專利名稱：：miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物發(fā)明
技術領域：
，涉及預測腫瘤放射敏感性的研究方法，更具體的說是miRNA在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用。
背景技術：
：肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮亦稱支氣管肺癌。肺癌一般指的是肺實質部的癌癥，通常不包含其他如肋膜起源的中胚層腫瘤(mesothelioma)，或者其他惡性腫瘤如類癌(carcinoid)、惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)，或是轉移自其他來源的腫瘤。因此我們所說的肺癌，是指來自于支氣管(bronchial)或細支氣管(bronchiolar)表皮細胞(epithelialcell)的惡性腫瘤，占了肺實質惡性腫瘤的90_95%。肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名，1995年全世界有60萬人死于肺癌，而且每年人數都在上升。而女性得到肺癌的發(fā)生率尤其有上升的趨勢。肺癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據全國腫瘤防治研究辦公室的報告，北京、上海、天津、哈爾濱等城市肺癌的發(fā)病率和死亡率為所有惡性腫瘤之首，占全部惡性腫瘤的20%-30%。臨床I期和II期肺癌手術治療5年生存率約為40%。放射治療是肺癌治療的主要手段，約70%的病人需接受放射治療。在肺癌的放射治療中，目前仍延續(xù)應用幾十年一貫的治療模式，2Gy/次，每周5次，總劑量60-70Gy/6-7周。而事實上不同個體對腫瘤的放射敏感性是存在差異的，在相同的治療劑量下，有的病人有效而有的病人則無效，有的病人可能出現嚴重的副作用。如果在治療前可預測病人對放射的敏感性，那么就可能擬訂即對腫瘤有最高療效又對正常組織損傷最低的放射劑量。然而，目前國內外還沒有可用于臨床預測放療敏感性的指標。隨著人類基因組計劃的完成和新技術的發(fā)展，設計針對個體更具合理的放療方案，是醫(yī)學發(fā)展的必然趨勢。因此，尋找與放療敏感性相關的一些生物標志物對改善和指導臨床腫瘤放射治療，增進療效和降低副作用具有重要的理論意義和實用價值。研究表明microRNA(miRNA)是一類小的(19_24nt)非編碼RNAs，負調控靶基因mRNAs的穩(wěn)定性或轉錄效率，在調節(jié)細胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化及代謝等方面發(fā)揮重要作用。目前已知541個人類microRNA，最近一項研究預測其數目可能達到1000個。一個microRNA能夠調節(jié)數百個下游基因，研究預測高達30%的人類基因受microRNA的調節(jié)，因此它們是基因組調節(jié)分子中最大的一個家族。人類microRNA的加工由Drosha和Dicer完成，其中Drosha在核中將Pri-microRNA加工成具有發(fā)卡結構的長約70nt的Pre-microRNA，然后運至胞漿中由Dicer進一步加工成22nt左右的成熟microRNA。近幾年的發(fā)現使microRNA成為分子腫瘤學研究的熱點之一。隨著microRNA表達譜研究的開始，許多研究工作逐漸將microRNA表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后聯系起來。microRNA與腫瘤相關的最早證據來自2002年Calin等的研究，他們發(fā)現大多數慢性淋巴細胞性白血病患者的miR_15a和miR-16-l表達降低或缺失。2004年，Tadamizawa等首次報道let-7micr0RNA在肺癌中表達下調。在143例肺癌病人中l(wèi)et_7低表達與術后生存期縮短相關，多變量COX回歸分析顯示這個預后因素是獨立于腫瘤分期的。2005年Iorio等利用芯片技術比較了76例乳腺癌組織和10例正常乳腺組織中microRNA表達差異，其中29個microRNA在腫瘤中表達下調，15個microRNA能將兩者正確分開。變異最為明顯的microRNA包括miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21，它們的表達與乳腺癌特異的病理參數如ER狀態(tài)、分期、增殖指數、血管侵潤等有關。研究還發(fā)現let-7在淋巴結轉移或高增殖指數的樣品中低表達，提示let-7低表達與不良預后相關，這與肺癌中的報道一致。2006年Yanaihara等采用傳統的芯片技術分析104對原發(fā)肺癌組織及癌旁組織的microRNA表達，得到一組由42個microRNA構成的組合，能夠正確地將肺癌與正常組織分開。通過單變量和多變量分析，發(fā)現microRNA表達譜與肺腺癌病人的生存期相關miR_155的高表達和let-7a-2的低表達與不良預后相關。為了探索microRNA表達譜是否可以用于預測非小細胞肺癌病人的臨床結果，2008年Yu等利用Real-timeRT-PCR技術檢測了112例非小細胞肺癌病人microRNA的表達情況，得到一個可獨立預測腫瘤復發(fā)及生存期的microRNA組合(hsa-let-7a,hsa-miR-221，hsa-miR-137,hsa-miR-372,hsa-miR-182)。該組合包括hSa-let-7a，與前兩個肺癌研究的結果一致，低表達與生存期縮短相關。2008年1月發(fā)表在nature上的一篇文章通過芯片技術比較不同轉移潛能的乳腺癌細胞系microRNA表達差異，發(fā)現一組microRNA在具有轉移潛能的乳腺癌細胞中不表達。將這些microRNA導入癌細胞中，可以抑制腫瘤細胞的肺轉移和骨轉移。其中導入miR-126后可降低腫瘤的生長和增殖，而導入miR-335后可抑制轉移細胞的侵襲，兩者均鑒定為人類乳腺癌的轉移抑制miRNA。同樣在2008年1月，blood雜志報道研究者利用芯片技術分析了122例未處理的急性髓細胞樣白血病樣品中microRNA的表達，發(fā)現miR-191和miR-199a高表達的病人總生存期和無病生存期遠遠低于低表達的病人。綜上所述，miRNA是細胞內一類重要的調節(jié)因子，調控許多基因的表達，與腫瘤關系密切，而且一些microRNA的組合可預測腫瘤病人的預后。通過檢測miRNA表達譜能夠診斷腫瘤，這種診斷手段比傳統的基因表達分析具有更高的準確度。鑒于此，本發(fā)明人經過了大量的實驗研究發(fā)現特定的miRNA表達譜也可調控一些與腫瘤放射敏感性相關的基因的表達，可用來預測腫瘤病人的放療敏感性。目前microRNA與腫瘤關系的研究大多集中在與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的關系方面，國內外還未見有miRNA表達譜與腫瘤放療敏感性關系的研究報導，特別是miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對腫瘤病人特別是肺癌患者在相同的治療劑量下，有的病人有效而有的病人則無效，有的病人可能出現嚴重的副作用的情況，在治療前通過miRNA表達譜預測肺癌病人對放射治療敏感性，即對腫瘤有最高療效又對正常組織損傷最低的放射劑量。為達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案如下本發(fā)明公開了miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用。本發(fā)明所述的miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用中包括:has-miR-130a、has_miR-106b、has_miR-19b、has-miR-22、has_miR-15b、has-miR-17_5p、has—miR-21、has_miR-126、has-miR-let_7a、has—miR-495、has—miR-451、has_miR_128b。胃ψhas-miR-130a^has_miR_106b、has_miR_19b、has-miR-22^has_miR-15b、has-miR-17_5p、has-miR-21、has-miR-126為低表達；has-miR-let_7a、has-miR-495>has-miR-45Uhas-miR-128b力更加優(yōu)選的是放射敏感和不敏感肺癌病人差異microRNA表達譜，低表達has-miR_130a染色體位置為llql2.l、has_miR-106b染色體位置為7q22.l、has_miR-19b染色體位置為13q31.3、has-miR_22染色體位置為17pl3.3、has_miR-15b染色體位置3q26.1、has-miR-17-5p染色體位置13q31.3,has-miR-21染色體位置9q22.3；高表達has-miR-126染色體位置為9q34.3、has-miR-let_7a染色體位置為17q23.l、has_miR-495染色體位置為14q32.3、has-miR_451染色體位置為17qll.2、has_miR-128b染色體位置為3ρ22·3。本發(fā)明所述的miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性的制備方法在于(1)選擇臨床上對放射治療異常敏感和高度耐受的肺癌病人各30人(沒有接受化學治療)，抽取5ml外周血，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA。(2)miRNA表達譜芯片雜交RNA標記一雜交一信號檢測(3)數據處理，用聚類分析方法分析放療敏感和不敏感病人MicroRNA表達譜的差異。(4)用Real-timePCR方法對結果進行驗證。我們把目標鎖定為MicroRNA(miRNA)是因為miRNA是一種近年發(fā)現的以序列特異性方式調控基因表達的非編碼蛋白質的內源性核苷酸。miRNA是通過對基因表達過程中翻譯過程的抑制來實現基因表達調控的。它可以抑制蛋白質翻譯、剪切mRNA，是動、植物很重要的基因表達調節(jié)分子。越來越多的研究表明，miRNA參與了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、腦腫瘤及白血病在內的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，闡明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中的作用機制，對癌癥的靶基因治療有著重要的意義。在本發(fā)明研究中，我們選擇了30例對放射治療敏感和耐受的肺癌病人，用miRNA表達普芯片檢測了兩組病人miRNA的表達差異，并用Real-timePCR技術對芯片結果進行了驗證，最終篩選出上述12個表達有顯著差胃白勺mil^NA。胃巾has-miR-130a>has-miR-106b>has-miR-19b>has-miR-22>has-miR-15b>has-miR-17_5p、has-miR-21、has-miR-126為低表達；has-miR-let_7a、has-miR-495、has-miR-45Uhas-miR-128b本發(fā)明篩選出的12個miRNA堿基序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明研究發(fā)現的12種MicroRNA(miRNA)與放射治療敏感性之間的關系在于對放射治療不敏感和敏感的肺癌病人其miRNA表達譜存在差異，其中本發(fā)明發(fā)現的12種miRNA表達差異最顯著。與對放射治療不敏感的肺癌病人相比，7種miRNA，即has_miR-130a、has_miR-106b、has_miR-19b、has-miR-22、has_miR-15b、has-miR-17_5p、has-miR-21在放射治療敏感病人中顯著低表達，5種miRNA，即has-miR-126；has-miR-let-7a>has-miR-495>has-miR-45Uhas-miR-128b$雙身寸夕臺^(胃_入巾！！胃冑表達。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明公開的miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用所具有的優(yōu)點和特點在于目前國內外還沒有可用于臨床預測放療敏感性的指標。本發(fā)明通過抽血檢測肺癌病人這些miRNA的表達高低能預測肺癌病人對放射治療的敏感性，從而指導醫(yī)生進行合理的治療，最大限度的減少對病人的過度治療和一些不必要的負作用。而且，檢測這些miRNA表達水平的方法比較簡單，如用Real-timePCR方法檢測；此外，血液標本來源豐富，取材簡單，對病人身體沒有損傷。所以本發(fā)明的臨床實用性很強。圖1為放療敏感和不敏感肺癌病人microRNA表達差異。紅色代表高表達，綠色為低表達(敏感病人為實驗組，不敏感病人為對照組)；圖2為Real-timePCR結果。具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的細節(jié)影響對本技術方案的描述。以下結合檢測實例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1病人和標本從合作醫(yī)院術后接受放射治療的肺癌病人中選擇對放射治療敏感和耐受的病人各15例，抽取5ml外周血，抗凝，_80°C低溫冰箱保存。2、外周血淋巴細胞分離及總RNA提取1)在離心管中加入淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)。2)取EDTA抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpmX20分鐘。3)離心后管內分為三層，上層為血漿和生理鹽水，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。4)用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的生理鹽水，1500rpmX10分鐘，洗滌細胞兩次。5)末次離心后，棄上清，加入ImLTrizonl(Inivtrogen)試劑，反復吹打細胞數次，使細胞裂解。收集細胞裂解液入離心管中。6)加入800μ1氯仿，振蕩，1600g，離心10分鐘。7)吸取上清，加入2.4ml(0.6倍體積)異丙醇。8)上下轉動離心管，強烈混勻。9)置-72°C冰箱一小時。10)1600g離心20分鐘。11)小心棄去上清，可見管底有白色沉淀，加入75%乙醇4ml。12)振蕩，1600g離心20分鐘。13)小心棄去上清，倒立離心管于吸水紙上，室溫下晾干后，加入200μ1經DEPC處理的水溶解沉淀。3、miRNA芯片雜交采用美國LC公司的mParafloTMmiRNA微流體芯片10.1版本，包含541個人類HiiRNA0該芯片基于mParafIoTM微流體技術，使陣列上的樣品溶液分布均一，同時促進了雜交反應。每張芯片對同一樣品重復4次檢測。本研究以對放射治療敏感的肺癌病人為實驗組，以不敏感病人為對照組，分別取10μg總RNA，用YM-100微孔離心濾器(GEMillipore，Billerica，ΜΑ)將其片段化，用poly(A)聚合酶加上poly(A)尾，利用miRCURYTMArrayLabellingkit(Ambion)標記Cy3和Cy5熒光。然后進行芯片雜交，雜交液為100μL含25%甲醛的6XSSPE緩沖液(0.90ΜNaCl,60mMNa2HP04,6mMEDTA,ρΗ6.8)，反應溫度34°C。雜交后的芯片用Gen印ix4000B進行圖像掃描，采用Gen印ixPro6.0軟件進行數據分析。計算兩種熒光信號的比值，用t-test進行差異顯著性分析，ρ<0.05為有顯著性差異。4、Real-timePCR驗證4.1逆轉錄1)取5μg無DNA的總RNA，加水至10μ1，力口2μ1Oligo(dT)或3，primer(50μΜ)。2)70°C,10分鐘，立即置冰上2分鐘。3)按順序加入下列溶液10XPCRBuffer2μ125mMMgCl22μ1IOmMdNTP1μ10.IMDTT2μ1混勻并離心。4)37°C保溫5分鐘，加入1μ1SupercriptII(200U)，混勻。5)370C保溫5分鐘，42V繼續(xù)保溫50分鐘。6)70°C，15分鐘，滅活逆轉錄酶，可存于_20°C。7)加入1μ1RNaseH,37°C，20分鐘。8)存于_20°C或者_70°C冰箱中。4.2Real-timePCR反應4.2.IPCR反應體系使用的試齊[J為SYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime)(AppliedBiosystems)配制反應體系。ddH2010μ12XSYBRPremix12.5μ1ROXReferenceDyeI0.5μ1IOmM上游引物0·5μ1IOmM下游引物0.5μ1模版DNA1μ1總體積25μ14.2.2PCR反應程序使用ABI7500型Real-time擴增儀，兩步法PCR擴增標準程序Stage1(預變性)95"C10秒，1Cycle；Stage2(PCR擴增)95°C5秒，60°C34秒，40Cycles；Stage3(溶解曲線分析，監(jiān)控PCR反應特異性)95°C15秒，60°C20秒，95V15秒。4.2.3結果分析1)使用SDS1.2軟件，得到Ct值，同一樣品重復3次。2)實驗組ACt=ΔCt(target)-ACt(GAPDH)；對照組ΔCt=ΔCt(target)-ΔCt(GAPDH)；ΔΔCt=ΔCt(實驗)-ΔCt(對照)；3)相對表達量=2-ΔACt5、結果發(fā)現12個microRNA在放療敏感和不敏感病人中表達有顯著差異，如圖1圖2和表1所示。表1放射敏感和不敏感肺癌病人差異表達的microRNA.表達高低(敏感相對miRNAs染色體位置ρ值與不敏感病人)has-miR-130allql2.10.000124低表達has-miR-106b7q22.10.000267低表達has-miR-19b13q31.30.000291低表達has-miR-2217pl3.30.000163低表達has-miR-15b3q26.10.000475低表達has-miR-17-5p13q31.30.000634低表達has-raiR-219q22.30.000214低表達has-miR-1269q34.30.000845高表達has-miR-Iet-7a17q23.10.000732高表達has-miR-49514q32.30.000301髙表達has-miR-45117qll.20.000417高表達has-miR-128b3p22.30.000357高表達在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明書中所舉實例實施方式的限制。權利要求miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用。2.如權利要求1所述的應用，其中所述的miRNA表達譜為has-miR-130a、has_miR-106b、has_miR-19b、has-miR-22、has_miR-15b、has-miR-17_5p、has-miR-21、has—miR-126、has-miR-let_7a、has—miR-495、has-miR-451、has-miR-128b。3.如權利要求1所述的應用，其中所述的miRNA表達譜中haS-miR-130a、has_miR-106b、has_miR-19b、has-miR-22、has_miR-15b、has-miR-17_5p、has-miR-21、has-miR-126^jjg^ii；has-miR-let-7a>has-miR-495>has-miR-45Uhas-miR-128b為高表達。4.如權利要求1所述的應用，其中低表達haS-miR-130a染色體位置為llql2.1、has-miR-106b染色體位置為7q22.1、has_miR-19b染色體位置為13q31.3、has-miR-22染色體位置為17pl3.3、has-miR-15b染色體位置3q26.1、has-miR-17_5p染色體位置13q31.3、has-miR-21染色體位置9q22.3；高表達has-miR-126染色體位置為9q34.3、has-miR-let_7a染色體位置為17q23.l、has_miR-495染色體位置為14q32.3,has-miR-451染色體位置為17qll.2、has-miR_128b染色體位置為3p22.3。5.如權利要求1所述的應用，其中所述的miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性的方法在于；(1)選擇臨床上對放射治療異常敏感和高度耐受的肺癌病人，抽取5ml外周血，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA；(2)MicroRNA表達譜芯片雜交(3)數據處理，用聚類分析方法分析放療敏感和不敏感病人MicroRNA表達譜的差異；(4)用Real-timePCR方法對結果進行驗證。全文摘要本發(fā)明公開了miRNA表達譜在預測肺癌病人對放射治療敏感性方面的應用。它選擇臨床上對放射治療異常敏感和高度耐受的肺癌病人，抽取5ml外周血，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA；然后用MicroRNA表達譜芯片雜交再進行數據處理，用聚類分析方法分析放療敏感和不敏感病人MicroRNA表達譜的差異；最后用Real-timePCR方法對結果進行驗證。本發(fā)明人發(fā)現的12個miRNA組成的表達譜可調控一些與腫瘤放射敏感性相關的基因的表達，可用來預測肺癌患者對放療的敏感性，為肺癌的個體化放射治療提供前期的實驗基礎。文檔編號C12Q1/68GK101824464SQ20091006799公開日2010年9月8日申請日期2009年3月2日優(yōu)先權日2009年3月2日發(fā)明者吳海良,吳紅英,孟愛民,張恒,李德冠,王小春,王月英,田麗麗,田靜,趙永成,路璐申請人:中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所