專利名稱：與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記及其用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與小麥抗白粉病基因PmLK906 連鎖的PCR標(biāo)記及其用法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟系诙蠹Z食作物，是我國最重要的農(nóng)作物，僅河南省每年播種面積 就達(dá)7000萬畝以上。病害是造成小麥減產(chǎn)的主要原因之一，小麥銹病、紋枯病、赤霉病、黑 穗病、黃矮病等在黃淮麥區(qū)均有發(fā)生，而白粉病則是發(fā)病最早、持續(xù)時(shí)間最長、危害最嚴(yán)重 的病害，其發(fā)病范圍廣、危害嚴(yán)重，呈上升趨勢。1990年白粉病發(fā)病面積達(dá)1800萬ha2，約 占我國小麥面積的1/2，為1981年的3. 6倍。白粉病一般可造成13% 34%的產(chǎn)量損失， 嚴(yán)重年份減產(chǎn)高達(dá)30% 50%，并嚴(yán)重影響小麥的品質(zhì)。從2009年4月初開始，白粉病在 河南省大面積流行，嚴(yán)重程度為近年罕見。而大面積推廣品種均感白粉病，無法控制白粉病 流行。雖然藥物對小麥白粉病有一定的防治作用，但存在以下不足，首先是藥物防治不 能杜絕病害流行；第二是白粉病發(fā)病周期短，僅5 7天，在小麥白粉病流行期間要控制發(fā) 病程度需要噴灑藥物3 4次；第三是藥物防治增加成本，按3次施藥，每畝要增加人力、藥 物投入約50元；第四是藥物防治影響小麥品質(zhì)；第五是藥物殘留不利于環(huán)境保護(hù)和小麥的 綠色生產(chǎn)。2009年在豫北麥區(qū)調(diào)查結(jié)果表明，藥物防治白粉病效果下降。目前，國際上已經(jīng)正式命名了 39個(gè)小麥抗白粉病基因，但大多已喪失抗性，因 此，尋找有效抗病基因，培育抗病小麥新品種是小麥育種家的重要任務(wù)之一。小麥“蘭 考90(6)，，是沈天民研究員選育的抗白粉病品系(王祖華，牛吉山，郭天財(cái)，張麗娜，沈天 民.2004.小麥主栽品種中的IRS分布和蘭考90(6)系列白粉病新抗源.西北植物學(xué) 報(bào)，24:1216-1220)。我們的研究表明，“蘭考90 (6) ”攜帶1對隱性抗白粉病基因，命名 為PmLK906，是目前我國少數(shù)有效的抗白粉病基因之一(牛吉山，王映紅，周益林，段霞 瑜，沈天民.2006.普通小麥“蘭考90(6)”品系白粉病抗性遺傳.植物病理學(xué)報(bào)，36 (6) 528-533)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記及其用法。本發(fā)明的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記，命名為Xgdm93_122，是由 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴(kuò)增。與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記引物的用法以待測小麥基因DNA 作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1，以SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列 作為引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有122bp片段特異帶，能擴(kuò)增出122bp片段 特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴(kuò)增出122bp片段特異帶的單株不攜帶抗病基因 PmLK906。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR試劑組成為H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ LdNTP(25mmol/L) 1.6μ L引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ LTaq 酶(20u/yL) 0. 16 μ L模板DNA (50ng/ μ L) l.OyL總體積20.0yL，PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4°C預(yù)變性4分鐘；接35個(gè)循環(huán)的94°C變性30秒，50°C復(fù) 性45秒，72°C延伸30秒；最后在72°C延伸10分鐘，4°C保存待檢測。所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物方法為擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行分 離，然后用銀染法進(jìn)行顯色。本發(fā)明通過抗病品系“蘭考90(6) ”與感病品種“中國春”雜交建立了 F3代分離群 體，用分池法建立抗、感DNA池，篩選出與抗病基因PmLK906連鎖的分子標(biāo)記Xgdm93_l22，發(fā) 展出能在不同小麥遺傳背景下跟蹤檢測PmLK906的PCR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下本發(fā)明提供了小麥抗白粉病基因PmLK906的PCR分子標(biāo)記Xgdm93_122，該標(biāo)記與 PmLK906基因緊密連鎖，PmLK906基因是目前我國少數(shù)有效的抗白粉病基因之一，可以對抗 病基因PmLK906進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，從而實(shí)現(xiàn)與其它有效抗病基因的累加，延長品種 的抗病性。利用這種方法，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長等缺點(diǎn)，有目標(biāo)地將抗 病基因快速轉(zhuǎn)入感病品種，而且可有目的地聚合多個(gè)有效抗白粉病基因，培育出具有穩(wěn)定、 持久抗性的小麥新品種。


圖1是引物gwm265擴(kuò)增結(jié)果；其中，Pk是“蘭考90(6)21_12”;PS是“中國春”;BK是純合抗病DNA池；BS是純合感 病DNA池；S是純合感病植株；R是純合抗病植株；H是雜合植株。圖2引物gdm93擴(kuò)增結(jié)果；其中，Pk是“蘭考90 (6) 21-12” ;BE是純合抗病DNA池；BS是純合感病DNA池；S是 純合感病植株；R是純合抗病植株；H是雜合植株。圖3分子標(biāo)記Xgdm93-122與抗白粉病基因PmLK906的連鎖關(guān)系。圖4用標(biāo)記Xgdm93_122檢測回交轉(zhuǎn)育抗病品系后代；其中，1 “蘭考90(6)21-12” ；2 “周麥18” ；R 抗病植株；S 感病植株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中未注明材料來源者均購自于國家種子資源庫。1.本發(fā)明的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記引物(Xgdm93_122)的篩選過程標(biāo)記篩選基本過程是提取抗病池DNA和感病池DNA ；選取均勻分布在每條小麥染 色體上的120個(gè)SSR引物對，用這些引物在抗、感DNA池中擴(kuò)增，初步獲得具有多態(tài)性產(chǎn)物 的引物對；根據(jù)初篩結(jié)果提示，確定抗病基因所在的染色體及染色體臂。在此基礎(chǔ)上再選用 更多的抗病基因所在染色體臂上的SSR引物進(jìn)行篩選，獲得抗病基因連鎖標(biāo)記。具體步驟 如下(1)植物材料感病親本“中國春”，抗病親本“蘭考90(6)21-12”。配置雜交組合 “中國春” / “蘭考90 (6) 21-12”，獲得F1代、F2代分離群體和139個(gè)F2:3家系分離群體。同 時(shí)還配置了“蘭考90 (6)” X “豫麥21”、“蘭考90 (6)” X “濮麥9號”、“蘭考90 (6) ” X “白 硬冬2號”等抗、感小麥雜交組合，獲得了不同組合的F1代、F2代、F2:3家系，用于標(biāo)記驗(yàn)證。(2)白粉病抗性鑒定采用離體葉段培養(yǎng)法接種小麥白粉病菌鑒定親本及雜交后 代材料的抗病性。選用合適的培養(yǎng)皿，放置一層中性濾紙，用40mg/L的6-芐氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine 6-BA)充分濕潤濾紙。待幼苗第一片葉完全展開后，截取3 4cm 葉段，按編號放在濾紙上。接種小麥白粉病菌，用本實(shí)驗(yàn)室通過連續(xù)單孢子堆分離純化的 2個(gè)白粉病菌株，采用輕拂法人工接種，24小時(shí)后再重復(fù)接種1次。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 18°C，每天光照12小時(shí)，在感病對照充分發(fā)病的情況下(7 10天)按照0 4級反應(yīng)型 記錄白粉病發(fā)病情況，48小時(shí)后再重復(fù)觀察一次。(3)抗、感病DNA池的構(gòu)建在“中國春，，/ “蘭考90 (6) 21_12”雜交F3株系中選擇 10個(gè)純合抗病家系構(gòu)建抗病池，10個(gè)純合感病家系構(gòu)建感病池。(4)小麥葉片基因組DNA的提取參照Sambrook等(1989)編著的《Molecular cloning :a laboratory manual》(Sambrook L, Fritsch EF, Manniatis Τ.Molecular cloning :a laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York :1989.)進(jìn)行小麥基因組 DNA 的提取。(5) PCR擴(kuò)增程序PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PE9600PCR儀上進(jìn)行，首先在94°C預(yù)變性4分； 94°C變性30秒，根據(jù)每對引物的特征在50 60°C復(fù)性45秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)； 72°C延伸10分。取出置于4°C冰箱待檢測。(6)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。(7)多態(tài)性標(biāo)記的篩選選取均勻分布在每條小麥染色體上的120個(gè)SSR引物對， 在抗、感DNA池中擴(kuò)增，初步獲得具有多態(tài)性產(chǎn)物的引物對gwm265(圖1)。根據(jù)初篩結(jié)果提 示，抗病基因在2AL染色體臂上。再選用小麥遺傳圖中g(shù)wm265附近的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增篩 選，發(fā)現(xiàn)gdm93能擴(kuò)增出多態(tài)帶。在抗、感親本和抗、感DNA池中擴(kuò)增出一致多態(tài)性條帶的 引物gwm265和gdm93，再在139個(gè)F3分離群體中進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算連鎖遺傳距離。最終證明 g碰265(圖1)和gdm93(圖2)引物對擴(kuò)增的條帶與PmLK906基因緊密連鎖(表1)。(8)連鎖分析采用Joinmap3. 0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析， 計(jì)算目的基因與分子標(biāo)記的遺傳距離(圖3)。(9)獲得可以跟蹤PmLK906的共顯性分子標(biāo)記Xgdm93_122，是由SEQ IDNo. 1所示 的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴(kuò)增。表IF3分離群體的白粉病反應(yīng)型和gwm265and gdm93引物擴(kuò)增結(jié)果反應(yīng)型 品系數(shù)
Xgdm93.
權(quán)利要求
一個(gè)與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記，命名為Xgdm93 122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記引物的用法，其特 征在于以待測小麥基因組DNA作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1， 以SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列作為引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有122bp 片段特異帶，能擴(kuò)增出122bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴(kuò)增出122bp 片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記引物的用法， 其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR試劑組成為H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ L dNTP(25mmol/L) 1. 6μ L 引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L 引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ L Taq 酶(20u/ μ L) 0. 16 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) l.OyL 總體積20. OyL，PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4°C預(yù)變性4分鐘；接35個(gè)循環(huán)的94°C變性30秒，50°C復(fù)性45 秒，72°C延伸30秒；最后在72°C延伸10分鐘，4°C保存待檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記引物的用 法，其特征在于所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物方法為擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上 進(jìn)行分離，然后用銀染法進(jìn)行顯色。
全文摘要
一個(gè)與小麥抗白粉病基因PmLK906連鎖的PCR標(biāo)記及其用法，屬于植物分子育種技術(shù)領(lǐng)域。標(biāo)記命名為Xgdm93-122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴(kuò)增。用法為以待測小麥基因組DNA作為模板，以Xgdm93-122的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有122bp片段特異帶，能擴(kuò)增出122bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴(kuò)增出122bp片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。所述的分子標(biāo)記可以在不同小麥遺傳背景中準(zhǔn)確檢測PmLK906基因的存在，該技術(shù)可以加快PmLK906基因向小麥生產(chǎn)品種中的轉(zhuǎn)育速度。
文檔編號C12Q1/68GK101955986SQ20091006542
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者倪永靜, 尹鈞, 牛吉山, 王保勤, 王正陽 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)