專利名稱::牛capn1基因作為背最長肌嫩度分子標(biāo)記的鑒定方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于動物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及牛背最長肌嫩度相關(guān)基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
:有實(shí)驗(yàn)證明(WickM等,JBiolChem,1999,279:1567—1582),肌原纖維中主要蛋白的降解是肉品嫩度提高的根本原因,特別是Z盤的降解弱化,肌原纖維間聯(lián)結(jié)蛋白(結(jié)蛋白和聯(lián)結(jié)蛋白)、肌原纖維內(nèi)聯(lián)結(jié)蛋白(肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白和肌f5蛋白-T)的降解造成肌原纖維片斷化,構(gòu)成肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性的這些蛋白質(zhì)的降解是嫩化成熟的主要原因。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)(KoomaraieM,#eat&/,1993,32:93-104),鈣蛋白酶體系是導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、嫩度提高的關(guān)鍵酶。廖洪波等(廖洪波等,鈣蛋白酶和肉的成熟嫩化.肉類工業(yè).2003.8:27-29)認(rèn)為,在宰后成熟的過程中鈣蛋白酶("/W7)的活性顯著下降。"/W/活性下降,則是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)。PringleT.D等(PringleTD等,Calciumactivatedtenderizationofstriploin,topsirtoin,andtopsirloin,andtoproundsteaksindiversegenotypesofcattle.JTAnimSci,1999,77:3230-3237)用Angus和Brahman及其雜交牛為對象進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)^/W7的活性與嫩度具有相關(guān)性。Page等(PageBT等,Evaluationofsingle-nucleotidepolymorphismsinCAPNlforassociationwithmeat,tendernessincattle.JAnimSci,2002,80(12):3077-3085)利用皮埃蒙特和安格斯牛的雜交后代種群作為研究對象,對^/W7基因進(jìn)行SNP分析時(shí)發(fā)現(xiàn),此基因中存在38個(gè)SNP位點(diǎn),其中2個(gè)位點(diǎn)與肉的嫩度相關(guān)性極大,說明CAPN1基因序列的差異可能是產(chǎn)生同一物種相同肌肉間嫩度差異的主要原因。蔡欣等(蔡欣等,應(yīng)用Nested和Touchdownper技術(shù)分離牦牛CAPN1大亞基基因EST.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2005.33(2)14-18)應(yīng)用Nested和TouchdownPCR技術(shù)分離牦牛6M月V2大亞基基因EST。分離到的牦牛C^W/基因EST序列與其他哺乳類對應(yīng)序列具有較高的同源性,與奶牛、綿羊和豬的同源性分別為98%,96%和93%,與人和食蟹猴的同源性均為89%,該序列與偶蹄目動物對應(yīng)序列的同源性較靈長類動物的高,可能在進(jìn)化過程中更為保守。牦牛"/WJ部分編碼序列的分離與分析為牦牛a/Wi基因的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。在今后的工作中,利用已獲得的EST序列,可以克隆牦牛C4/W/基因全長序列,進(jìn)而進(jìn)行此基因與牛肉嫩度相關(guān)性方面的分子遺傳標(biāo)記研究。朱燕等(朱燕等,中國黃牛背最長肌中C4月WmRNA表達(dá)與嫩度的關(guān)系.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006.29(2):89-93)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了中國黃牛背最長肌中CAPN1mRNA表達(dá)與嫩度的關(guān)系。結(jié)果表明,^尸7V7raRNA表達(dá)量與宰后第3天的牛肉嫩度高度相關(guān)(^=0.1855)。酪蛋白底物酶原分析表明,不同肌肉的CAPN1潛在酶活性存在很大差異。^/W7mRNA的表達(dá)可能是影響牛肉嫩度的主要因素。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)C^7W產(chǎn)生的降解條帶有一定的差別。表明C4/W/在不同黃牛個(gè)體中蛋白水平的表達(dá)也存在差異,從另一方面也證實(shí)了肉的嫩化主要酶可能是
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆牛背最長肌嫩度相關(guān)基因^PT^基因片段,尋找C4/^7基因的突變位點(diǎn)以及作為牛背最長肌嫩度相關(guān)基因的多態(tài)性檢測方法,為牛標(biāo)記輔助育種提供一種有用的分子標(biāo)記。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種牛背最長肌嫩度相關(guān)基因"/W7的一部分DNA序列如表SEQIDN0:1所示。PCR擴(kuò)增G4尸A7基因的目的片段全長為520bp,其序列如SEQIDNO:1所示。所獲得C4/W/基因片段的DNA下列中有如表SEQIDNO:1所述的A166-G166的堿基突變,導(dǎo)致尸wi"-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)多態(tài)性的產(chǎn)生。一種篩選適用與牛背最長肌嫩度的分子標(biāo)記的方法,按照以下步驟制備利用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術(shù)信息中心)中牛a/^/基因DNA序列為參照,設(shè)計(jì)特異性引物一對,正向弓|物CAPN1E14F:5、-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3'和反向引物CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3、。從牛血液中提取基因組DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的純化和克隆測序。由于PCR產(chǎn)物片段的DNA序列第166位存在A-G的堿基突變,導(dǎo)致RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生,利用限制性內(nèi)切酶可進(jìn)行此突變位點(diǎn)的檢測。將檢測結(jié)果所示的不同基因型與牛背最長肌嫩度關(guān)聯(lián)分析,從而為牛的標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記及其應(yīng)用。以下對本發(fā)明作詳細(xì)的描述5一、牛背最長肌嫩度相關(guān)基因a/W7基因片段的克隆1.引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)利用NCBI中的牛C4/W7基因DNA序列(登錄號AF252504S2)為模板,利用生物學(xué)軟件01igo6.0設(shè)計(jì)一對特異性引物。建立PCR反應(yīng)條件,具體情況如下CAPN1E14F:5'-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3'(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAMT-3、(反向引物)PCR反應(yīng)體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術(shù)公司,濃度為2.5mM)0.8ul,正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/u1)各0.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司,濃度為2.5U/u1)0.4yl,基因組DNA0.5ul(含10-30ngDNA),四餾水24.5u1。PCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5分鐘,94'C變性40秒,6CTC退火40秒,72'C延伸40秒,共35'個(gè)循環(huán),72'C最后延伸5分鐘。2.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序(1)PCR產(chǎn)物的純化在本發(fā)明中,為達(dá)到高速、高校的回收效果,使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司,操作過程中所需的所有液體均由試劑盒內(nèi)提供)進(jìn)行凝膠的純化和回收,按照該試劑盒說明書操作,步驟如下在紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的膠塊,放入1.5mlEpendorff管中,并按100mg膠塊400ul計(jì)算出膠塊體積;加入已切下的膠塊體積的3倍量的BufferDE-A,混合均勻后于75。C加熱至膠塊完全熔化成液體;加入己切下的膠塊體積的0.5倍量的BufferDE-B,混合均勻;將所有液體轉(zhuǎn)移至已經(jīng)嵌入2ml離心管的DNA制備管中(2ml離心管和DNA制備管中均由試劑盒內(nèi)提供),12000g離心l分鐘;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入500ulBufferWl,12000g離心30秒;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入70。ulBufferW2,12000g離心30秒;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入700ii1BufferW2,12000g離心l分鐘;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,12000g離心1分鐘;將制備管放入一個(gè)新的1.5mlEpendorff管中,在制備膜中央加入25u1Eluent溶液,靜置1分鐘,12000g離心1分鐘洗脫回收PCR產(chǎn)物。(2)連接為保證良好的連接效果,本發(fā)明將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自Takara公司)進(jìn)行連接,反應(yīng)總體系為10u1,其中包括1ulpMD18-T載體,3ulPCR產(chǎn)物,lul四餾水,5ulSolutionI,16。C連接12小時(shí)。(3)轉(zhuǎn)化并測序在無菌條件下,取150ul感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中,加入連接產(chǎn)物并混合均勻,在冰水混合物中放置30分鐘后放入42。C水浴中90秒,取出后再放入冰水混合物中5分鐘,加入400y1無AMP(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基,37。C震蕩l小時(shí),取100ul均勻涂布于含AMP的LB固體培養(yǎng)基上,37X:平放1小時(shí)帶菌液全部被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑取單克隆,經(jīng)鑒定為陽性的送交測序公司進(jìn)行測序。二、RLFP診斷方法的建立用引物CAPN1E14F和CAPN1E1犯擴(kuò)增牛基因組DNA得到520bp的特異擴(kuò)增片段(SEQIDN0:1)。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),在該520bp片段中,由于第166bp處存在A—G的突變,從而導(dǎo)致/^w/酶切位點(diǎn)(R*GATCY)的產(chǎn)生,其中,164-165bp間為尸577/酶的多態(tài)性切點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)尸sw/酶切產(chǎn)生三種基因型,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可明顯判別不同帶型。其中AA型只有520bp—條帶,AG型含有520bp,165bp,355bp三條帶,GG型有165bp和355bp兩條帶(圖2)。三、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用申請人與吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司合作的實(shí)驗(yàn)群體為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析,利用SPSS12.0軟件,建立如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)分析模型為Yi二u+Gj+ei。其中,Y,為被觀測個(gè)體的生產(chǎn)性能表型值,"為生產(chǎn)性能的最小二乘均值,Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值,ei為對應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差。本發(fā)明的效果是如下1、牛^/^7基因部分DNA序列的克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物,如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收測序,結(jié)果顯示產(chǎn)物長度為520bp。測序結(jié)果顯示該片段166bp處存在A、G兩個(gè)等位基因,部分測序峰圖如圖3所示。2、針對牛6M/W/基因部分DNA片段PCR-RFLP診斷方法的建立用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增牛基因組DNA得到的520bp特異擴(kuò)增片段。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該520bp片段存在Ps"/酶切位點(diǎn)(R*GATCY),其中第164-165bp處為酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶尸sw/酶切可產(chǎn)生三種基因型,即AA型、AG型和GG型,具體圖片如圖2所示。3、對標(biāo)記性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析本發(fā)明中牛CAPN1基因的擴(kuò)增序列Psul-RFLP多態(tài)位點(diǎn)與牛背最長肌嫩度的關(guān)聯(lián)分析,基因型檢測結(jié)果表明,在138個(gè)體中,AA型個(gè)體有44個(gè),AG型個(gè)體有64個(gè),GG型個(gè)體有30個(gè)。不同基因型個(gè)體的背最長肌剪切力(通過測量剪切力,可評價(jià)肉的嫩度。剪切力值高,嫩度低;剪切力值低,嫩度高)之間顯著差異分析結(jié)果(最小二乘值和標(biāo)準(zhǔn)誤)見表l。表l不同基因型個(gè)體剪切力之間顯著差異分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中最小二乘均值土標(biāo)準(zhǔn)誤肩標(biāo)帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)分析結(jié)果表明,此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個(gè)體的背最長肌剪切力存在極顯著的差異,AA型個(gè)體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P<0.01),AG型個(gè)體極顯著低于GG型(P〈O.OD,A等位基因是有利于牛背最長肌嫩度的有利標(biāo)記。圖1是CAPN1基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,1-9泳道為被檢測的9個(gè)PCR產(chǎn)物。圖2是2%瓊脂糖凝膠電泳檢測Q/W7基因擴(kuò)增產(chǎn)物的/^z/J酶切結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。圖3是本發(fā)明擴(kuò)增的C4/W7基因部分DNA序列中突變位置的克隆測序峰圖。圖4是實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-6為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖5是實(shí)施例1中酶切反應(yīng)產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-6為被檢測的酶切產(chǎn)物。圖6是實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道卜IO為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖7是實(shí)施例2中酶切反應(yīng)產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-10為被檢測的酶切產(chǎn)物。圖8是實(shí)施例3中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-9為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖9是實(shí)施例3中酶切反應(yīng)產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-9為被檢測的酶切產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明,用具體實(shí)施方式詳細(xì)描述具體內(nèi)容。本發(fā)明利用已公布的C^W7基因序列和提取的?;蚪MDNA,設(shè)計(jì)特異性引物一對,克隆包括全部第14外顯子的部分DNA序列,利用PCR-RFLP方法,使用限制性內(nèi)切酶尸si/J對PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切。將酶切結(jié)果分型并將不同基因型與背最長肌剪切力關(guān)聯(lián),為牛的標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記。一、牛C4/W2基因部分DNA片段的克隆1引物設(shè)計(jì)以牛CJ/WJ基因DNA序列為參照,NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術(shù)信息中心)收錄號為AF252504S2,利用01igo6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物1對,為保證良好的引物質(zhì)量,在本發(fā)明中,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為520bp,引物序列如下所示CAPN1E14F:5、-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3、(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAMT-3、(反向引物)PCR反應(yīng)體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術(shù)公司,濃度為2.5mM)0.8ul,正向引物與反向引物(濃度為均為lOpraol/lil)各0.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司,濃度為2.5U/u1)0.4ixl,基因組DNA0.5ul(含10-30ngDNA),四餾水24.5u1。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘,94'C變性40秒,6(TC退火40秒,72"C延伸40秒,共35個(gè)循環(huán),72"C最后延伸5分鐘。2.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序(l)PCR產(chǎn)物的純化在本發(fā)明中,為達(dá)到高速、高校的回收效果,使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司,操作過程中所需的所有液體均由試劑盒內(nèi)提供)進(jìn)行凝膠的純化和回收,按照該試劑盒說明書操作,具體步驟如下在紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的膠塊,并稱取膠塊質(zhì)量,然后放入1.5mlEpendorff管中,按100mg膠塊=100u1計(jì)算出膠塊體積;加入已切下的膠塊體積的3倍量的BufferDE-A,混合均勻后于75。C加熱至膠塊完全熔化成液體;加入已切下的膠塊體積的O.5倍量的BufferDE-B,混合均勻;將所有液體轉(zhuǎn)移至已經(jīng)嵌入2ml離心管的DNA制備管中(2ml離心管和DNA制備管由試劑盒內(nèi)提供),12000g離心l分鐘;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入500ix1BufferWl,12000g離心30秒;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入700p1BufferW2,12000g離心30秒;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,加入700u1BufferW2,12000g離心1分鐘;棄去濾液,將制備管重新放回2ml離心管中,12000g離心l分鐘;將制備管放入一個(gè)新的1.5mlEpendorff管中,在制備膜中央加入25U1Eluent溶液,靜置1分鐘,12000g離心1分鐘洗脫回收PCR產(chǎn)物。(2)連接為保證良好的連接效果,本發(fā)明將回收的PCR產(chǎn)物用pMD18-T載體試劑盒(購自Takara公司)進(jìn)行連接,反應(yīng)總體系為10ul,其中包括1.0ylpMD18-T載體,3.0ulPCR產(chǎn)物,l.Oul四餾水,5.0ylSolution工,16'C連接12小時(shí)。(3)轉(zhuǎn)化在無菌條件下,取150yl感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中,加入已連接12小時(shí)的連接產(chǎn)物并混合均勻,在冰水混合物中放置30分鐘后放入42'C水浴中90秒,取出后再放入冰水混合物中5分鐘,加入400yl無AMP(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基,37r震蕩l小時(shí),取100ul均勻涂布于含AMP的LB固體培養(yǎng)基上,37t:平放l小時(shí)后,待菌液全部被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后挑取單克隆,經(jīng)鑒定為陽性的送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。二、PCR-RFLP方法的建立1、PCR產(chǎn)物的檢測用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物CAPN1E14F和CAPN1R14R對?;蚪MDNA擴(kuò)增得到5'20bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物,見圖1,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,1_9泳道為被檢測的9個(gè)PCR產(chǎn)物。2、針對牛C4尸7W基因部分DNA片段PCR-RFLP診斷方法的建立用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增?;蚪MDNA得到的520bp特異擴(kuò)增片段。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該520bp片段存在尸^/酶切位點(diǎn)(R*GATCY),其中第164-165bp處為酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶/^//酶切可產(chǎn)生三種基因型,即AA型、AG型和GG型,具體圖片如圖2所示。限制性內(nèi)切酶/^;/可自行選擇。本發(fā)明中為達(dá)到高效、高速的效果,選用BioBasicInc.(BBI公司)的尸sw/內(nèi)切酶。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系為15y1,其中10XBufferW[由內(nèi)切酶包裝盒中提供,含lOmMTris-HC1(PH8.0),10mMMgCl2,lOOmMNaCl,IraMDTT]1.5u1,PCR產(chǎn)物5u1,限制性內(nèi)切酶1.0y1(總量10U),四餾水7.5u1,將樣品混合均勻后37'C恒溫水浴5小時(shí)。恒溫水浴結(jié)束后,取8ul酶切產(chǎn)物,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果,記錄基因型檢測結(jié)果。由于PCR產(chǎn)物片段的DNA序列中存在A-G的堿基突變,導(dǎo)致尸犯J-RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生,利用限制性內(nèi)切酶尸^/可進(jìn)行此突變位點(diǎn)的檢測。用引物CAPN1E14F和CAPN1E14R擴(kuò)增牛基因組DNA得到520bp的特異擴(kuò)增片段(圖l)。164-165bp間為戶幼/酶的多態(tài)性切點(diǎn)(R*GATCY)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)尸sy/酶切產(chǎn)生三種基因型,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可明顯判別不同帶型。其中AA型只有520bp—條帶,AG型含有520bp,165bp,355bp三條帶,GG型有165bp和355bp兩條帶(圖2)。三、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用申請人與吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司合作的實(shí)驗(yàn)群13體為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析,利用SPSS12.0軟件,建立如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)分析模型為Y^y+Gj+ei。其中,Yi為被觀測個(gè)體的生產(chǎn)性能表型值,n為生產(chǎn)性能的最小二乘均值,Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值,^為對應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差。本發(fā)明中牛CAPN1基因的擴(kuò)增序列PsuI-RFLP多態(tài)位點(diǎn)與牛背最長肌嫩度的關(guān)聯(lián)分析,基因型檢測結(jié)果表明,在138個(gè)體中,AA型個(gè)體有44個(gè),AG型個(gè)體有64個(gè),GG型個(gè)體有30個(gè)。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結(jié)果(最小二乘值和標(biāo)準(zhǔn)誤)見表2。分析結(jié)果表明,此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個(gè)體,其背最長肌剪切力存在極顯著的差異,AA型個(gè)體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01),AG型個(gè)體極顯著低于GG型(P<0.01),A等位基因是有利于牛背最長肌嫩度的有利標(biāo)記。表2不同基因型個(gè)體剪切力之間顯著差異分析結(jié)果基因型個(gè)體數(shù)最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤AA444.1764548±0.08242402AAG644.7370381±0.11381620BGG305.5096146±0.24605115e注表中最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤肩標(biāo)帶有不同字母表示差異極顯著(P〈0.01)實(shí)施例1在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司的肉牛群體中隨機(jī)選定六個(gè)待屠宰個(gè)體,在屠宰時(shí)采集血液進(jìn)行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定,濃度為36.54ug/ml,0D260/0D280Ratio為1.824。利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物、PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)14行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術(shù)公司,濃度為2.5mM)0.8nl,正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/ul)各O.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司,濃度為2.5U/ul)0.4ul,基因組DNA0.5ul(含18.27ngDNA),四餾水24.5u1。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘,94。C變性40秒,6(TC退火40秒,72'C延伸40秒,共35個(gè)循環(huán),72'C最后延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖4所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-6為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計(jì)的RFLP方法進(jìn)行酶切反應(yīng)。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系為15u1,其中10XBuffer1.5lU,PCR產(chǎn)物5u1,限制性內(nèi)切酶A"/1.0y1(10U/"l),四餾水7.5til。將樣品混合均勻后,37'C恒溫水浴5小時(shí)。為提高酶切反應(yīng)效率,可每隔1小時(shí)將反應(yīng)管取出,將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應(yīng)結(jié)束后,取5ul酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果,具體基因型如圖5所示。如圖5所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1_6為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定,個(gè)體l、4屬于AG型,個(gè)體2、3屬于GG型,個(gè)體5-6屬于AA型。此六個(gè)個(gè)體的背最長肌剪切力見表3。表3實(shí)施例1中抽取的個(gè)體性狀測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以此六個(gè)屠宰個(gè)體為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析,利用SPSS12.0軟件,建立如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)分析模型為Y產(chǎn)U+Gj+^。其中,Yi為被觀測個(gè)體的生產(chǎn)性能表型值,"為生產(chǎn)性能的最小二乘均值,Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值,ei為對應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差?;蛐蜋z測結(jié)果表明,在此六頭個(gè)體中,M型個(gè)體有2個(gè),AG型個(gè)體有2個(gè),GG型個(gè)體有2個(gè)。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結(jié)果(最小二乘值和標(biāo)準(zhǔn)誤)見表4。分析結(jié)果表明,此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個(gè)體,其背最長肌剪切力存在極顯著的差異,AA型個(gè)體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P<0.01),AG型個(gè)體極顯著低于GG型(P<0.01)。表4不同基因型個(gè)體剪切力之間顯著差異分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注表中最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤肩標(biāo)帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司的肉牛群體中隨機(jī)選定十個(gè)待屠宰個(gè)體,在屠宰時(shí)采集血液進(jìn)行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定,濃度為34.54ug/ml,OD260/OD280Ratio為1.794。利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物、PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術(shù)公司,濃度為2.5mM)0.8ul,正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/ul)各0.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司,濃度為2.5U/nl)0.4nl,基因組DNA0.5u1(含17.27ngDNA),四餾水24.5u1。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘,94。C變性40秒,60。C退火40秒,72。C延伸40秒,共35個(gè)循環(huán),72"最后延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖6所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計(jì)的RFLP方法進(jìn)行酶切反應(yīng)。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系為15Pl,其中10XBufferl.5u1,PCR產(chǎn)物5ti1,限制性內(nèi)切酶尸犯/1.0u1(10U/y1),四餾水7.5ul。將樣品混合均勻后,37r恒溫水浴5小時(shí)。為提高酶切反應(yīng)效率,可每隔1小時(shí)將反應(yīng)管取出,將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應(yīng)結(jié)束后,取5ul酶切產(chǎn)物用2。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果,具體基因型如圖7所示。如圖7所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-IO為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定,個(gè)體l、4屬于GG型,個(gè)體2、3、6、IO屬于AA型,個(gè)體5、7、8、9屬于AG型。此十個(gè)個(gè)體的背最長肌剪切力見表5。17表5實(shí)施例2中抽取的個(gè)體性狀測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>以此十個(gè)屠宰個(gè)體為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析,利用SPSS12.0軟件,建立如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)分析模型為Y^n+Gj+ei。其中,Y為被觀測個(gè)體的生產(chǎn)性能表型值,u為生產(chǎn)性能的最小二乘均值,Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值,ei為對應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差?;蛐蜋z測結(jié)果表明,在此十頭個(gè)體中,AA型個(gè)體有4個(gè),AG型個(gè)體有4個(gè),GG型個(gè)體有2個(gè)。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結(jié)果(最小二乘值和標(biāo)準(zhǔn)誤)見表6。分析結(jié)果表明,此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個(gè)體,其背最長肌剪切力存在極顯著的差異,AA型個(gè)體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01),AG型個(gè)體極顯著低于GG型(P〈0.01)。表6不同基因型個(gè)體剪切力之間顯著差異分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注表中最小:二乘均值土標(biāo)準(zhǔn)誤肩標(biāo)帶有^F同字母表示差異極顯著(P<0.01)實(shí)施例3在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司的肉牛群體中隨機(jī)選定九個(gè)待屠宰個(gè)體,在屠宰時(shí)采集血液進(jìn)行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定,濃度為37.34ug/ml,0D260/0D280Ratio為1.803。利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物、PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0wl,dNTPs(購自北京鼎國生物技術(shù)公司,濃度為2.5raM)0.8ul,正向引物與反向引物(濃度為均為1Opmol/Pl)各0.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司,濃度為2.5U/ul)0.4ul,基因組DNA0.5ul(含18.67ngDNA),四餾水24.51。PCR反應(yīng)條件為94r預(yù)變性5分鐘,94T:變性40秒,6(TC退火40秒,72'C延伸40秒,共35個(gè)循環(huán),72"C最后延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖8所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計(jì)的RFLP方法進(jìn)行酶切反應(yīng)。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系為15ix1,其中10XBufferl.5u1,PCR產(chǎn)物5ia,限制性內(nèi)切酶尸sw/1.0tU(10U/y1),四餾水7.5!xl。將樣品混合均勻后,37"C恒溫水浴5小時(shí)。為提高酶切反應(yīng)效率,可每隔1小時(shí)將反應(yīng)管取出,將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應(yīng)結(jié)束后,取5iil酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果,具體基因型如圖9所示。如圖9所示,其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,泳道1-10為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定,個(gè)體l、2、3屬于GG型,個(gè)體8、9屬于M型,個(gè)體4、5、6、7屬于AG型。此九個(gè)個(gè)體的背最長肌剪切力見表5。表7實(shí)施例2中抽取的個(gè)體性狀測量值屠宰個(gè)體編號品種基因型背最長肌剪切力1利木贊GG5.6832利木贊GG5.8123西門塔爾GG5.8344西門塔爾AG5.0385'中國草原紅牛AG4.7116夏洛萊AG5.0337夏洛萊AG4.7668中國草原紅牛AA3.8159利木贊AA4.336以此九個(gè)屠宰個(gè)體為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析,利用SPSS12.0軟件,建立如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)分析模型為Y產(chǎn)n+Gj+ei。其中,Yi為被觀測個(gè)體的生產(chǎn)性能表型值,U.為生產(chǎn)性能的最小二乘均值,Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值,ei為對應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差?;蛐蜋z測結(jié)果表明,在此十一頭個(gè)體中,AA型個(gè)體有2個(gè),AG型個(gè)體有4個(gè),GG型個(gè)體有3個(gè)。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結(jié)果(最小二乘值和標(biāo)準(zhǔn)誤)見表6。分析結(jié)果表明,此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個(gè)體,其背最長肌剪切力存在極顯著的差異,AA型個(gè)體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01),AG型個(gè)體極顯著低于GG型(P〈0.01)。表8不同基因型個(gè)體剪切力之間顯著差異分析結(jié)果基因型個(gè)體數(shù)最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤AA24.0755±0.26050AAG44.8870±0.04710BGG35.7763±0.08647e主表中最小二實(shí)匿均值土標(biāo)準(zhǔn)誤肩標(biāo)帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)21序列表〈110〉吉林大學(xué)<120〉牛CAPN1基因作為背最長肌嫩度分子標(biāo)記的鑒定方法及應(yīng)用<130〉〈160〉1<170>Patentlnversion3.3〈210〉<211>〈212〉〈213〉〈220〉<221>〈222〉1520DNABostaurusmutation(166)..(166)〈400〉1aaggtgactttgtgctgcgtttcttctcagagaagagcgcagggacccagtgagtagaaa60gccctcccctgtctccccctttcctcccaccacacccttgctgccccaacccccgttgac120tggcccctctctctccccaccctctgcagagagctggatgaccaggtccaggccaatctc180cccgacgaggtacgtgccctgcccccaccctgggtgcacgacggggacccgggtgtcctg240tgtcttggtctctagccagcaaggcagagcccctcctggcaggagccatacacatccctc300acttgccaagcactttacagtttgcaaaggactttgcgatcgatagtaatggcgcagggc360ccctgggttcttgctctctgcagggtctgtgctgagctgtttacctggatcacccggttt420cctccataacaaccgtgtcagggtgctgtcaccgtctctcctctcagagggaaactcagg480ttcagagaggttaaggaatttacccaaggtcacgcagcag5202權(quán)利要求1、一種牛背最長肌嫩度相關(guān)的CAPN1基因片段,它的DNA序列如SEQIDNO1所述。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列,其特征在于序列表SEQIDN0:1的第166bp處有一個(gè)A-G的堿基突變,導(dǎo)致/^//酶切多態(tài)性的產(chǎn)生。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的牛肉肉質(zhì)嫩度相關(guān)基因^/W/基因片段,所選用的特異性引物如下所示CAPN1E14F:5、-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3、(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3、(反向引物)4、權(quán)利要求1、2所述的牛背最長肌嫩度相關(guān)基因"/W2基因片段在牛分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求3所述的引物在牛分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域:
,是一種牛背最長肌嫩度相關(guān)基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。所獲得的CAPN1基因片段的核苷酸序列長度為520bp,包括全部第14外顯子。在此片段的第166bp處存在有一個(gè)A→G的堿基突變,導(dǎo)致PsuI-RFLP酶切多態(tài)性的產(chǎn)生。將此突變位點(diǎn)作為一個(gè)分子標(biāo)記,使用限制性內(nèi)切酶PsuI檢測此突變位點(diǎn),并可將檢測結(jié)果與牛背最長肌嫩度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。分析結(jié)果表明,不同基因型個(gè)體的背最長肌嫩度有極顯著的差異,從而為牛的選種選育提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的特點(diǎn)在于獲得與中牛背最長肌嫩度相關(guān)的CAPN1基因部分片段,并利用PCR-RFLP方法對該片段進(jìn)行多態(tài)性分析,為牛的標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記及其應(yīng)用。文檔編號C12N15/57GK101624598SQ20091006740公開日2010年1月13日申請日期2009年8月17日優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日發(fā)明者穎劉,昊姜,張嘉保,張金玉,戴立勝,秦立紅,趙志輝,陳承禎,馬騰壑,妍高申請人:吉林大學(xué)