專利名稱：草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及病毒學領域，特別是一種草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus ，縮寫GCRV, 又稱草魚出血病病毒Grass carp hemorrhagic virus,縮寫GCHV)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(簡 稱RT-PCR)的核酸檢測方法。本發(fā)明是基于草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株GCRV873 (又稱草 魚出血病病毒湖南邵陽株GCHV873)的研究成果，該毒株已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 保藏閂期是2004年7月23日，保藏編號是CCTCC NO: V200414 。
背景技術(shù)：
水生動物病毒病是嚴重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖及疾病傳播的主要病原。隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖業(yè)的 迅速發(fā)展，病毒性流行病頻頻發(fā)生，這些疾病在世界范圍內(nèi)對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了極大的危害。 GCRV隸屬于呼腸孤病毒科水生動物呼腸孤病毒屬，該病原曾一度引起我國長江中下游地區(qū) 淡水養(yǎng)殖區(qū)大規(guī)模暴發(fā)草魚流行性出血病，造成嚴重的經(jīng)濟損失。GCRV形態(tài)結(jié)構(gòu)為二十面 體對稱的無包膜球形顆粒，基因組由ll條(Sl-Sll)分段的雙鏈RNA組成。
研究病原及其診斷手段，是預防病毒病發(fā)生與蔓延的重要環(huán)節(jié)。此外，隨著國際間魚苗、 魚卵以及魚制品進出口的日益增多，由于檢疫制度的不完善，水生動物呼腸孤病毒病也隨之 在世界各地傳播開來。為規(guī)范與杜絕外來帶毒水生生物苗種進入我國及我國帶毒苗種的出境， 制定有效的診斷與預防措施十分必要。
目前在GCRV病原檢測方面雖有ELISA等血清學檢測方法，也有RT-PCR相關(guān)檢測方法 的報道，但是現(xiàn)有的檢測手段都存在耗時較長(通常需要12小時以上)，且靈敏度與特異性欠 佳等弊端，適應不了臨床檢測準確、快速、靈敏的要求?；贕CRVslO基因片段編碼病毒 外衣殼蛋白及宿主特異性強等特性，為此，我們建立了快速檢測GCRV感染細胞或患病草魚 組織的RT-PCR核酸檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于快速靈敏檢測編碼GCRV外衣殼蛋白VP7 的slO基因的RT-PCR核酸檢測方法。GCRV VP7蛋白為組成病毒的外衣殼組分，在病毒進 入細胞過程中具有十分重要的作用，其編碼基因slO是病毒基因組核酸的重要組成部分。在 草魚育種期、魚苗的出入境檢疫及草魚出血病流行期間對slO基因進行快速檢測，將為防治 出血病的發(fā)生與蔓延、杜絕外來病毒的侵害以及防止帶毒魚苗的傳播提供標準的檢測方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供的草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是采用
RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測 編碼GCRV外衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP7的slO基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的 細胞，及正常魚組織和病魚組織。上述的檢測方法包括以下步驟
(1) 取少許細胞或魚體組織作為待測樣品，將所述待測樣品研磨凍融后進行離心沉淀， 采用蛋白酶K和SDS對待測樣品進行處理，然后用RNA吸附離心柱對蛋白酶K和SDS處 理的待測樣品RNA進行抽提。由此獲得待測的RNA樣品。
(2) 根據(jù)GCRVslO基因片段序列，分別設計用于RT-PCR擴增的特異性正反向引物， 采用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)與高保真T叫酶，及slO基因片段特異引物序列進行slO基因 片段的RT-PCR核酸擴增。
(3) 采用所建立的RT-PCR方法，進行擴增產(chǎn)物的靈敏度測定與特異性分析。 本發(fā)明可以由以下方法得到上述的待測樣品
(1) 取0.5 lml GCRV待測樣品進行研磨，制成待測勻漿液；
(2) 對于待測魚體組織樣品，按l:3重量體積比加入lxPBS，進行待測樣品研磨，研磨 的待測樣品重復凍融3次，即在-2(TC低溫冰箱中快速結(jié)凍，然后取出于37'C快速解凍，得到 待測勻漿液；
(3) 將上述待測勻漿液通過離心得到沉淀物，該沉淀物為所述待測材料。 所述待測勻漿液可由離心機以12500 g離心5分鐘得到沉淀物，在該沉淀物中加入150
200 )il的pH值為8.0的TE, TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然后依次加入 蛋白酶K和SDS，使其終濃度分別為lOOpg/ml和0.5%;經(jīng)充分混勻后，于60 68。C水浴孵 育lh，以進行細胞裂解；再用RNA吸附柱離心法獲得RNA提取物，用于后續(xù)RT-PCR擴增。 本發(fā)明可以釆用以下方法進行后續(xù)RT-PCR擴增，其步驟包括
(1) 根據(jù)GCRVslO基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396;
(2) RT反應或cDNA合成采用slO基因反向特異引物與待測RNA樣品混合，65'C反 應5分鐘后立即放置冰上，然后在20pl反應體積依次加入變性的RNA模板引物混合物，5 XRTBuffer， 10mMdNTP混合物，10U/yl的RNase Inhibitor, 20011/^1的逆轉(zhuǎn)錄酶lpl;于 42'C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，cDNA產(chǎn)物置-2(TC保存?zhèn)溆?；?^1 cDNA 產(chǎn)物為模板，用GCRVslO基因序列正反向特異引物進行PCR擴增。
所述GC RV s 10基因序列的正反向特異引物的序列如下 正向引物的序列5， -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3， 反向引物的序列5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
所述GCRV s10基因序列的正反向特異引物擴增RT-PCR的產(chǎn)物大小為515bp，該產(chǎn)物通 過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。RT-PCR擴增產(chǎn)物的陽性對照物為GCRV873， GCRV873是
草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株。
本發(fā)明提供的草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，其用于草魚出血病 的早期診斷或出入境水產(chǎn)品疫情的檢測。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要有以下優(yōu)點
其一.采用RNA吸附柱離心法，可從微量待檢測魚體組織或病毒感染的細胞培養(yǎng)液直接
5提取RNA，進行后續(xù)s10基因片段的RT-PCR擴增。
其二.快速，簡便，從樣品處理到結(jié)果讀取只需要4-5h。
其三.以編碼GCRV外衣殼蛋白的slO基因為靶序列，設計特異性引物，進行sl0基因
片段檢測，可提高檢測的靈敏度，其檢測靈敏度可達到10—6ng。
其四.與ELISA方法相比，檢測的是病毒基因組特異的核酸片段，具有較高的特異性。
其五.實用性強可用于草魚出血病的早期診斷及出入境水產(chǎn)品疫情檢測。
總之，本發(fā)明不僅提供了一種草魚出血病的快速靈敏檢測手段，而且為我國進出口水生
動物檢疫試劑的標準化及商品化應用奠定基礎。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
一. 待測樣品制備與病毒細胞總RNA的抽提
1. 待測樣品的制備
取0.5 lml正常細胞、病毒感染的細胞、正常魚體組織或一定量的病魚體組織 (100-150mg)為待測樣品RNA提取材料。其中，患病或正常魚體組織按重量體積比，在魚 體組織樣品中加入3倍體積1XPBS (pho'sphate-buffered saline,縮寫PBS，其組成成分為 137mMNaCl' 2.7mMKCl， 8.1 mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04, pH7.5)'進行反復研 磨。研磨的待測組織樣品和待測細胞重復凍融3次，即于-20'C低溫冰箱快速結(jié)凍及37'C進行 快速解凍，以制成待測勻槳液。得到的勻槳液經(jīng)攪拌均勻后，制成待測樣品。
2. 待測樣品總RNA的提取
(1) 將待測細胞或組織勻漿液以12500 g離心5分鐘，除去上清，保留沉淀物。
(2) 將離心得到的沉淀物，加入150-200|il的TE (10mmol/LTris.C1, lmmol/LEDTA， p朋.O)進行懸浮，TE用焦碳酸二乙脂(DEPC)處理的去離子水配置，高壓滅菌，然后加入蛋 白酶K和SDS,使其終濃度為100pg/ml禾3 0.5°/0 (W/V)。充分混勻后，65'C水浴孵育lh，對 細胞或組織勻漿液進行裂解。
(3) 采用RNA吸附柱離心法獲得上述待測樣品RNA提取物，用于后續(xù)RT-PCR擴增。
(4) 采用分光光度計對所提取的RNA進行定量測定。
二. RT-PCR擴增
1. 采用RT-PCR方法進行GCRV衣殼蛋白s10基因片段擴增?；贕enBank序列進行 slO基因片段引物設計。用于擴增GCRVslO的正反向引物序列如下
正向引物(GCRV-S 10-SF1)的序列5' -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3' 反向引物(GCRV-S10-ASF)的序列5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
2. 采用常規(guī)cDNA第一鏈合成試劑盒，進行cDNA合成。
cDNA合成的具體方法是將特異引物或隨機引物與待測RNA在65i:反應5min后，立 即放置冰上，然后在20pl反應體積依次加入上述變性的RNA模板引物混合物，5XRTBuffer, 10mM dNTP混合物，10U//il RNase Inhibitor lpl， 200U/ml的SuperScriptIl逆轉(zhuǎn)錄酶1^1; 42'C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，置-20。C保存cDNA產(chǎn)物。取2|_d cDNA合成產(chǎn)物， 加入slO正反向引物及常規(guī)PCR反應混合后進行PCR擴增。其PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠 進行電泳鑒定。
三. RT-PCR檢測的靈敏度測定
采用RNA吸附柱離心法獲得上述待測樣品RNA提取物后，可用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄用 于后續(xù)PCR擴增，也可以用上述特異反向引物序列進行cDNA合成，其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA直 接用作PCR擴增的模板。以未感染病毒的正常CIK細胞及正常魚組織作為陰性對照， GCRV873為擴增產(chǎn)物的陽性對照。結(jié)果顯示，待測的感染GCRV細胞或病魚組織樣品均應有 約500bp陽性擴增產(chǎn)物，陰性對照無任何擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，本方法能檢測出的GCRVdsRNA最 低含量為10—6ng。
四. 待測樣品RT-PCR檢測的特異性分析
用slO特異引物對不同養(yǎng)殖地區(qū)的正常草魚與感染GCRV的患病草魚進行了 RT-PCR檢 測，其待測RNA樣品及RT-PCR檢測均按上述方法進行，同時應設置未感染GCRV的健康 魚組織提取液為陰性對照，陰性對照樣品中應無特異性核酸擴增產(chǎn)物。本方法己對從我國南 方不同地方淡水養(yǎng)殖區(qū)收集到的患草魚出lfiL病魚組織和分離保存的GCRV分離株進行了檢 測，結(jié)果顯示該RT-PCR檢測方法具有很強的特異性。其陽性與陰性對照符合率為100%。
五. 草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法的用途 該檢測方法用于草魚出血病的早期診斷，或出入境水產(chǎn)品疫情的檢測。<110> 中國科學院武漢病毒研究所
<120> 草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法
<140> <141〉
<160> 1 <170>
<210〉 1
<211> 22
<212〉 DNA
<213> 人工序列 <220〉 <221>
<222> (1)…(22)
<223> 正向引物GCRV-S10-SF1
<400〉 1
5， 一TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3，
<210> 2
<2U> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 <220〉 <221>
<222> (1)…(21)
<223> 反向引物GCRV-S10-ASF
<400> 2
5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3，
權(quán)利要求
1.一種草魚呼腸孤病毒核酸檢測方法，其特征是一種草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是采用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征是該方法包括以下步驟 (1 )將所述待測樣品研磨凍融后進行離心沉淀，(2) 在上述離心沉淀的溶液中加入蛋白酶K及SDS進行細胞裂解，通過RNA吸附柱 進行待測樣品總RNA的分離，(3) 采用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)與高保真Taq酶，及slO基因片段特異引物序列進 行s10基因片段的RT-PCR核酸擴增。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征是所述待測樣品由以下方法得到(1) 取0.5 lml待測樣品進行研磨，制成待測勻槳液；(2) 對于待測魚體組織樣品，按l:3重量體積比加入lxPBS，進行待測樣品研磨，研磨 的待測樣品重復凍融3次，即在-2(TC低溫冰箱中快速結(jié)凍，然后取出于37'C快速解凍，得到 待測勻漿液；(3) 將上述待測勻漿液通過離心得到沉淀物，該沉淀物為所述待測材料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征是在步驟(3)中所述待測勻漿液由離心 機以12500 g離心5分鐘得到沉淀物，在該沉淀物中加入150 200 |al的pH值為8.0的TE， TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然后依次加入蛋白酶K和SDS，使其終濃度 分別為100(jg/ml和0.5%;經(jīng)充分混勻后，于60 68。C水浴孵育lh;再用RNA吸附柱離心 法獲得RNA提取物，用于后續(xù)RT-PCR擴增。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征是采用以下方法進行后續(xù)RT-PCR擴增，其 步驟包括(1) 根據(jù)GCRVslO基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396;(2) RT反應或cDNA合成采用slO基因反向特異引物與待測RNA樣品混合，65'C反 應5分鐘后立即放置冰上，然后在2(^1反應體積依次加入變性的RNA模板引物混合物，5 XRT Buffer, lOmMdNTP混合物，10U//xl的RNase Inhibitor, 200U/fxl的逆轉(zhuǎn)錄酶1^1;于 42。C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，cDNA產(chǎn)物置-2(TC保存?zhèn)溆?；?|il cDNA產(chǎn) 物為模板，用GCRVslO基因序列正反向特異引物進行PCR擴增。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征是所述GCRVslO基因序列的正反向特異引 物的序列是7H向引物的序列5' -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3， 反向引物的序列5，-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征是用GCRVslO基因序列的正反向特異引物 擴增RT-PCR的產(chǎn)物大小為515bp，該產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征是RT-PCR擴增產(chǎn)物的陽性對照物為 GCRV873， GCRV873是草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求S中任一權(quán)利要求所述檢測方法的用途，其特征是該檢測 方法用于草魚出血病的早期診斷或出入境水產(chǎn)品疫情的檢測。
全文摘要
本發(fā)明是一種草魚呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是采用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。本檢測方法的優(yōu)點是僅需微量的待測組織樣品，即可通過柱離心法提取待測樣品總RNA及進行RT-PCR擴增，其最低檢測靈敏度為10^-6ng，所需時間僅為4-5小時，其檢測方法簡便可靠，靈敏度高，特異性強。該結(jié)果將有望應用于GCRV臨床快速診斷及魚苗的出入境海關(guān)檢疫。
文檔編號C12Q1/70GK101629216SQ20091006304
公開日2010年1月20日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者丁清泉, 張嵐嵐, 勤 方 申請人:中國科學院武漢病毒研究所