專利名稱：：檢測(cè)Cre位點(diǎn)特異重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種檢測(cè)Cre位點(diǎn)特異性重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，同時(shí)還公開了其培養(yǎng)方法，用于在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，為建立人類疾病模型提供了監(jiān)測(cè)工具，屬于動(dòng)物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：-豬是最適合人類器官移植和建立人類疾病模型的動(dòng)物。建立人類疾病動(dòng)物模型一般需要Cre重組酶以特定的模式表達(dá)，例如使用組織特異性啟動(dòng)子。要在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，需要建立轉(zhuǎn)基因報(bào)告動(dòng)物，目前由于豬核移植的技術(shù)不成熟，人類疾病的模型主要是轉(zhuǎn)基因鼠，但是鼠血液動(dòng)力學(xué)與組織大小及相應(yīng)的生理特點(diǎn)與人類相差較大，不能很好的復(fù)制人類疾病，目前所建立的在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶活性的報(bào)告動(dòng)物也僅僅限于鼠，未見有其他轉(zhuǎn)基因報(bào)告動(dòng)物報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種檢測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，建立了條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，可以很好地在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，起到對(duì)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因豬的監(jiān)測(cè)作用，避免了用鼠作為人類疾病模型的弊端。本發(fā)明公開了上述報(bào)告豬的培養(yǎng)方法。本發(fā)明檢測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，其特征如下該轉(zhuǎn)基因豬含兩個(gè)LoxP錨定一個(gè)neo基因和終止子，后接綠色熒光蛋白基因，綠色熒光蛋白基因由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的條件性表達(dá)載體。采用各種報(bào)告基因各種表達(dá)方式(熒光，化學(xué)底物顯色)的Cre報(bào)告豬。該報(bào)告豬在Cre重組酶存在的情況下，報(bào)告基因(熒光，LacZ等)在細(xì)胞或組織中得以表達(dá)，從而監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性。本發(fā)明報(bào)告豬的培養(yǎng)方法，包括以下步驟-采用基因工程的方法構(gòu)建LoxP位點(diǎn)錨定終止子，后接報(bào)告基因的打靶載體，當(dāng)Cre重組酶存在的情況下，將Lo鄧卯定的終止子刪除，使后接的報(bào)告基因得以表達(dá)，從而用于監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性；在細(xì)胞水平通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選技術(shù)篩選出可以特異性檢測(cè)Cre活性的成纖維細(xì)胞；并進(jìn)行細(xì)胞水平的鑒定。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行克隆豬的構(gòu)建。本發(fā)明利用PCR及分離克隆豬細(xì)胞進(jìn)行感染表達(dá)Cre重組酶的腺病毒的方法鑒定轉(zhuǎn)基因豬的基因的整合及監(jiān)測(cè)Cre重組酶的效果。上述培養(yǎng)方法涉及的打靶載體pICE-STOP是以PCI-Neo為模板，通過PCR循環(huán)擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子；以PBC-1為模板，通過PCR循環(huán)擴(kuò)增絕緣子(insulator);以pEGFP-Cl為模板通過PCR循環(huán)擴(kuò)增eGFP基因；將所擴(kuò)增的片段酶切回收后，分別連入STOP-eGFP-ROSA26TV載體。具體制備方法如下1、載體的構(gòu)建其基本原理為L(zhǎng)oxP錨定neo和一個(gè)終止序列基因，后接綠色熒光蛋白基因，當(dāng)Cre重組酶存在時(shí)，將LoxP間序列切除，使綠色熒光蛋白表達(dá)；當(dāng)Cre重組酶不存在時(shí)，由于neo基因后的終止序列綠色熒光蛋白不表達(dá)，用以在活體內(nèi)檢測(cè)Cre豬Cre重組酶的活性。根據(jù)其原理設(shè)計(jì)了由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)條件表達(dá)綠色熒光蛋白的載體。1.1用于構(gòu)建載體的絕緣子(insulator)、CMV啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白基因的制備分別根據(jù)絕緣子、CMV啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白的序列，并結(jié)合真核表達(dá)載體STOP-eGFP-R0SA26TV和pMD18-T-simple的多克隆位點(diǎn)，并考慮克隆后能保持正確的閱讀框架，在基因兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，在絕緣子基因5'端引入Aatn酶切位點(diǎn)，3'端引入KpnI酶切位點(diǎn)；在CMV啟動(dòng)子基因5'端引入KpnI酶切位點(diǎn)，3'端引入PacI酶切位點(diǎn)；在綠色熒光蛋白的兩端引入ASCI酶切位點(diǎn)，委托生工(上海)公司合成針對(duì)上述基因的靶序列的引物(見表1)，采用PCR的方法擴(kuò)增出三段基因.別連接入ST0P-eGFP-R0SA26TV載體，獲得條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的載體，命名為pICE-ST0P。構(gòu)建示意圖見圖l.表l引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>經(jīng)過酶切鑒定與測(cè)序后，采用北京天根公司的大提試劑盒，對(duì)載體進(jìn)行大提質(zhì)粒，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。2、條件性表達(dá)EGFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬成纖維細(xì)胞的構(gòu)建本發(fā)明將構(gòu)建的條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的pICE-ST0P載體線性化后，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染小型豬胚胎成纖維細(xì)胞，用G418篩選57天后，獲得抗性細(xì)胞。采用一系列的方法對(duì)所獲的細(xì)胞在基因水平(PCR)、轉(zhuǎn)錄水平(RT-PCR)和翻譯水平(Cre重組酶的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))進(jìn)行鑒定，獲得了條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因豬的成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞水平監(jiān)測(cè)了Cre重組酶的特異性表達(dá)，為以后獲得轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，提高轉(zhuǎn)基因豬的效率奠定了基礎(chǔ)。3、利用體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬本發(fā)明采用體細(xì)胞核移植技術(shù)，以紅色杜洛克母豬做代孕母豬，構(gòu)建條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬的品系為黑色中國(guó)小型豬。(圖2)4、對(duì)轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬的鑒定本發(fā)明采用l、PCR，2、分離轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬的尾部細(xì)胞，并感染表達(dá)Cre重組酶，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬的功能。3、利用RT-PCR的方法進(jìn)一歩驗(yàn)證Cre重組酶切除終止子以后，綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬的功能。以下試驗(yàn)例證明本發(fā)明的效果試驗(yàn)例1檢測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬-基因整合1、試驗(yàn)過程取其轉(zhuǎn)基因克隆豬的臍帶，提取基因組，利用PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白，證明其目的基因的整合。2、試驗(yàn)結(jié)果PCR結(jié)果(圖3)表明，目的基因整合到克隆豬的基因組中。3、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的克隆豬為轉(zhuǎn)基因克隆豬。試驗(yàn)例2檢測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬-基因表達(dá)1、病毒所有表達(dá)Cre重組酶的腺病毒與對(duì)照病毒均購(gòu)自北京賽諾基因有限公司。2、試驗(yàn)過程取克隆豬尾，分離成纖維細(xì)胞后感染表達(dá)Cre重組酶的重組腺病毒，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。3、試驗(yàn)結(jié)果取其兩頭克隆豬分離尾部成纖維細(xì)胞，感染Cre重組腺病毒以后，進(jìn)行熒光顯微鏡的觀察結(jié)果(如圖k)，結(jié)果表明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因豬分離的尾部成纖維細(xì)胞在感染Cre腺病毒以后有綠色熒光蛋白的表達(dá)。4、結(jié)論本試驗(yàn)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬通過初步鑒定可以監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，為人類疾病模型的建立起到監(jiān)測(cè)的作用。試驗(yàn)例3檢測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬-基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)1、表達(dá)Cre重組酶腺病毒感染轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬尾部成纖維細(xì)胞2、試驗(yàn)過程取克隆豬尾，分離成纖維細(xì)胞后感染表達(dá)Cre的重組腺病毒，提取細(xì)胞RNA，用綠色熒光蛋白的引物做RT-PCR。3、試驗(yàn)結(jié)果在804bp處有目的條帶的出現(xiàn)，證明，Cre重組酶切除loxP錨定的終止子后，綠色熒光蛋白得以轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。(如圖|5)本發(fā)明的積極效果在于目前由于豬核移植的技術(shù)不成熟，人類疾病的模型主要是轉(zhuǎn)基因鼠，但是鼠血液動(dòng)力學(xué)與組織大小及相應(yīng)的生理特點(diǎn)與人類相差較大，不能很好的復(fù)制人類疾病。目前所建立的在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶活性的報(bào)告動(dòng)物也僅僅限于鼠，未見有其他轉(zhuǎn)基因報(bào)告動(dòng)物報(bào)道。本發(fā)明利用體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建了監(jiān)測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，為人類疾病模型發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。圖1pICE-STOP載體構(gòu)建示意圖、圖2為克隆豬照片；圖3PCR鑒定目的基因的整合圖4Cre重組酶切除st叩序列以后，綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；圖5RT-PCR分析綠色熒光蛋白的表達(dá)；具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1Insulator,CMV啟動(dòng)子，綠色熒光蛋白基因的擴(kuò)增以PCI-Neo為模板，加入引物Cl、C2通過PCR循環(huán)擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子，全長(zhǎng)序列1022bp以PBC-1為模板，加入引物II、12通過PCR循環(huán)擴(kuò)增insulator,全長(zhǎng)2450bp以pEGFP-Cl為模板，加入引物E1、E2通過PCR循環(huán)擴(kuò)增eGFP基因，全長(zhǎng)序列8()4bp.將所擴(kuò)增的序列連接在PMD-18T-Simple(takara公司)，并委托北京天根公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的片段酶切后，分別連入ST0P-eGFP-R0SA26TV載體，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序正確以后，命名為pICE-STOP，擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用天根公司的大提質(zhì)粒試劑盒大提質(zhì)粒之后，用NheI單酶切線性化，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。載體構(gòu)建示意圖如圖l實(shí)施例2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選采用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA的胚胎成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，操作歩驟。按lipofectin2000(Invitrogen)說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前一天將原代培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞用無抗生素的培養(yǎng)液復(fù)蘇至60mm平皿中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到7080%融合時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化l:21傳代。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，加入G418選擇培養(yǎng)基(濃度為300yg/ml)。待有細(xì)胞單個(gè)克隆集落出現(xiàn)時(shí)，去掉培養(yǎng)液，用39。C的PBS洗1遍，將自制的玻璃細(xì)胞克隆環(huán)套在細(xì)胞集落上，加適量的胰酶于克隆環(huán)內(nèi)，消化約1分鐘后，加入篩選培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用移液器小心吹打細(xì)胞后轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿以后，轉(zhuǎn)入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿以后，一部分細(xì)胞用于細(xì)胞鑒定，一部分細(xì)胞凍存。實(shí)施例3細(xì)胞水平的鑒定-1、PCR檢測(cè)以獲得的neo基因陽性細(xì)胞基因組為模板，利用引物C1和E2擴(kuò)增，所擴(kuò)增序列包括CMV啟動(dòng)子，Loxp-neo-stop-Loxp序列，EGFP基因。證明目的基因完全整合入7豬胚胎成纖維細(xì)胞的基因組中。2、熒光觀察為了驗(yàn)證所構(gòu)建的條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的報(bào)告細(xì)胞系是否可以有效的監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，將所篩選出的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)以后，感染表達(dá)Cre重組酶的腺病毒，以驗(yàn)證所構(gòu)建報(bào)告細(xì)胞系的有效性。3、RT-PCR所獲得的細(xì)胞克隆感染腺病毒三天后，提取細(xì)胞總的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，進(jìn)一步鑒定綠色熒光蛋白的表達(dá)。4、細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞克隆感染表達(dá)Cre腺病毒72小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞流式的檢測(cè)。進(jìn)一歩鑒定綠色熒光蛋白的表達(dá)5整合位點(diǎn)的鑒定提取細(xì)胞基因組，采用hightailPCR(high-efficiencythermalasy畫etricinterlacedPCR)的方法進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)如下表表2hightailPCR引物設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收以后，連接到PMD-18T上，通過轉(zhuǎn)化，獲得重組菌后，送北京天跟公司測(cè)序。待序列測(cè)序完畢在NCBI上，與豬的基因組和所構(gòu)建的載體序列進(jìn)行比較分析。找出測(cè)序結(jié)果中含有一部分載體序列并含有一部分豬的基因組的序列，從而分析所構(gòu)建載體整合到豬基因組的位置。實(shí)施例4采用體細(xì)胞核移植技術(shù)，構(gòu)建條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬。具體步驟如下1、豬卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)及去核操作從屠宰場(chǎng)收集豬的卵巢，置于25-37'C含有雙抗生理鹽水的保溫瓶中，在2小時(shí)內(nèi)返回實(shí)驗(yàn)室。用37t:含雙抗的生理鹽水洗滌數(shù)次，將卵巢置于37'C水浴鍋中。用帶有18號(hào)針頭的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在實(shí)體顯微鏡下用撿卵針挑選出細(xì)胞質(zhì)均勻的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘細(xì)胞，準(zhǔn)備核移植。2、供體細(xì)胞的制備將所構(gòu)建的條件性表達(dá)綠色熒光蛋白的豬胚胎成纖維細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇后的細(xì)胞完全匯合后用于核移植操作。在進(jìn)行核移植操作前，將供體細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行消化吹打制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝到1.5ml的離心管中，用含10%血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g離心10分鐘，重選在0.5ml的DPBS中，備用。放入fC冰箱內(nèi)備用。進(jìn)行核移植操作前20min將細(xì)胞從冰箱中取出放入38.5'C培養(yǎng)箱中溫?zé)?。用時(shí)用移液槍吸取離心管底部10ul的細(xì)胞懸液加入己經(jīng)做好的操作滴內(nèi)，覆蓋上石蠟油。4、卵母細(xì)胞的注核操作在顯微操作臺(tái)上的培養(yǎng)皿中的中間的滴內(nèi)放去核的卵母細(xì)胞，每次放10-15個(gè)，另外幾個(gè)放入供體細(xì)胞。首先用內(nèi)徑為10-15um的注核針吸取小而圓的供體細(xì)胞，然后移動(dòng)操作臺(tái)使卵母細(xì)胞處在視野下面，用固定針固定卵母細(xì)胞，用注核針撥動(dòng)卵母細(xì)胞，找到去核時(shí)在透明帶留下的針口，將注射針插入到透明帶下，將供體細(xì)胞注入卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，構(gòu)成一個(gè)卵一供體細(xì)胞復(fù)合體，而后緩慢抽出注核針，并對(duì)透明帶進(jìn)行整理，使體細(xì)胞與卵母細(xì)胞膜相互接觸，便于隨后重組胚的融合。5、融合將操作完畢的重構(gòu)復(fù)合體移入融合液，洗滌三次，然后移入融合槽中，使去核卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞的接觸面與電流方向垂直，然后進(jìn)行電擊。.激活后的復(fù)合體迅速移入NCSU-23培養(yǎng)液中洗滌3-5次。然后放置入培養(yǎng)箱中，38.5°C，5%C02，100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、激活和胚胎培養(yǎng)卵-供體細(xì)胞復(fù)合體在15iiMcalciumionomycin(Calbiochem，SanDiego,CA)中孵育20分鐘，然后放入含1.9mM6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的CR2培養(yǎng)基中孵育3-4小時(shí)，然后在含有TL-服PES的35mm的培養(yǎng)皿中洗一遍之后，在含有放置含有3mg/mlBSA的CR2的培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)，孵育過后，轉(zhuǎn)移到含O.4。/。BSA的NCSU23的培養(yǎng)集中繼續(xù)孵育24小時(shí)，之后培養(yǎng)，采用含1(F。的NCSU23的培養(yǎng)基培養(yǎng)。7、胚胎移植選擇發(fā)情合適的母豬，進(jìn)行麻醉以后。用清水清洗手術(shù)部位及四周，消毒后蓋上創(chuàng)巾布并暴露手術(shù)部位，用手探入腹腔，尋找到子宮和卵巢，固定輸卵管，將裝有胚胎的外徑為2，im的玻璃管慢慢從輸卵管口插入，經(jīng)過1~2個(gè)彎曲之后小心將胚胎吹入輸卵管內(nèi)，并慢慢撤出玻璃管，在移植過程中只對(duì)一側(cè)輸卵管進(jìn)行胚胎移植。將輸卵管傘重新包住卵巢，回復(fù)子宮和輸卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常規(guī)縫合腹腔，術(shù)后將受體母豬單獨(dú)隔離，連續(xù)4天使用抗生素消炎。每天仔細(xì)觀察記錄受體豬的生理情況，做好發(fā)情觀察。8、試驗(yàn)結(jié)果在2009年1月3R，杜洛克(紅毛)懷孕116天，順利產(chǎn)下11頭黑色中國(guó)小型實(shí)驗(yàn)豬。其中三頭為木乃伊胎，一頭為死胎，其余7頭表型正常、健康。平均體重為0.862kg.平均體重為:1.212kg。結(jié)果如圖2:a:從左到右依次為死胎、三木乃伊胎。b，c:均為克隆中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬；d:母豬杜洛克(紅毛)小豬中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬(黑色)結(jié)論本發(fā)明掌握了克隆豬的制備技術(shù)，成功制備了監(jiān)測(cè)Cre重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬。實(shí)施例5克隆豬的鑒定1、PCR鑒定提取臍帶的基因組，將臍帶剪下以后，用含雙抗的PBS清洗數(shù)遍，洗去血污及贓物。然后利用TIANampGenomicDNAKit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)目錄號(hào)DP304提取基因組。所提取的基因組用于PCR反應(yīng)，引物為綠色熒光蛋白的上下游引物。通過PCR循環(huán)擴(kuò)增eGFP基因，全長(zhǎng)序列804bp.作為陽性對(duì)照，同時(shí)，以非轉(zhuǎn)基因的基因組和水為陰性對(duì)照。2、感染表達(dá)Cre重組酶的腺病毒實(shí)驗(yàn)為了監(jiān)測(cè)所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因克隆豬是否可以有效的監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，將分離出的尾部成纖維細(xì)胞，以MOI值為800的量，感染Cre-Ad，并以非轉(zhuǎn)基因豬的成纖維細(xì)胞作為對(duì)照，感染72小時(shí)以后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況10將感染Cre-Ad的轉(zhuǎn)基因豬的尾部成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞總的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，進(jìn)一步鑒定綠色熒光蛋白的表達(dá)。提取RNA和RT-PCR反應(yīng)均采用BioerTechnology的SimplyP總RNA提取試劑盒提取試劑盒和一步法RT-PCR反應(yīng)試劑盒。RT-PCR反應(yīng)的引物為綠色熒光蛋白的上游和下游引物El.5，-GGCGCGCCCGCCACCATGGTGAGCAAG;E2.5'-GGCGCGCCTTATCTAGATCCGGTGGAT.利用綠色熒光蛋白的引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，同時(shí)以感染對(duì)照病毒的細(xì)胞克隆作為陰性對(duì)照同時(shí)設(shè)立不加模板只加水的陰性對(duì)照，以載體pICE-STOP為模板，利用綠色熒光蛋白引物所擴(kuò)序列作為陽性對(duì)照。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)Cre位點(diǎn)特異重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬，其特征在于該轉(zhuǎn)基因豬含兩個(gè)LoxP錨定一個(gè)neo基因和終止子，后接綠色熒光蛋白基因，綠色熒光蛋白基因由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的條件性表達(dá)載體。2、權(quán)利要求1所述豬的培養(yǎng)方法，包括以下步驟采用基因工程的方法構(gòu)建LoxP位點(diǎn)錨定終止子，后接報(bào)告基因的打靶載體，當(dāng)Cre重組酶存在的情況下，將Loxp卯定的終止子刪除，使后接的報(bào)告基因得以表達(dá)，從而用于監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性；通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選技術(shù)篩選出可以特異性檢測(cè)Cre活性的成纖維細(xì)胞；利用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行克隆豬。3、權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于打靶載體pICE-STOP:以PCI-Neo為模板，通過PCR循環(huán)擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子；以PBC-1為模板，通過PCR循環(huán)擴(kuò)增絕緣子(insulator);以pEGFP-Cl為模板通過PCR循環(huán)擴(kuò)增eGFP基因；將所擴(kuò)增的片段酶切回收后，分別連入STOP-eGFP-R0SA26TV載體。全文摘要本發(fā)明提供一種檢測(cè)Cre位點(diǎn)特異重組酶活性的轉(zhuǎn)基因報(bào)告豬及培養(yǎng)方法，采用基因工程的方法構(gòu)建LoxP位點(diǎn)錨定終止子，后接報(bào)告基因的打靶載體，當(dāng)Cre重組酶存在的情況下，將Loxp錨定的終止子刪除，使后接的報(bào)告基因得以表達(dá)，從而用于監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性；通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選技術(shù)篩選出可以特異性檢測(cè)Cre活性的成纖維細(xì)胞；利用體核移植技術(shù)進(jìn)行克隆豬。用于在體內(nèi)監(jiān)測(cè)Cre重組酶的活性，為建立人類疾病模型提供了監(jiān)測(cè)工具，解決了目前轉(zhuǎn)基因克隆豬的技術(shù)不成熟，克隆效率較低問題。文檔編號(hào)C12N15/06GK101550427SQ20091006659公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年2月28日優(yōu)先權(quán)日2009年2月28日發(fā)明者任林柱,張明軍,莉李,李占軍,歐陽紅生,王鐵東,賴良學(xué),逄大欣,陳立梅申請(qǐng)人:吉林大學(xué)