋亡等。許多文獻已經(jīng)表明乙醛脫氫酶的存在對心肌細胞都有良好的保護作用?;谝陨显?,社會迫切的需要一種行之有效的解酒、保肝的保健品出現(xiàn)。今年來出現(xiàn) 一些含乙醛脫氫酶的解酒藥的報道,但是乙醛脫氫酶至今獲得途徑的狹窄,成為該類保健品 的瓶頸。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法。本發(fā)明所提供的一株重組畢赤酵母菌株,為一株巴斯德畢赤酵母(i^W";;"對on、) GS115-07ALDH2菌株,已于2009年1月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC), 保藏號CCTCC N0:M208266。本發(fā)明所采用的巴斯德畢赤酵母(巧c;n力pasto ^ ) GS115為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技 術(shù)學(xué)院贈送。一株重組畢赤酵母菌株的篩選方法,其特征在于 一).質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證 1).目的序列設(shè)計與合成由Genebank上人ALDH2 DNA (gene ID217)序列,刪除UTR和信號肽并加上內(nèi)切酶 五②RI和內(nèi)切酶AWI酶切位點,再根據(jù)畢赤酵母密碼子用法修改了 28個堿基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60 TCTGCAACCAGATTTTCATAMCAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC 120 CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG 180 ATGTGGACAAGGCAGTGMGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300 ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360 ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420 AGTACCACGGGMAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480 CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540 AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600 CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660 TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720 TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780 GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA 840 TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900 AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960 TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA 1020 AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA 1080 ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140 GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG 1200 AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260 GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA 1320 AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380 TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440 GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500 AGAACTCAGCGGCCGA 1516按上述目的序列ALDH2,用現(xiàn)有的重疊延伸法合成產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2), 用現(xiàn)有的常規(guī)方法將產(chǎn)人乙醛脫氫酶2連接在質(zhì)粒pUC57上,得到質(zhì)粒pUC57-ALDH2;使 用上海生工的高效制備感受態(tài)細胞試劑盒制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞;將10nL質(zhì)粒 pUC57-ALDH2與50^L大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min,然后在42'C熱擊 l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500pL的LB培養(yǎng)基,37'C振蕩培養(yǎng)lh;取100pL 培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37'C培養(yǎng)過夜,得到的含有質(zhì)粒 pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子,保存?zhèn)溆茫?).質(zhì)粒構(gòu)建a.酶切用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質(zhì)粒pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒 pUC57-ALDH2;準備質(zhì)粒pPIC9K,并用內(nèi)切酶£coR I和內(nèi)切酶iVw I雙酶切;①按下述原料配比質(zhì)粒pUC57-ALDH2lO[iL,緩沖液Wash Solution3joL,內(nèi)切酶五coRl (20U/nL)lpL,內(nèi)切酶A^1 (5U/pL)3|iL,小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸餾水10pL,6選取質(zhì)粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內(nèi)切酶五coRl、內(nèi)切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37。C酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列;②按下述原料配比質(zhì)粒pPIC9K lOpL,緩沖液Wash Solution 3pL,內(nèi)切酶£coR I (20U/pL) 1 nL,內(nèi)切酶iVWl (5U4iL) 3nL,小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL,蒸餾水 10nL,選取質(zhì)粒pPIC9K、緩沖液Wash Solution、內(nèi)切酶五coRl、內(nèi)切酶AWI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37'C酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切后的質(zhì)粒 pPIC9K;b.連接按產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列和酶切后的質(zhì)粒pPIC9K的摩爾比2:1混合,得到混合DNA, 用T4連接酶連接;按下述原料配比 T4連接酶 lpL, T4連接酶緩沖液 2nL, 混合DNA 7pL,選取T4連接酶、T4連接酶緩沖液和混合DNA, 在4'C連接過夜,得到連接產(chǎn)物 (pPIC9K-ALDH2);連接產(chǎn)物(pPIC9K-ALDH2 )轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a:將10pL上述連接產(chǎn)物 (pPIC9K-ALDH2)與50pL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min,然后在42 T熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500pL的LB培養(yǎng)基,37'C振蕩培養(yǎng)lh; 取10(HiL培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37。C培養(yǎng)過夜,得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2);二)、菌株的構(gòu)建和篩選1).質(zhì)粒的線性化與電轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2;釆 用內(nèi)切酶SacI(2U4iL)5nL、小牛血清白蛋白(lmg/mL) 3pL、緩沖液10XBufferG 3pL、超 純水9pL和質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2 10pL,在37'C孵育過夜;再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1,抽提線性化產(chǎn)物,然后用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物,最后用10-20nLTE緩沖液溶解,得到線 性化質(zhì)粒溶液;巴斯德畢赤酵母(尸/c/ z'" pfl對or^ ) GS115的電轉(zhuǎn)導(dǎo)首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (尸/c/n'a/ "加^ ) GS115的一級種子液,接種到含50ml YPD培養(yǎng)基的300mL搖瓶中,使 巴斯德畢赤酵母(P/cW" p^tor" ) GS115菌體濃度生長至00600= 1.3-1.5,后收集菌體, 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次,最后用O.lmL、 4°〇的1M山梨醇來懸浮細胞;然后取 90pL山梨醇懸浮細胞與10pL線性化質(zhì)粒溶液混合,轉(zhuǎn)入4"C的ltrnn電轉(zhuǎn)杯中,在電轉(zhuǎn)儀 1200V、 5ms的條件進行電轉(zhuǎn),電轉(zhuǎn)導(dǎo)樣品涂布到MD培養(yǎng)基上,3(TC培養(yǎng)2-3d,得到巴斯德畢赤酵母(尸/cWai7flWw^ ) GS115-07ALDH2菌株; 2).菌株的篩選從巴斯德畢赤酵母(尸&/ '";^^0& ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落,進行誘導(dǎo)表 達,首先采用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株;然后,再對陽性菌株進行再一次的誘導(dǎo)表 達,檢測方法改變?yōu)闄z測其上清液中的酶活,選取酶活最高的菌株的最佳菌株,即得到一株 巴斯德畢赤酵母(乃'c/z/a/^Ww7';y ) GS115-07ALDH2菌株。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所得到的一株巴斯德畢赤酵母(P/cW" pa^on^ ) GS115-07ALDH2菌株可應(yīng)用于解酒、保肝;具有解酒、保肝的效果。


圖1是質(zhì)粒pUC57-ALDH2和質(zhì)粒pPIC9K酶切回收片段圖。泳道1、泳道2是質(zhì)粒 pUC57-ALDH2酶切回收圖,泳道3是質(zhì)粒pPIC9K酶切回收圖。圖2是大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2菌液PCR圖。
具體實施方式
一、質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證1.目的序列設(shè)計與合成由Genebank上人DNA (gene ID217)序列,刪除UTR和信號肽并加上內(nèi)切酶 £C0R I和內(nèi)切酶iVof I酶切位點,再根據(jù)畢赤酵母密碼子用法修改了 28個堿基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60 TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAMCATTCC 120 CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGMGGGGACAAGGMG180 ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240 GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300 ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360 ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420 AGTACCACGGGAMACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480 CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540 AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600 CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660 TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720 TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780 GGAGCAGCAACCTCMGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCMCATCATCA 840 TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900 AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960 TTGTGGAGCGMGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGMCCCCTTTGATAGCA 1020 AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA 1080 ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140 GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG 1200 AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260 GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACMAGGATTTGGACA 1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380 TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440 GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500 AGAACTCAGCGGCCGA 1516
按上述目的序列ALDH2,用現(xiàn)有的重疊延伸法合成產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2), 用現(xiàn)有的常規(guī)方法將產(chǎn)人乙醛脫氫酶2 (ALDH2)連接在質(zhì)粒pUC57上,得到質(zhì)粒 pUC57-ALDH2;使用上海生工的高效制備感受態(tài)細胞試劑盒制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細 胞;將10nL質(zhì)粒pUC57-ALDH2與50pL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min, 然后在42。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500pL的LB培養(yǎng)基,37。C振蕩 培養(yǎng)lh;取100)aL培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37。C培養(yǎng)過夜, 得到的含有質(zhì)粒pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子,保存?zhèn)溆茫?br> 2.質(zhì)粒構(gòu)建
a.酶切
用酚氯仿或DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司Hl-l-3)從含有質(zhì) 粒pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒pUC57-ALDH2;準備質(zhì)粒pPIC9K,并用內(nèi)切酶 五coR I和內(nèi)切酶I雙酶切; ①按下述原料配比
質(zhì)粒pUC57-ALDH210pL,
緩沖液Wash Solution3pL,
內(nèi)切酶五coRl (20U/pL)l|_iL,
內(nèi)切酶iVwI (5U4iL)3pL,
小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)3pL,
蒸餾水,L,
選取質(zhì)粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內(nèi)切酶五coRl、內(nèi)切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37'C酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產(chǎn)人乙醛脫氫 酶2序列(如圖l,酶切驗證回收的產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列為目的序列ALDH2);
②按下述原料配比
質(zhì)粒pPIC9K 10pL,
緩沖液Wash Solution 3pL,
內(nèi)切酶£coR I (20U4iL) 1 pL,
內(nèi)切酶Wofl (5U/pL) 3pL,
小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL,
蒸餾水 lOpL,
選取質(zhì)粒pPIC9K、緩沖液Wash Solution、內(nèi)切酶五coRI、內(nèi)切酶iVofl、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37'C酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切后的質(zhì)粒 pPIC9K (如圖1);
b.連接
按產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列和酶切后的質(zhì)粒pPIC9K的摩爾比2:l混合,得到混合DNA, 用T4連接酶連接; 按下述原料配比T4連接酶 lpL, T4連接酶緩沖液 2pL, 混合DNA 7pL,
選取T4連接酶、T4連接酶緩沖液和混合DNA, 在4'C連接過夜,得到連接產(chǎn)物 (pPIC9K-ALDH2);
連接產(chǎn)物(pPIC9K-ALDH2 )轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a:將lO^iL上述連接產(chǎn)物 (pPIC9K-ALDH2)與50|xL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min,然后在42 。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500nL的LB培養(yǎng)基,37。C振蕩培養(yǎng)lh; 取100pL培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37。C培養(yǎng)過夜,得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)。 3.驗證
挑取大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2),接種到lmL含100mg/L氨芐青霉素的LB培 養(yǎng)基中,37°C 150r/min振蕩培養(yǎng)過夜,離心,離心條件10000g離心lmin,棄上清,挑取 少量菌體懸浮于20nL蒸餾水中,沸煮10min,離心,離心條件10000g離心lmin,取4pL 上清作模板,進行菌液PCR ; PCR引物為5'AOX1(5,—gactggttccaattgacaagc-3,)和 3 'AOX 1 (5 ,隱gcaaatggcattctgacatcctct畫3 ,);
PCR體系(20pL): 模板 L, 上游引物(2mmol/L) 2pL, 下游引物(2mmol/L) 2pL, 10 X buffer 2jxL, MgCl2 (25腿ol/L) 1.5|xL, dNTPs (2mmol/L) 2pL, Taq酶(5U/nL) 0.5pL, 蒸餾水 6pL;
混合后在PCR條件反應(yīng) 95 。C 3min, 94 。C lmin —「 55 。C 1.5min| 25次 72°C lmin ~1 72 °C 8min,
PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(錯誤!未找到引用源。);菌液PCR陽性的進一步測序驗證, 大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中ALDH2序列為前述的目的序列ALDH2。
按畢赤酵母偏好性設(shè)計人ALDH2的核酸序列與人ALDH2 cDNA序列(NM—000690)比較 Identity=98. 13%(1472/1500) Gap=l. 06%(16/1516)
二、菌株的構(gòu)建和篩選
1.質(zhì)粒的線性化與電轉(zhuǎn)導(dǎo)
質(zhì)粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2;采 用內(nèi)切酶&cI(2U4iL) 5pL、小牛血清白蛋白(lmg/ml)3pL、緩沖液10XBufferG 3pL、超純水9nL和質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2 1(HiL,在37。C孵育過夜;再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1, 抽提線性化產(chǎn)物,然后用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物,最后用10 20)aLTE緩沖液溶解,得到線性 化質(zhì)粒溶液;
巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'a j^wtor/s ) GS115的電轉(zhuǎn)導(dǎo)首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (尸/c/^戸Ww^ ) GS115的一級種子液,接種到含50ml YPD培養(yǎng)基的300mL搖瓶中,使 巴斯德畢赤酵母(尸z'c/ /a pawonj ) GS115菌體濃度生長至OD600= 1.3-1.5,后收集菌體, 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次,最后用O.lmL、 4'C的1M山梨醇來懸浮細胞;然后取 90)iL山梨醇懸浮細胞與lOpL線性化質(zhì)粒溶液混合,轉(zhuǎn)入fC的lmm電轉(zhuǎn)杯中,在電轉(zhuǎn)儀 1200V、 5ms的條件進行電轉(zhuǎn),電轉(zhuǎn)導(dǎo)樣品涂布到MD培養(yǎng)基上,3(TC培養(yǎng)2-3d,得到巴斯 德畢赤酵母(乃'cWapa^on、. ) GS115-07ALDH2菌株; 2.菌株的篩選
從巴斯德畢赤酵母(尸/c/^/ aston's ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落,進行誘導(dǎo)表 達,首先采用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株;然后,再對陽性菌株進行再一次的誘導(dǎo)表 達,檢測方法改變?yōu)闄z測其上清液中的酶活,選取酶活最高的菌株的最佳菌株,即得到一株 巴斯德畢赤酵母(Wc/H'a; aWo^ ) GS115-07ALDH2菌株(即一株重組畢赤酵母菌株)。 三、 一株巴斯德畢赤酵母(尸/cWfl/ flWw^ ) GS115-07ALDH2菌株的鑒定 1、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(i^/n'apaWw^ ) GS115-07ALDH2菌株(即 一株重組畢赤酵母菌株)的形態(tài)特征與生理生化特性見表l。
表1檢測結(jié)果:
檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果
細胞形狀球形-卵海藻糖+
圓形纖維二糖-
分裂方式芽殖淀粉-
利用糖發(fā)酵D-木糖+
葡萄糖+L-阿拉伯糖-
蔗糖-D-核糖-
半乳糖-鼠李糖+
麥芽糖-檸檬酸+
乳糖-2-酮葡萄糖+
海藻糖+糊精+/-
棉子糖-e-甲基-D-葡糖苷+
利用碳水化合物杏甘+
半乳糖-熊果甘+
葡萄糖+D-樹膠醛糖+
蔗糖-L-樹膠醛糖+
半乳糖-吐溫80+
麥芽糖-
乳糖-
表l中符號說明"+ " : 90%以上的菌株為陽性,"-"90%以上的菌株為陰性 表1說明該菌株的形態(tài)特征與生理生化特性與巴斯德畢赤酵母(P/cW"p"Wo/^ ) GS115
11(為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院贈送) 一致。
2、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a ; aWw^ ) GS115-07ALDH2菌株的 全細胞脂肪酸組份的鑒定,見表2。 檢測結(jié)果
Volume: DATA File: E091124.00A Samp Ctr: 3 Idnumber: 1932
Type: Samp Bottle: 2 Method: YEAST6
Created: 1/12/2009 10:24:34AM Sample ID: GS115
表2 —株巴斯德畢赤酵母(尸z'cWfl ;^Won^ ) GS115-07ALDH2菌株的全細胞脂肪酸組 份及其含量
RTRespo nAr/ HRFa cECLPeak NamePercen tComment 1Comment 2
1.81941E+80.03—6.994SOLVENT PEAK—_<min rt
2.11128800.03—7.519—-<minrt
10.92 4124010.040.9015.82 016:lCis9 (w7)9.75ECX deviates 0.003
11.23 1130540.040.8915.99 916: 010.22ECL deviates -0.001Reference -002
12.63 741470.040.8816.79 417:lCis9 (w8)3.20E(X deviates 0.002
14.30 0385990.040.8717.7218:2CIS9,12/18:0 a29.49ECL deviates 0.005
14.38619810.050.8717.77 3Sum In Feature 847.34ECL deviates O細18:1CIS9( w9)
—61981———Summed Feature 847.3418 : 1CIS9 Cw9)18:l(w8)
ECL Deviation:0.003 eference ECL Shift:0.002 Number Reference Peaks: 1
Total Response: 130182 Total Named:130182 Percent Named: 100.00% Total amount: 114616
表2說明該菌株的全細胞脂肪酸組份與巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/";^wto^y ) GS115 (為華 中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院贈送)相似。
3、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(尸/cWa) GS115-07ALDH2菌株的 18SRrna基因序列如下
12TGAGCCATTCGCAGTTTCACCGTATAATGCTA
該菌株的18SrRNA基因序列與巴斯德畢赤酵母(/^Wn'"戶Wo^ ) GS115的18S rRNA
基因序列完全相同。
以上三方面檢測結(jié)果說明,檢測菌株為巴斯德畢赤酵母(戶/cWfl; aWw^ ) GS115。命名 為一株巴斯德畢赤酵母(AcWa; flWw7;y ) GS115-07ALDH2菌株(即為一株重組畢赤酵母菌 株),已于2009年1月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC),保藏號CCTCC N0:M208266。
四、 一株巴斯德畢赤酵母(尸Zc/z/apaWw^ ) GS115-07ALDH2菌株應(yīng)用 將一株巴斯德畢赤酵母(P/cWa) GS115-07ALDH2菌株在BMGY培養(yǎng)基中培 養(yǎng)24h,再收集菌體轉(zhuǎn)入到BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達60h,離心(6000轉(zhuǎn)/分)5分鐘,取 上清液加入質(zhì)量濃度為250g/L的聚乙二醇PEG8000沉淀上清液中的人乙醛脫氫酶2,然后 加入和上清液等體積的蒸餾水,溶解人乙醛脫氫酶2,得到含人乙醛脫氫酶2的酶液,最后 采用殼聚糖來進行固定, 固定具體過程如下
① 取3.00g殼聚糖(脫乙酰度>90%),加入蒸熘水100mL,磁力攪拌10min,充分混勻; 再加入lmL冰醋酸,磁力攪拌2h,得到殼聚糖膠液;
② 在磁力攪拌的情況下,向上述50mL殼聚糖膠液中,加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶 液(濃度為100mg/mL),攪拌均勻后,再加入質(zhì)量濃度為20mg/mL的焦磷酸鈉溶液50mL, 攪拌10min,靜置固定化3h;得到初始固定化酶,用蒸餾水將多余的焦磷酸鈉洗掉,得到固 定化酶樣品;
③ 將上述固定化酶樣品用冷凍干燥機干燥,在-50。C下干燥48h至干燥完全,得到固定化酶(產(chǎn)品)。
所述的BMGY培養(yǎng)基1% (質(zhì)量含量)酵母膏,2%蛋白胨,1.34%酵母氮源堿 YNB (含硫酸銨,不含氨基酸),4X10—5%生物素,1%甘油,100mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH為6.0);余量為蒸餾水。
所述的BMMY培養(yǎng)基1%酵母膏,2%蛋白胨,1.34%酵母氮源堿YNB (含硫酸銨, 不含氨基酸),4X10—5%生物素,0.5%甲醇,10Ommol/L磷酸鉀緩沖液(pH為6.0),余量 為蒸餾水。
五、畢赤酵母基因表達產(chǎn)物乙醛脫氫酶的動物學(xué)檢驗
將人乙醛脫氫酶2進行固定化處理,得到的樣品來檢驗解救小鼠急性酒精中毒的能力。 1、人乙醛脫氫酶2固定化處理
動物的胃液pH值很低,而ALDH2極易分解,故用殼聚糖進行固定化處理后再進行小鼠 灌胃實驗。具體過程如下
① 取3.00g殼聚糖(脫乙酰度>90%),加入蒸餾水100mL,磁力攪拌10min,充分混勻; 再加入lmL冰醋酸,磁力攪拌2h,得到殼聚糖膠液;
② 在磁力攪拌的情況下,向上述50mL殼聚糖膠液中,加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶 液(100mg/ mL),攪拌均勻后,再加入質(zhì)量濃度為20mg/ mL的焦磷酸鈉溶液50 mL,攪拌 10min,靜置固定化3h;之后得到初始固定化酶,用蒸餾水將多余的焦磷酸鈉洗掉,得到固 定化酶樣品;
③ 將上述固定化酶樣品用冷凍干燥機干燥,在-50。C下干燥48h至干燥完全,固定化所 得酶制劑置4°C保存。小數(shù)灌胃前取4g酶制劑加入到10mL 1% CMC中制成懸濁液備用[因 為固定化酶(產(chǎn)品)是固態(tài),不方便喂養(yǎng)小鼠,所以將固定化酶(產(chǎn)品)做成懸濁液為方便 喂養(yǎng),所以后面所涉及到喂食的固定化酶(產(chǎn)品)都為這種懸濁液,取名為"固定化酶懸濁 液"]。
2、醉酒劑量實驗
30只小鼠隨機分為3組,每組10只。實驗前禁食12h,不禁水。實驗時各組小鼠分別 按14mL/kg、 16mL/kg、 18mL/kg的劑量灌胃56。二鍋頭,觀察12h。記錄小鼠醉酒時間與醒 酒時間以及醉酒率和死亡率。小鼠醉酒的判斷標準是小鼠取背向位放入盒子中。若小鼠背 向下的姿勢可保持30s以上,則認為翻正反射消失,即為醉酒。劑量實驗結(jié)果如表3;
表3不同給酒劑量小鼠急性酒精中毒實驗結(jié)果
灌酒劑量(mL/kg)醉酒率醉酒時間(min)死亡率
1420%30.5±8.30
1680%23±9.210%
18100%15.3±8.860%
3、醉酒預(yù)防實驗
將40只小鼠(雌雄各半)預(yù)養(yǎng)3d,分成模型組、服用固定化酶懸濁液組。每組10只,各 組小鼠實驗前禁食12h,不禁水。模型組每只按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為P/。的CMC,其 余三組每組每只按20mL/kg的灌胃量灌注相應(yīng)的固定化酶懸濁液。30min后各組小鼠均按 16mL/kg灌胃56。二鍋頭,記錄給白酒時刻、各組醉酒動物翻正反射消失時刻、翻正反射恢復(fù)
14時刻,進一步計算睡眠時間(小鼠翻正反射消失至翻正反射恢復(fù)的時間),醉酒時間=翻 正反射消失時刻一給酒時刻,醒酒時間亦即睡眠時間。 4、醉酒治療實驗
小鼠數(shù)目,分組及實驗方法同前面醉酒預(yù)防實驗,將灌酒和灌酶液的先后次序?qū)φ{(diào),改 為灌酒30min后再喂固定化酶懸濁液。記錄給酒后,小鼠的醉酒時間和醒酒時間。結(jié)果如表; 表4小鼠的醉酒時間和醒酒時間
實驗組別預(yù)防實驗治療實驗
醉酒時間 (min)p醒酒時間 p (min)醒酒時間(min) P
模型組34.3±3.29253.20±52.38241.0±42.46
固定化酶 懸濁液組46.U3.98<0.05190.30±15.42 <0.05187.卯±17.99 <0.05
由結(jié)果由表4可知,治療實驗和預(yù)防實驗結(jié)果基本是一致的。喂了固定化酶懸濁液[即固 定化酶(產(chǎn)品)]的小鼠的醒酒時間,與對照組相比,均有不同程度的縮短。此外,在灌酒之 前用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產(chǎn)品)]灌胃可以延緩小鼠的醉酒。說明固定化酶懸濁液[即 固定化酶(產(chǎn)品)]有顯著的解酒效果。
所選用醉酒時間是表示小鼠從喝酒到己經(jīng)醉酒的時間,如果這個時間段越長,說明吃 了本發(fā)明的固定化酶懸濁液后,小鼠可以有效的延長他們的醉倒。
5、小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的檢測-
小鼠30只,隨機分為空白組、模型組、服用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產(chǎn)品)]
組共3組。每組10只,各組小鼠先禁食12h,不禁水。空白組不喂任何物質(zhì),模型組每只按 20ml/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC,其余三個實驗組每組每只按20mL/kg的灌胃量灌 注相應(yīng)的酶液。30min后除空白組外其余各組小鼠均按16mL/kg灌胃56。二鍋頭。300min后 所有組的小鼠均斷頭取血,并解剖取小鼠肝臟。用千分之一天平準確稱取小鼠肝臟,按重量 體積比加99倍生理鹽水制成1%勻漿,3500r/min離心10分鐘,取上清待測。按照試劑盒說 明書測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶。自斷頭取血后獲得的血液樣品制備血清,按照試劑盒說 明書進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定。結(jié)果如表5。 表5血液和肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活力測定結(jié)果
實驗組別
ALT/GPT (U/mg蛋白)
AST/GOT (U/mg蛋白)
血液
P
肝臟
P
血液
P
肝臟
P
空白組950±68470±78830±98364±28
模型組2206±1 35<0.051200±156<0.051923±165<0.05988±170<0.05
固定化酶1203±8
<0.05606±78<0.05932±70<0.05420±72<0.05
懸濁液組9
轉(zhuǎn)氨酶檢測結(jié)果可以看出固定化酶懸濁液[即固定化酶(產(chǎn)品)]組顯著低于模型組(模
15型組是每只按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC,因為本發(fā)明的酶是懸濁在1%的 CMC里,需要檢測防醉酒到底是in/。的CMC在起作用,還是本發(fā)明的酶在起作用,所以設(shè) 這一個模型組來證明不是P/。的CMC在起作用),且不同程度地高于空白組。三個實驗組之 間有明顯差別,結(jié)果表明固定化酶懸濁液[即固定化酶(產(chǎn)品)]對小鼠的肝臟起到了明顯的 保護作用。
權(quán)利要求
1.一株重組畢赤酵母菌株,其特征在于為一株巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS 115-07ALDH2 CCTCC NOM208266。
2.如權(quán)利要求1所述的一株重組畢赤酵母菌株的篩選方法,其特征在于 一).質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證 1).目的序列設(shè)計與合成由Genebank上人JZD/K DNA (gene ID217)序列,刪除UTR和信號肽并加上內(nèi)切酶 五coRl和內(nèi)切酶A^1酶切位點,再根據(jù)畢赤酵母密碼子用法修改了 28個堿基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC 120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG 180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAMTGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720TGGACAMGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780GGAGCAGCAACCTCMGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA 840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGMCCCCTTTGATAGCA 1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA 1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCMGG 1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGMGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA 1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500AGAACTCAGCGGCCGA 1516按上述目的序列ALDH2,用現(xiàn)有的重疊延伸法合成產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2), 用現(xiàn)有的常規(guī)方法將產(chǎn)人乙醛脫氫酶2連接在質(zhì)粒pUC57上,得到質(zhì)粒pUC57-ALDH2;使 用上海生工的高效制備感受態(tài)細胞試劑盒制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞;將10pL質(zhì)粒 pUC57-ALDH2與50pL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min,然后在42。C熱擊 l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500pL的LB培養(yǎng)基,37'C振蕩培養(yǎng)lh;取100pL 培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37'C培養(yǎng)過夜,得到的含有質(zhì)粒 pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子,保存?zhèn)溆茫?).質(zhì)粒構(gòu)建a.酶切用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質(zhì)粒pUC57-ALDH2的陽性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒 pUC57-ALDH2;準備質(zhì)粒pPIC9K,并用內(nèi)切酶£coR I和內(nèi)切酶M)Z I雙酶切;①按下述原料配比質(zhì)粒pUC57-ALDH210pL,緩沖液Wash Solution3|iL,內(nèi)切酶&oRl(20U4iL)lpL,內(nèi)切酶A^1 (5U/jiL)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)3|jL,蒸餾水10nL,選取質(zhì)粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內(nèi)切酶五coRl、內(nèi)切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37X:酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列;②按下述原料配比質(zhì)粒pPIC9K 10pL,緩沖液Wash Solution 3fiL,內(nèi)切酶£coR I (20U/(xL) lnL,內(nèi)切酶M H (5U/pL) 3pL,小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL,蒸餾水 lOpL,選取質(zhì)粒pPIC9K、緩沖液Wash Solution、內(nèi)切酶五coRl、內(nèi)切酶7VwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水,在37'C酶切12h;電泳并用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切后的質(zhì)粒 pPIC9K;b.連接按產(chǎn)人乙醛脫氫酶2序列和酶切后的質(zhì)粒pPIC9K的摩爾比2:1混合,得到混合DNA, 用T4連接酶連接;按下述原料配比 T4連接酶 lpL,T4連接酶緩沖液 2pL, 混合DNA 7pL,選取T4連接酶、T4連接酶緩沖液和混合DNA,在4'C連接過夜,得到連接產(chǎn)物 (pPIC9K扁ALDH2);連接產(chǎn)物(pPIC9K-ALDH2 )轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a:將10pL上述連接產(chǎn)物 (pPIC9K-ALDH2)與50pL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合,冰上放置30min,然后在42 。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min后加入500pL的LB培養(yǎng)基,37。C振蕩培養(yǎng)lh; 取10(HiL培養(yǎng)物涂布到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上,37'C培養(yǎng)過夜,得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2);二)、菌株的構(gòu)建和篩選1) .質(zhì)粒的線性化與電轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2;采 用內(nèi)切酶Sac I (2U/jiL) 5pL、小牛血清白蛋白(lmg/mL)3pL、緩沖液10XBufferG 3pL、超 純水9pL和10nL質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2,在37'C孵育過夜;再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1,抽提線性化產(chǎn)物,然后用乙醇沉淀線性化產(chǎn)物,最后用10-20^iLTE緩沖液溶解,得到線 性化質(zhì)粒溶液;巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a ; awwly ) GS115的電轉(zhuǎn)導(dǎo)首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (戶/c/^ paww7i ) GS115的一級種子液,接種到含50ml YPD培養(yǎng)基的300mL搖瓶中,使 巴斯德畢赤酵母(i>/c/^ ; imw^ ) GS115菌體濃度生長至OD600=1.3-1.5,后收集菌體, 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次,最后用O.lmL、 4'C的1M山梨醇來懸浮細胞;然后取 卯^L山梨醇懸浮細胞與lOpL線性化質(zhì)粒溶液混合,轉(zhuǎn)入4。C的lmm電轉(zhuǎn)杯中,在電轉(zhuǎn)儀 1200V、 5ms的條件進行電轉(zhuǎn),電轉(zhuǎn)導(dǎo)樣品涂布到MD培養(yǎng)基上,3(TC培養(yǎng)2-3d,得到巴斯 德畢赤酵母(尸Zc/^戶asto^ ) GS115-07ALDH2菌株;2) .菌株的篩選從巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'a戸加^ ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落,進行誘導(dǎo)表 達,首先采用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株;然后,再對陽性菌株進行再一次的誘導(dǎo)表 達,檢測方法改變?yōu)闄z測其上清液中的酶活,選取酶活最高的菌株的最佳菌株,即得到一株 巴斯德畢赤酵母(戶!'c/n'apc^on's ) GS115-07ALDH2菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程重組微生物及其篩選方法。一株重組畢赤酵母菌株,其特征在于為一株巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2CCTCC NoM208266。本發(fā)明具有解酒、保肝效果好的特點。
文檔編號C12N1/19GK101649297SQ200910062718
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者吳元欣, 王存文, 錦 趙, 趙玉鳳, 凡 鄧, 雷明科, 錕 黃 申請人:武漢工程大學(xué)
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