專利名稱：：實時熒光定量pcr快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬分子生物學(xué)范疇，確切地說是利用熒光PCR技術(shù)快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及試劑盒。技術(shù)背景近十多年來，我國養(yǎng)鴨業(yè)獲得迅速發(fā)展，據(jù)2002年根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FA0)統(tǒng)計，我國鴨存欄約6.61億只，占世界總量的69.7%,可見我國是第一鴨生產(chǎn)大國。而且以每年10%15%的速度遞增，新建的大規(guī)模養(yǎng)殖場逐漸增多，鴨產(chǎn)品的年產(chǎn)值己經(jīng)接近300億元人民幣，而且遠銷歐盟、東南亞、日本、韓國等地，隨著國民經(jīng)濟的進一步發(fā)展，鴨產(chǎn)品空間還會不斷擴大，所以養(yǎng)鴨業(yè)存在巨大的潛力。但由于各地多渠道引進種鴨或蛋，國內(nèi)禽產(chǎn)品市場交流頻繁，集約化飼養(yǎng)缺乏管理經(jīng)驗，防疫工作措施不當(dāng)，環(huán)境污染嚴重，導(dǎo)致鴨的各種疾病不斷發(fā)生，而且越來越復(fù)雜，但危害較為嚴重的仍為病毒性傳染病，每年引起鴨死亡占到15%20%，嚴重制約著我國養(yǎng)鴨業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。鴨病毒性腸炎(duckviralenteritis,DVE或DPV),俗稱"鴨瘟"、"大頭瘟"或"爛腸瘟"。是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。是養(yǎng)鴨場的一種最常見的疾病之一，其流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病率與死亡率極高。每年由于該病的發(fā)生引起的死亡、淘汰、產(chǎn)蛋下降，給發(fā)病地區(qū)的商品肉鴨和產(chǎn)蛋鴨造成很大的損失。目前針對鴨病毒性腸炎的診斷方法主要有病毒分離鑒定、瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光技術(shù)等。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)己被應(yīng)用于鴨瘟的快速診斷。國外Plu咖er等(酒)、Pritchard等(1999)先后應(yīng)用PCR診斷DPV獲得成功。國內(nèi)謝芝勛等(2000)首次成功應(yīng)用PCR診斷鴨瘟。郭霄峰等(2002)、陳建君等(2003)、韓先杰等(2003)、馬秀麗等(2005)、宋涌等(2005)均在鴨瘟病毒DNA不同位點設(shè)計相應(yīng)引物，擴增特異性片段，能以較強的特異性和較好的敏感性快速地檢出鴨瘟病毒。楊發(fā)龍(2006)建立了檢測鴨瘟病毒的實時熒光定量PCR方法，用來進行快速診斷、致病機理研究及抗病毒藥物篩選等。湯承(2006)建立了SYBRGreenI實時定量PCR快速檢測鴨瘟病毒法，檢測鴨瘟標(biāo)準強毒、疫苗毒及野毒株均為陽性，另外，也根據(jù)DPVUL6，UL7基因的保守序列設(shè)計引物和Taqman探針，建立了real-timePCR檢測鴨瘟病毒方法，來研究DPV在鴨胚中的增殖規(guī)律確定合適的收毒部位和收毒時間，并與空斑法定量檢測結(jié)果進行了相關(guān)行比較，探討了用real-timePCR代替?zhèn)鹘y(tǒng)的雞胚法用于疫苗生產(chǎn)中病毒定量檢測的可行性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是根據(jù)保守序列DEVUL31基因設(shè)計了引物和Taqman探針，提供一種特異性強，敏感性高，具備快速檢測鴨病毒性腸炎，并能有效應(yīng)用于口岸和現(xiàn)場檢疫的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及成本低、可以商品化的檢測試劑盒。本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法引物序列-FP(37421-37440)5'-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3一RP(37475-37496)5'-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3';本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法探針序列probe(37448-37470)5'—FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP—3;所述的探針序列的5'端以FAM(用F表示)標(biāo)記，3'端以TAQMAN(P表示)標(biāo)記。本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法包括以下步驟A、常規(guī)方法提取待檢樣品DNA;B、將上述的引物和探針與PCR混合液加入PCR反應(yīng)管中混合后加入待檢樣品DNA;C、放入熒光PCR檢測儀中進行反應(yīng)；D、有擴增曲線為陽性，無擴增曲線為陰性；步驟B所述的引物FP、RP終濃度均為100nmmol/L，探針終濃度為200nmmol/L步驟B所述的PCR混合液包括緩沖液、dNTP和rTaq酶；其終濃度分別為lmmol/L(1X)、0.5mmol/L和rTaq酶為0.05U/uL，待檢樣品DNA溶液占總反應(yīng)液的10%;終濃度是指該物質(zhì)在PCR總反應(yīng)液中的含量；步驟C按第一階段94"C、5min，1個循環(huán)；第二階段94。C、30s,58°C、30s，72'C，30s，各40個循環(huán)；在第二階段延伸時即72'C、30s，收集熒光信號觀察擴增曲線，記錄Ct值，按線性公式:Ct值Y=-2.229X+30.877，計算X值，樣品的鴨病毒性腸炎病毒拷貝數(shù)為2.1X1()X個/uL;本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品為重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp，DEV76bp的核苷酸序如序列表SEQIDNO.4;定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品為重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp濃度選自2.1X1012.1X109拷貝/uL，9個濃度水平。實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒它包括溶液1:2nmmol/L引物SEQIDNO.1和2ymmol/L引物SEQIDNO.2的1:1混合液；5溶液2:2ummol/L探針，核苷酸序如序列表SEQIDNO.3，5'端以FAM(用F表示)標(biāo)記，3'端以TAQMAN(P表示)標(biāo)記；溶液3:PCR混合液；所述的試劑盒還包括選自濃度為2.1X10'2.1Xl(^拷貝/yL定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp做為陽性對照；正常鴨組織基因提取物做陰性對照。所述的溶液3、PCR混合液是由緩沖液為10mmol/L(10X)、dNTP為2.5mmol/L和rTaq酶為5U/UL，按2:4:0.2比例配制的。實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒的使用方法A、將所述的溶液l:2uL、溶液2:2uL和溶液3:14yL加入PCR反管內(nèi)混合后，分別加入待檢樣品DNA溶液、陽性對照及陽性對照，加入量為2uL;B、將加好樣品的熒光PCR反應(yīng)管按順序放入熒光PCR檢測儀中，按第一階段94'C、5min，l個循環(huán)；第二階段94'C、30s，58°C、30s,72°C，30s，各40個循環(huán)；設(shè)定反應(yīng)條件；C、在第二階段延伸時即72'C、30s，收集熒光信號觀察擴增曲線，記錄Ct值，按線性公式Ct值Y=-2.229X+30.877，計算X值，樣品的鴨病毒性腸炎病毒拷貝數(shù)即為2.1X1()X個/uL;質(zhì)控標(biāo)準只有①、②均符合試驗成立，否則試驗不成立，應(yīng)重新進行；①陰性對照無Ct值，并且無擴增曲線；②陽性對照的Ct值應(yīng)〈30，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線；判定標(biāo)準①當(dāng)被檢測樣品無擴增曲線，表明樣品中無鴨瘟??；。②當(dāng)被檢測樣品有擴增曲線，且Ct值《30，表示樣品中有鴨瘟病毒；③當(dāng)30《Ct《35，樣品需重新測定，重新測定無Ct值判為陰性，仍出現(xiàn)30《Ct《35，則判為陽性。本發(fā)明實時熒光定量PCR檢測鴨病毒性腸炎病毒的方法，利用GenBank(登錄號EF417996)中鴨病毒性腸炎病毒UL31基因高度保守序列，設(shè)計引物和探針，對擴增片段的測序結(jié)果顯示，擴增片段核苷酸序列與GenBank中登記號為EF417996的UL31like基因片段序列的同源性為100%，對本實驗室保存的己知鴨病毒性腸炎病毒和購買的疫苗毒株以及各地的臨床樣品進行檢測，均觀察到擴增曲線，對擴增片段的測序結(jié)果，同源性均為100%，說明該片段高度保守，從而排除了由于病毒變異和地域因素造成的假陰性問題，提高了檢出陽性率和方法的兼容性。6利用本發(fā)明實時熒光定量PCR檢測鴨病毒性腸炎病毒的方法，對DPV-F37、疫苗株C-KCE為模板進行熒光PCR檢測，擴增曲線均為陽性，拷貝數(shù)、Ct值(Y軸)和起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值(X軸)，符合本發(fā)明建立的熒光定量檢測的標(biāo)準曲線。對感染鴨抗凝血、糞、腦、心、肝、脾、肺、腎、腸等組織的檢測結(jié)果一致，更適用于鴨病毒性腸炎的臨床診斷。對鴨易感的病毒性肝炎病毒、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鵝源禽流感H5毒株、新城疫、小鵝瘟模板DNA進行熒光PCR檢測，均未見擴增曲線，CT值為Undet。說明不與非鴨病毒性腸炎病原DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，充分證明了其檢測鴨病毒性腸炎病毒的高度特異性，因而該方法檢測的結(jié)果具有良好的可靠性。定性檢測，通過實時監(jiān)測熒光擴增曲線的生成，對于樣品含毒量高的樣品可在幾個或十幾個循環(huán)后就能得到陽性結(jié)果，大大縮短檢測時間。定量檢測從樣本核酸提取到報告結(jié)果耗時不超4h，最小可檢出2.lX10?？截?uL。對不同的臨床DEV陽性組織樣品和不同廠家生產(chǎn)的活疫苗毒株進行重復(fù)檢測，并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，變異系數(shù)(CV)均小于2.5%。本發(fā)明鴨病毒性腸炎病毒定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品(重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp)，各濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)"=0.95),選擇高、中、低濃度的質(zhì)粒樣本每一濃度，進行批間重復(fù)性試驗，測得的Ct值進行統(tǒng)計學(xué)處理，三種濃度的變異系數(shù)均小于5%。并且克服了采用病毒做為模板存在感染性的缺點，生物學(xué)特性穩(wěn)定，符合生物安全的要求。本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒及其使用方法，是經(jīng)過本發(fā)明人，利用本發(fā)明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法，對大量的標(biāo)準毒株以及各地的臨床樣品進行檢測，總結(jié)、優(yōu)選出的試劑組裝的標(biāo)準化試劑盒，在標(biāo)準化反應(yīng)條件下反應(yīng)，嚴格的質(zhì)控標(biāo)準和準確的判定標(biāo)準進行定性及定量判定。特異性強、敏感性高、定量陽性質(zhì)控品安全，具備快速檢測鴨病毒性腸炎，而且操作筒單、成本低，適于現(xiàn)場鴨病毒性腸炎的大規(guī)模檢疫、口岸檢疫、流行病學(xué)調(diào)査及實驗室快速診斷。圖1PCR驗證引物特異性和反應(yīng)條件擴增后電泳鑒定圖，其中1，陰性對照；2:PCR擴增產(chǎn)物；M:墜ker。圖2重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp經(jīng)HindIII/EcoRI雙酶切電泳結(jié)果，其中M:marker12:酶切產(chǎn)物。圖3PCR擴增目的序列電泳圖，其中l(wèi):陰性對照；2:PCR擴增產(chǎn)物；M:marker。圖4每個階梯濃度定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品熒光PCR產(chǎn)物電冰結(jié)果，其中1-10:2.1X10972.1X10?？截?；11:2.1X1(T'拷貝;12:陰性對照；M:DNAMarkerDL2000。圖5每個階梯濃度定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品動力學(xué)擴增曲線。具體實施例方式實施例1實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎陽性質(zhì)控標(biāo)準品一重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp的制備根據(jù)保守序列DEVUL31基因設(shè)計了引物和Taqman探針引物FP(37421-37440)5'-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3'引物RP(37475-37496)5'-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3'探針probe(37448-37470)5'—FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP—3探針序列的5'端以FAM(用F表示)標(biāo)記，3'端以TAQMAN(P表示)標(biāo)記；鴨病毒性腸炎雞胚化弱毒疫苗株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，用寶生物工程(大連)有限公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA;按下表成份加樣量(uL)10Xbuffer5jjL上游引物(2pmol/VL)1(xL下游引物(2pmol/VL)1nLdNTP(2.5咖ol/L)4^rTaq酶(5U/nL)0.25pL基因組DNA3)jLddH2035.75pL總體積50.0pL的反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為94°C2min;94°C30s，58°C30s,72°C35s，35個循環(huán)72。C7min;4°C保存；同時取6.0擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期大小(76bp)相符的一條目的帶(見圖l);上述的PCR產(chǎn)物用大連寶生物工程有限公司的DNA凝膠回收試劑盒進行的回收DEV76bpDNA，將DNA貯存于-20°C;按下表連接反應(yīng)體系pMD18-TVector1jiLLigationSolutionI.5jjL目的片段(DEV76bp)7純水2總體積15^的連接反應(yīng)體系，置于16'C連接4h,將回收的PCR產(chǎn)物DEV76bp連接到pMD18-T上；上述連接產(chǎn)物pMD18-T-DEV76bp轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a中)，置-20。C冰箱中保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)HindIII/EcoRI雙酶切鑒定為陽性質(zhì)粒(見圖2)，由大連寶生物工程有限公司完成測序，其核苷酸序列見SEQIDNO.4，將所得序列與GenBank(登錄號:EF417996)已發(fā)表的序列比較，二者的同源性為100%。實施例2用重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp做模板，常規(guī)PCR驗證引物特異性試驗用重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp做模板，用下列引物FP(37421-37440)5'-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3'RP(37475-37496)5'-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3'按反應(yīng)體系常規(guī)PCR驗證引物特異性試驗?zāi)康幕驍U增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按下表PCR反應(yīng)程序循環(huán)階段循環(huán)數(shù)溫度rc)時間11945min9430s2405830s7230s314停止進行常規(guī)PCR擴增；得到與預(yù)期大小(76bp)相符的一條目的帶，條帶具有特異性，引物沒有二聚體，如圖3;將PCR擴增的產(chǎn)物在W低熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳，切下目的條帶；按微量凝膠回收試劑盒的使用說明回收目的DNA;將純化的目的DNA4.5uL、T載體0.5uL和連接液5.0uL混勻，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，挑取白色菌落接種5mLLB液體培養(yǎng)基，37°C水浴中搖振培養(yǎng)12h;經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒，HindIII/EcoRI雙酶切鑒定為陽性質(zhì)粒，由大連寶生物工程有限公司完成測序，與標(biāo)準陽性質(zhì)粒，NCBI庫發(fā)表的相關(guān)序列進行比較，測序的PCR產(chǎn)物與NCBI公開發(fā)表的核酸序列具有100%的同源性；說明該片段具有高度的保守性，可以在其中設(shè)計熒光探針，將設(shè)計的探針序列同GeneBanK數(shù)據(jù)庫序列文件進行BLAST比對，探針序列具有特異性。該重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp可作為熒光定量PCR陽性質(zhì)控標(biāo)準品。實施例3定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp的制備將實施例2凍存的含有重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a轉(zhuǎn)種于含Amp+60ng/ml的LB液體培養(yǎng)基，250r/min震蕩增菌培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)種于LB液體培養(yǎng)基，250r/min震蕩增菌培養(yǎng)23小時，然后用TaKaRa公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；取質(zhì)粒樣品lOuL，用1990wL雙蒸水稀釋，取70uL轉(zhuǎn)到l.Ocm石英比色杯中，在紫外分光光度計上測定A260;根據(jù)A260的吸光度值可計算出樣品中DNA的含量，即l個OD值相當(dāng)于50ug/ml雙鏈DNA;然后，按照公式ug/uL，x=,0,計算質(zhì)粒濃度，按照公式拷貝數(shù)(個/uL)=6.23Xyf/l/uU,計算質(zhì)?？截悢?shù)10,,J260x稀釋倍數(shù)x500.007x200x50nn7,/Mug/uL=-t^::^-—-畫-7^^^-=0.07(ug/uL)拷貝數(shù)(個/uL)mool畫—6.23xl023x質(zhì)粒濃度^/uU330x質(zhì)粒堿基總數(shù)6.23xl023x0.07x10—=2.1X101。(個/uL)330x2x(2692+446)將提取的質(zhì)粒用超純水10倍比稀釋，制成2.1X10.'2.1乂109定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp，-20。C保存?zhèn)溆谩嵗?熒光定量PGR檢測鴨病毒性腸炎的標(biāo)準曲線的確定按下表的反應(yīng)系熒光PCR反應(yīng)體系名稱儲備液濃度終濃度加樣量(4L)緩沖液lOmmol/L(10X)IX2dNTP2.5mmol/L0.5mmol幾4上游引物2u國ol/L100誦ol/L1下游引物2timmol/L100n醒ol/L1探針2ummol幾200誦ol/L2rT叫酶5U/"0.05U/liL0.2水_一7.8模板DNA一一2總體積一_20加樣順序為先加入水再依次加入10Xbuffer、dNTP、引物、熒光探針、rTaq,將所有成分充分預(yù)混，最后加入模板DNA——2.1X10—'2.1XlCf定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp;按下表循環(huán)階段循環(huán)數(shù)溫度rc)時間11945min9430s2405830s7230s的擴增程序，進行熒光定量PCR反應(yīng)；在第2階段的延伸時(72°C，30s)收集熒光信號；每個階梯濃度定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp進行三次檢測，各階梯濃度電泳結(jié)果見圖4;動力學(xué)擴增曲線見圖5;各階梯濃度Ct值見下表；各階梯濃度Ct值質(zhì)粒濃度(拷貝/"L)1Ct值23CV(%)2.1xl097.888.278.222.6%2.1xl0811.6312.0312,043.9%2.1"0714.3215.3315.444.1%18.0017.7518.091.0%2.1xl0521.4121.1721.100.8%2.1x10424.0724.0424.240.4%2.1xl0324.5824.9824.970.9%2.1xl0226.1725.4326.131.6%2.1x10'28.8628.1528.241.4%2.1x10034.5436.0435.102.2%2.1x10"Undet.Undet.Undet.Undet.濃度2.IX10—'定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp，沒有電泳條帶和動力學(xué)擴增曲線，也沒檢測Ct值；最低檢測濃度為2.1X10n個拷貝的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp;以起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，將2.1X101、2.1X102、2.1X103、2.1X104、2.1X105、2.1X106、2.1X107、2.1X108、2.1Xl(f9個濃度水平的陽性質(zhì)控標(biāo)準品拷貝數(shù)的的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸作回歸曲線，經(jīng)對數(shù)擬合作圖形成標(biāo)準曲線，定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp在標(biāo)準曲線上的數(shù)據(jù)點與曲線結(jié)擬合良好；在較低的模板拷貝數(shù)時(2.1X10')仍然具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達到0.95，線性關(guān)系式為:Y^-2.229X+30.877。實施例5特異性試驗對購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的鴨病毒性腸炎雞胚化弱毒疫苗株C-KCE、標(biāo)準強毒DPV-F37(DEV)、購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的鴨病毒性肝炎DHV-I型以及由本中心實驗室分離并保存的鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鵝源禽流感H5毒株、新城疫、小鵝瘟，DNA提取試劑盒提取病毒DNA(模板DNA)，2.1X105個拷貝的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp做定量陽性對照，按下表的反應(yīng)系12熒光PCR反應(yīng)體系名稱儲備液濃度終濃度加樣量(yL)緩沖液10mmol/L(10X)IX2dNTP2.5咖ol/L0.5mmol/L4上游引物2timmol幾100畫1/L1下游引物2ummol/L100謂ol/L1探針2ymmol/1200n咖ol/L2rTaq酶5U/uL0.05U/uL0.2水—一7.8模板DNA—一2總體積——20加樣順序為先加入水再依次加入10Xbuffer、dNTP、引物、熒光探針、rTaq,將所有成分充分預(yù)混，最后加入模板DNA:按下表-循環(huán)階段循環(huán)數(shù)溫度rc)時間11945min9430s2405830s7230s的擴增程序，進行熒光定量PCR反應(yīng)；在第2階段的延伸時(72°C，30s)收集熒光信號；鴨病毒性腸炎標(biāo)準強毒DPV-F37、鴨病毒性腸炎雞胚化弱毒疫苗株C-KCE，2.1X105個拷貝的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp為模板進行的熒光PCR檢測，有擴增曲線均為陽性，CT值(Y)分別為20.12、21.43、22.10，代入線性關(guān)系式:Y=_2.229X+30.877，濃度為分別為鴨病毒性腸炎標(biāo)準強毒DPV-F37:20.12=-2.229X+30.877X=(30.877-20.12)/2.229^5濃度2.1Xl(f個拷貝鴨病毒性腸炎雞胚化弱毒疫苗株C-KCE:20.43=—2.229X+30.877X:(30.877-20.43)/2.229^5濃度2.1X105個拷貝2.1Xl()S個拷貝的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品pMD18-T-DEV76bp:20.10=-2.229X+30.877X=(30.877-20.10)/2.229^5濃度2.1X10S個拷貝鴨易感的病毒性肝炎病毒、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鵝源禽流感H5毒株、新城疫、小鵝瘟模板DNA進行熒光PCR檢測，均未見擴增曲線，CT值為Undet.。實施例6批內(nèi)重復(fù)性試驗用實施例5熒光定量PCR法對3份不同的臨床DEV陽性組織樣品和3個不同廠家生產(chǎn)的活疫苗毒株進行重復(fù)檢測，并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，變異系數(shù)(CV)均小于2.5%。表10已知樣品重復(fù)性檢驗陽性樣品1Ct值3平均值變異系數(shù)(CV)118.54918.47518.15818.3941.13%15.24615.22315.42115.2970.71%17.54117.65417.48617.5600.49%疫苗l21.10621.25721.98321.4492.19%疫苗225.36725.41925.20325.3300.45%疫苗324.25424.35724.40124.3370.31%注平均數(shù)和變異系數(shù)CV(%)的計算采用Excel表格中相關(guān)公式進行計算實施例7對己知病毒檢測結(jié)果用實施例5熒光定量PCR法，對本實驗室保存的2株已知鴨病毒性腸炎病毒和購買的3株疫苗毒株DNA提取試劑盒的提取病毒DNA，進行檢測，結(jié)果5個樣品均觀察對擴增曲線。實施例8對攻毒鴨病料檢測結(jié)果將鴨病毒性腸炎強毒DPV-F371000倍稀釋后，按每只0.2mL劑量給健康鴨肌肉注射，共注射4只；另設(shè)2只對照，肌肉注射滅菌生理鹽水，每只0.2mL。疑似鴨病毒性腸炎病毒感染的病死鴨4只，分別采集抗凝血0.5niL,分別收集糞便、腦、心、肝、脾、肺、腎、腸0.5g，加入10倍量滅菌PBS，研磨，反復(fù)凍融3次，分別以3000r/min離心15min后取上清，DNA提取試劑盒提取病毒DNA,按實施例5熒光PCR方法分別對4只攻毒鴨各組織器官樣品進行檢測，每份進行3個重復(fù)，觀察擴增曲線，結(jié)果見下表。14鴨組織病料熒光PCR檢測結(jié)果組織類別1攻毒鴨編號2341對照組編號2抗凝血3/33/33/33/30/30/3糞3/33/33/33/30/30/3腦3/33/33/33/30/30/3心3/33/33/33/30/30/3月干3/33/33/33/30/30/3脾3/33/33/33/30/30/3月市3/33/33/33/30/30/3腎3/33/33/33/30/30/3腸3/33/33/33/30/30/3以上結(jié)果表明，本發(fā)明熒光PCR方法對患病鴨各組織器官均可采樣進行檢測，只要各組織樣本中含有病毒核酸，即可被檢測到。實施例9實際樣品調(diào)査結(jié)果利用實施例5熒光PCR方法對兩家大型養(yǎng)鴨場和本實驗室近3年來保存的樣品進行試驗，并用陽性樣品做對照，觀察各樣品的擴增曲線與CT值，進行結(jié)果判定，結(jié)果顯示(見下表)，兩家大型鴨場無鴨病毒性腸炎感染，近3年來吉林進境的種鴨均為鴨病毒性腸炎熒光PCR陰性(曾用病毒中和試驗判定也為陰性)。表13實際樣品的檢測結(jié)果樣品來源樣品數(shù)陽性數(shù)陰性數(shù)雙遼某鴨場1500150梅河口某鴨場1500150本實驗室2850285陽性對照330合計5883585實施例io與其它方法進行比較分別對攻毒的4只鴨與全省各地送檢的疑似鴨病毒性腸炎的病料6份，分別采用實例5熒光PCR方法、PCR方法、病毒分離方法進行病原學(xué)檢査，并對各方法的檢測結(jié)果進行比對。15結(jié)果見下表；實際樣品檢測結(jié)果序號樣品來源組織類別/名稱熒光PCR結(jié)果PCR病毒分離1攻毒鴨抗凝血+++2攻毒鴨糞+++3攻毒鴨腦+++4攻毒鴨心+++5攻毒鴨肝+++6攻毒鴨脾+++7攻毒鴨肺+++8攻毒鴨腎+++9攻毒鴨腸+++10SP070405腸與肝十++11SP080325腸與肝+++12TM050211血液++±13CC070322腦、肝、腸+++14CC070326腦、肝、腸++—15CC041217腦、肝、腸++—結(jié)果表明，熒光PCR方法與PCR方法的敏感性均優(yōu)于病毒分離方法(14號、15號樣品)，而且組織需要并不苛刻(19號樣品)。比如12號樣品(血液)，采用病毒分離，主要是其本身毒性將影響到細胞的生長，因而無法判定其是否可以感染特異性細胞。16SEQUENCELISTING<110>吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心〈120〉檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法及試劑盒〈160〉4〈210〉1<211>20〈212〉DNA〈213〉人工<400>1ACGCTGTCCACGTCAGTTTG20〈210〉2<211>22〈212〉DNA〈213〉人工<400>2TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC22<210>3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工<400〉317FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP24<210>4〈211>76<212〉腿〈213〉鴨病毒性腸炎病毒<400>4ACGCTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCGCGCCTCACGACAAGTACGMTGTAGAA60TGCC楊CATGAGCCA7權(quán)利要求1、實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法引物序列FP(37421-37440)5′-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3′RP(37475-37496)5′-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3′。2、實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法探針序列probe(37448-37470)5'—FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP—3;所述的探針序列的5'端以FAM(用F表示)標(biāo)記，3'端以TAQMAN(P表示)標(biāo)記。3、實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法包括以下步驟A、常規(guī)方法提取待檢樣品DNA;B、將上述的引物和探針與PCR混合液加入PCR反應(yīng)管中混合后加入待檢樣品DNA;C、放入熒光PCR檢測儀中進行反應(yīng)；D、有擴增曲線為陽性，無擴增曲線為陰性。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法，其特征在于步驟B所述的引物FP、RP終濃度均為100nmmol/L，探針終濃度為200nmmol/L步驟B所述的PCR混合液包括緩沖液、dNTP和rTaq酶；其終濃度分別為lmmol/L(1X)、0.5mmol/L和rTaq酶為0.05U/UL，待檢樣品DNA溶液占總反應(yīng)液的10%;終濃度是指該物質(zhì)在PCR總反應(yīng)液中的含量。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法，其特征在于所述的步驟C按第一階段94。C、5min,1個循環(huán)；第二階段94'C、30s，58°C、30s,72°C，30s，各40個循環(huán)進行反應(yīng)。并在第二階段延伸時即72°C、30s，收集熒光信號觀察擴增曲線，記錄Ct值，按線性公式Ct值Y=-2.229X+30.877，計算X值，樣品的鴨病毒性腸炎病毒拷貝數(shù)為2.IX10x個/uL。6、根據(jù)權(quán)利要求3、4、5所述的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法，其特征在于定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品為重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp，D'EV76bp的核苷酸序如序列表SEQIDNO.4;濃度選自2.1X10'2.1X1()9拷貝/HL，9個濃度水平。7、實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒，它包括溶液1:2u腿ol/L引物SEQIDNO.1和2ummol/L引物SEQIDNO.2的1:1混合液；溶液2:2Pmmol/L探針SEQIDNO.3，5'端以FAM(用F表示)標(biāo)記，3'端以TAQMAN(P表示)標(biāo)記；溶液3:PCR混合液。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑^特征在于所述的溶液3、PCR混合液是由緩沖液為10mmol/L(10X)、dNTP為2.5mmol/L和rTaq酶為5U/nL，按2:4:0.2比例配制的。9、根據(jù)權(quán)利要求7、8所述的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒，其特征在于它還包括選自濃度為2.1X10'2.1X109拷貝/nL定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp做為陽性對照；正常鴨組織基因提取物做陰性對照。10、實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的試劑盒的使用方法A、將所述的溶液l:2uL、溶液2:2wL、溶液3:6.2uL和純水7.8uL加入PCR反管內(nèi)混合后，分別加入待檢樣品DNA溶液、陽性對照及陰性對照，加入量為2"L;B、將加好樣品的熒光PCR反應(yīng)管按順序放入熒光PCR檢測儀中，按第一階段94T:、5min，l個循環(huán)；第二階段94。C、30s，58°C、30s,72'C，30s，各40個循環(huán)；設(shè)定反應(yīng)條件；C、在第二階段延伸時即72X:、30s，收集熒光信號觀察擴增曲線，記錄Ct值，按線性公式Ct值Y--2.229X+30.877，計算X值，樣品的鴨病毒性腸炎病毒拷貝數(shù)即為2.1X1()X個/uL;質(zhì)控標(biāo)準只有①、②均符合試驗成立，否則試驗不成立，應(yīng)重新進行；①陰性對照無Ct值，并且無擴增曲線；②陽性對照的Ct值應(yīng)〈30,并且出現(xiàn)典型的擴增曲線；判定標(biāo)準①當(dāng)被檢測樣品無擴增曲線，表明樣品中無鴨瘟病；②當(dāng)被檢測樣品有擴增曲線，且Ct值《30，表示樣品中有鴨瘟病毒；③當(dāng)30《Ct《35，樣品需重新測定，重新測定無Ct值判為陰性，仍出現(xiàn)30《Ct《35，則判為陽性。全文摘要本發(fā)明提供了實時熒光定量PCR檢測鴨病毒性腸炎病毒的方法，選擇鴨病毒性腸炎UL31基因片段，設(shè)計引物和探針，對擴增片段的測序結(jié)果，同源性均為100％，不發(fā)生交叉反應(yīng)，從而排除了病毒變異和地域因素造成的假陰性問題，提高了檢出陽性率和方法的兼容性；構(gòu)建了定量陽性質(zhì)控標(biāo)準品(重組質(zhì)粒pMD18-T-DEV76bp)，建立了熒光定量檢測的標(biāo)準曲線，最小可檢出2.1×10°拷貝/μL。組裝的標(biāo)準化試劑盒，在標(biāo)準化反應(yīng)條件下反應(yīng)，準確的質(zhì)控標(biāo)準和判定標(biāo)準進行判定。特異性強、敏感性高、定量陽性質(zhì)控品安全，而且操作筒單、成本低，適于現(xiàn)場鴨病毒性腸炎的大規(guī)模檢疫、口岸檢疫、流行病學(xué)調(diào)查及實驗室快速診斷。文檔編號C12Q1/70GK101514373SQ200910066580公開日2009年8月26日申請日期2009年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日發(fā)明者晶劉,劉和平,孟日增,石建平,肖成蕊,趙慶松申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心