專利名稱：一種酶法去除普魯蘭多糖提取獲得β－聚蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案屬于生物法合成生物可降解高分子材料研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸(聚羥基丁二酸酯)[Poly (malic-acid)或Poly malate,簡稱為PMLA] 是以蘋果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物。盡管早在20世紀(jì)60年代晚期就 己發(fā)現(xiàn)聚蘋果酸,但一直到20年后當(dāng)它從幾種生物中分離出來時才受到了重視。 1969年Shimada等發(fā)現(xiàn)一種由蘋果酸組成的高分子化合物能抑制圓弧青霉 (尸e"/c,7/Z扁c少c/op/應(yīng))的酸性蛋白酶，當(dāng)時酯鍵巾的羧基位置還沒有確定，沉 寂兒年后，聚蘋果酸在黏菌(/7/2，amm/w/ycep/2a/wm)中被重新發(fā)現(xiàn)。而后幾年 聚蘋果酸的發(fā)展兒乎處于停滯期，1989年Fischer等在黏齒(;^，w"m 戶^甲/w/畫)中再次發(fā)現(xiàn)聚蘋果酸它是DNA聚合酶a的抑制劑。迄今為止， 以Shimada ， Fischer, Holler etal， Lee等為代表的國外學(xué)者對PMLA的性能， 合成和應(yīng)用做了較深入地研究，(3型聚蘋果酸已有商業(yè)產(chǎn)品，我國在這方面研究 的相對較少，直到近幾年才乂學(xué)者對聚蘋果酸的合成與性能做了基礎(chǔ)性的研究。 因此加強(qiáng)聚蘋果酸的研究，構(gòu)建可降解生物高分子的一個研究的平臺，具有重 要的理論價值和應(yīng)用價值。
聚蘋果酸屬T聚酯類聚合物，是一種新型的完全生物降解性高分子材料。生 物降解性材料是指通過自然界微生物(細(xì)菌、真菌等)作用而發(fā)生降解的高分 子物質(zhì)。該種材料降解的產(chǎn)物無毒無害，不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，近年來這種 高分子材料的開發(fā)研究得到了飛速發(fā)展。PMLA主要有二種結(jié)構(gòu):即ot型、(3型、Y型PMLA，唯一存在于人體內(nèi)的只有(3型PMLA。
作為一種水溶性脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物 可降解性、生物可吸收性、無免疫原性和可化學(xué)衍生性，PMLA可在水溶液中 自發(fā)或由酶促降解為小分子蘋果酸，而蘋果酸單體可被人體吸收并無任何毒副 作用。聚蘋果酸分解或燃燒后，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，可被植物吸收，對 環(huán)境無毒無害。PMLA的羧基上可連接很多其它的基團(tuán)，正是由于PMLA的這 種特殊結(jié)構(gòu)，且PMLA及其降解產(chǎn)物的無毒性及無抗原性，所以它具有很強(qiáng)的 藥物方面的用途，可以作為藥物載體用于心血管及腦腫瘤方面的研究，還可作 為微膠囊材料、生物醫(yī)學(xué)材料如手術(shù)縫合線及傷口、燒傷治療的繃帶等生物醫(yī) 學(xué)材料，直接用于人體，由于聚蘋果酸的無毒性和可吸水性，還可用于化妝產(chǎn) 品及食品包裝等材料。
普魯蘭多糖是出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸過程中的副產(chǎn)物，它的存在會導(dǎo) 致發(fā)酵液粘度增大，更為重要的是普魯蘭多糖的存在會嚴(yán)重影響聚蘋果酸的分 離提取。
普魯蘭酶(PuUulanase, EC 3.2丄41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點(diǎn)中 的01-1,6-糖苷鍵,從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫支酶。普魯蘭酶在以淀 粉為原料的食品加工業(yè)中有著重要的用途，是由于其能將最小單位的支鏈分解, 最大限度的利用淀粉原料。
聚蘋果酸的合成方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法兩種。化學(xué)合成法又分為 直接聚合和開環(huán)聚合(內(nèi)酯開環(huán)和交酯開環(huán))兩種。直接聚合法是在催化劑的 條件下以L-蘋果酸為單體直接脫水酯化可得。雖然此法直接簡單，產(chǎn)物分離提 純?nèi)菀?，產(chǎn)率較高，只是聚蘋果酸分子量低，反應(yīng)溫度較高，多為rPMLA，實(shí) 際應(yīng)用價值較低，而且催化劑有毒；開環(huán)聚合法合成聚蘋果酸分子量較直接聚合高，產(chǎn)物以/ -聚蘋果酸為主，反應(yīng)溫度較低，但該合成過程步驟較多產(chǎn)率低， 中間產(chǎn)物分離提純繁瑣，產(chǎn)率低；生物途徑制備的聚蘋果酸主要是通過微生物 發(fā)酵合成，目前研究發(fā)現(xiàn)粘菌(p/zy犯mm戶/》'cep/w/"m)和出芽短梗霉 (:/^m06a^//Mm /V/zJ朋)具有較高的聚蘋果酸合成能力。生物合成PMLA具 有突出的優(yōu)點(diǎn)，通過微生物發(fā)酵，產(chǎn)物均為(3型、產(chǎn)物分子量高、生產(chǎn)條件溫 和、生成產(chǎn)物純度較高，微生物發(fā)酵得到的PMLA分子量可達(dá)200 760kDa， 而化學(xué)法合成的分子量最多為174 kDa，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)PMLA產(chǎn)量不高，
分離純化困難，特別是在采用出芽短梗霉",60/7頻^膽////^朋)發(fā)酵生產(chǎn)聚
蘋果酸過程中，發(fā)酵副產(chǎn)物普魯蘭多糖的去除一直是PMLA提取中不容忽視的 重要問題，也是造成PMLA生產(chǎn)成本巨大的重要原因。因此，副產(chǎn)物普魯蘭多 糖的去除一直是困擾出芽短梗霉(Jw o6wWwm /^//m/朋)發(fā)酵制備PMLA的 主要問題之一，需高度重視。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用出芽短梗霉G4ww6wW/w附 P"/^/朋)發(fā)酵生產(chǎn)P—聚蘋果酸過程中有效降解去除副產(chǎn)物普魯蘭多糖的方法， 實(shí)現(xiàn)(3—聚蘋果酸的快速、高效提取和純化，提高p—聚蘋果酸產(chǎn)率，減少生產(chǎn) 成本。
本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 第 -歩培養(yǎng)基的配制
(1) 菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA): 土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20g/L， pH4.0 4.5， 121。C高壓蒸汽滅菌15 min;
(2) 種子培養(yǎng)基葡萄糖8%， 丁二酸銨0.3%, 丁二酸0.2%， K2CO30.04 %, KH2P04 0.01 %， MgS04-7H20 0.01 %， ZnS04'7H20 5X10_4%,玉米浸出液
發(fā)明內(nèi)容0.05%， CaC03 2%(單獨(dú)滅菌)，pH4.5， 121。C高壓蒸汽滅菌]5 min;
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖12%, 丁二酸銨0.3%， 丁二酸0.2°/。， K2C03 0.04%， KH2P04 0.01 %， MgS04'7H2 O 0.01 %, ZnS04'7H20 5X〗0-4 %,干.米浸出液 0.05%， CaC03 3。/。(單獨(dú)滅菌)，pH4.5' 121°C高壓蒸汽滅菌15 min;
第二歩菌種活化
將斜面菌種——出芽短梗霉""reo^wWww尸w〃w/朋)轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，25 °C 活化培養(yǎng)3 5 d;
第三步種子培養(yǎng)將第二步活化的斜面菌種接種于裝有100 mL第一步制得的 種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在24 30°C ， 120 180 r/m下培養(yǎng)48 90 h;
第四歩發(fā)酵培養(yǎng)
將第三步制得的種子培養(yǎng)液以8 1.0 %接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 30。C, 200r/m卜培養(yǎng)7 12d;
第五歩分離提取
(1) 普魯蘭多糖的降解在第四歩發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液，離心或過濾除去菌體，
發(fā)酵過濾液(上清液)pH調(diào)節(jié)至pH 5 pH 7，添加普魯蘭酶6 11 plu/mL，在 30。C 6(TC下，緩慢攪拌，反應(yīng)60min 卯min;
(2) p —聚蘋果酸的初步提取將第五步(l)中的發(fā)酵液冷卻至室溫，緩慢攪拌，
加入無水甲醇使上清液中甲醇終濃度為40% 60% (v/v)，混合液于室溫下緩 慢攪拌放置過夜，獲得的沉淀為(3 —聚蘋果酸，將離心獲得的沉淀，按1 : 10 (m:v)溶于蒸餾水中，再次離心除去小分T不溶物，上清液經(jīng)冷凍千燥，得 白色粉末狀P —聚蘋果酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是第一，使用該制備方法以出芽短梗霉菌種進(jìn)行發(fā)酵可獲得高度純化的P —聚蘋果酸；第二，使用該方法可有效去除副產(chǎn) 物普魯蘭多糖，提高(3 —聚蘋果酸的提取收率；第三，由于副產(chǎn)物普魯蘭多糖的 一歩去除，既提高了生產(chǎn)效率，降低)3 —聚蘋果酸的生產(chǎn)成本，又避免丫提取操 作過程中由于使用大量有機(jī)溶劑而造成的環(huán)境問題，減少環(huán)境污染。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
按如下步驟去除發(fā)酵液中的副產(chǎn)物普魯蘭制備(3 —聚蘋果酸 第一歩培養(yǎng)基的配制
(1) 菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA): 土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20g/L， pH4.0 4.5， 121 。C高壓蒸汽滅菌15 min:
(2) 種子培養(yǎng)基葡萄糖8%， 丁二酸銨0.3%， 丁二酸0.2%， K2CO30.04 %, KH2PO40.01 %， MgS04-7H20 0.01 %， ZnS04-7H20 5X 10-4 %,玉米浸出液 0.05°/。， CaC03 2%(單獨(dú)滅菌)，pH4.5， 121。C高壓蒸汽滅菌15 min;
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖L2%， 丁一酸銨0.3%， 丁二酸0.2%， K2C03 0.04%， KH2P04 0.01 %， MgS04.7H20 0.01 %, ZnS〇4'7H20 5X 10—4 %,玉米浸出液 0.05%, CaC03 3%(單獨(dú)滅菌)，pH4.5， 121。C高壓蒸汽滅菌15 min;
第二歩菌種活化
將斜面菌種-出芽短梗霉"wreokmW"w Pm〃m/"")轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，25°C
活化培養(yǎng)3 d 5 d;
第三步種子培養(yǎng)將第二歩活化的斜面菌種接種于裝有100 mL第一步制得的 種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在24 30°C， 120 180 r/m下培養(yǎng)48 h 90 h:
第四歩發(fā)酵培養(yǎng)將第三步制得的種子培養(yǎng)液以8 10 %接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 30°C ， 200 r/m下培養(yǎng)7 d 12 d;
第五步聚蘋果酸分離提取
(1) 普魯蘭多糖的降解在第四歩發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液，離心或過濾除去菌體， 發(fā)酵過濾液(上清液)pH調(diào)節(jié)至pH 5，添加6 plu/mL的普魯蘭酶，在60 °。下， 緩慢攪拌，反應(yīng)90min以降解去除普魯蘭多糖；
(2) P —聚蘋果酸的提取將第五步(l)中得到的液體冷卻至室溫，緩慢攪拌，逐 歩加入無水甲醇使其終濃度為40% (v/v)，混合液于室溫下緩慢攪拌放置過夜。 5000 r/m離心10 min得)3 —聚蘋果酸沉淀，將沉淀按1 : ]0 (m : v)溶于蒸餾 水屮，冉次經(jīng)5000r/m離心10min除去小分子不溶物，上清液冷凍千燥，得白 色粉末狀(3 —聚蘋果酸；
在本實(shí)施例中，按照實(shí)施例一的方法在第五歩發(fā)酵過濾液(上.清液)pH調(diào)至pH 6，添加8plu/mL的普魯蘭酶，在4(TC下，緩慢攪拌，反應(yīng)60 min,以降解普 魯蘭多糖；將該液體緩慢攪拌，逐滴加入無水甲醇至其終濃皮達(dá)到50%;其它 同實(shí)施例1。
在本實(shí)施例中，按照實(shí)施例一的方法在第五步發(fā)酵過濾液(上清液)pH調(diào)至pH 7，添加]lplu/mL的普魯蘭酶，在30。C下，緩慢攪拌，反應(yīng)90min，降解普魯 蘭多糖；將該液體緩慢攪拌，逐滴加入無水甲醇至其終濃度達(dá)到60%;其它同 實(shí)施例1。
實(shí)施例
實(shí)施例
權(quán)利要求
1.利用酶法去除普魯蘭糖獲得β-聚蘋果酸的制備方法，包括以下步驟第一步培養(yǎng)基的配制(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高壓蒸汽滅菌15min；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖8％，丁二酸銨0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(單獨(dú)滅菌)，pH 4.5，121℃高壓蒸汽滅菌15min；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖12％，丁二酸銨0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO33％(單獨(dú)滅菌)，pH 4.5，121℃高壓蒸汽滅菌15min；第二步菌種活化將斜面菌種——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，25℃活化培養(yǎng)3d～5d；第三步種子培養(yǎng)將第二步活化的斜面菌種接種于裝有100mL第一步制得的種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在24～30℃，120～180r/m下培養(yǎng)48～90h；第四步發(fā)酵培養(yǎng)將第三步制得的種子培養(yǎng)液以8％～10％(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24℃～30℃，200r/m下培養(yǎng)7d～12d；第五步分離提取(1)普魯蘭多糖的降解在第四步發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液，離心或過濾除去菌體，發(fā)酵過濾液(上清液)調(diào)節(jié)pH 5～7，添加普魯蘭酶6～11plu/mL，在30℃～60℃下，緩慢攪拌，反應(yīng)60min～90min；(2)β-聚蘋果酸的提取將第五步(1)中的發(fā)酵液冷卻至室溫，緩慢攪拌，加入無水甲醇使酶解后的發(fā)酵過濾液中甲醇終濃度為40％～60％(v/v)，將該混合液于室溫下緩慢攪拌后放置過夜，獲得的沉淀即為β-聚蘋果酸粗品，將β-聚蘋果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸餾水中，經(jīng)5000r/m離心，除去小分子不溶物，真空濃縮后冷凍干燥得β-聚蘋果酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解普魯蘭多糖獲得P—聚蘋果酸方法，其特征在于， 在13 —聚蘋果酸的提取過程中，發(fā)酵過濾液添加普魯蘭酶降解發(fā)酵過程中的副 產(chǎn)物普魯蘭多糖，提取獲得e—聚蘋果酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解普魯蘭多糖后提取獲得I3—聚蘋果酸的方法，其 特征在于，發(fā)酵過濾液調(diào)pH 5 pH 7后添加普魯蘭酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解普魯蘭多糖后提取獲得3—聚蘋果酸的方法，具 特征在于，發(fā)酵過濾液添加6 llplu/mL的普魯蘭酶，提取獲得P—聚蘋果酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解普魯蘭多糖后提取獲得P—聚蘋果酸的方法，其 特征在于，發(fā)酵過濾液在3CTC 5(TC下，添加普魯蘭酶，提取獲得P—聚蘋果 酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的降解普魯蘭多糖后提取f3—聚蘋果酸的方法，其特征 在于，發(fā)酵過濾液添加普魯蘭酶，緩慢攪拌，反應(yīng)30 min 90 min后，提取獲得I3—聚蘋果酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解普魯蘭糖后提取獲得P—聚蘋果酸的方法，其特 征在于發(fā)酵過濾液降解普魯蘭糖后添加甲醇使甲醇終濃度為40% 60% (Wv) 以獲得I3—聚蘋果酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用普魯蘭酶有效降解去除出芽短梗霉發(fā)酵液中普魯蘭多糖，以利于提取獲得β-聚蘋果酸的方法。利用本方法能夠有效降解去除出芽短梗霉發(fā)酵液中的普魯蘭多糖，提高產(chǎn)物產(chǎn)率和純度，避免由于普魯蘭多糖的干擾而造成的一系列繁瑣操作，提高了工作效率，降低產(chǎn)物生產(chǎn)成本。本發(fā)明通過下述方案予以實(shí)現(xiàn)將出芽短梗霉菌種經(jīng)活化和種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中；在24～30℃和120～200r/m條件下培養(yǎng)7d～12d，發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液經(jīng)5000r/m離心或過濾，除去菌體。發(fā)酵過濾液(上清液)調(diào)節(jié)pH至pH5～pH 7，添加普魯蘭酶6～11plu/mL上清液，在30℃～50℃條件下，反應(yīng)30min～90min，隨后添加無水甲醇至甲醇終濃度為40％～60％，緩慢攪拌后靜置過夜，獲得的沉淀即為β-聚蘋果酸粗品，將β-聚蘋果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸餾水中，經(jīng)5000r/m離心，除去小分子不溶物，真空濃縮后冷凍干燥得β-聚蘋果酸。
文檔編號C12P7/62GK101560528SQ20091006895
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者喬長晟, 徐勇虎, 王鳳榮, 磊 蔣, 賈士儒 申請人:天津科技大學(xué)