專利名稱：一株葡糖醋桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"acetoto"w sp. SC-01)及其應(yīng)用，特別 是涉及一株葡糖醋桿菌SC-01 (G/t/co"aceto6acfersp. SC-01)的發(fā)酵方法及利用該菌生 產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。
背景技術(shù)：
為了區(qū)別植物來(lái)源的纖維素，把微生物來(lái)源的纖維素稱為細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose, BC)。據(jù)報(bào)道，葡糖醋桿菌屬的細(xì)菌合成細(xì)菌纖維素的能力最強(qiáng)，具有大規(guī) 模發(fā)酵生產(chǎn)的潛力。
與植物纖維素相比，細(xì)菌纖維素是由超微纖維組成的超微纖維網(wǎng)，其超微纖維直徑 僅為植物纖維的1/100。其彈性模量高達(dá)1.5xl(^Pa ，與鋁相當(dāng)。細(xì)菌纖維素是一種可生 物降解的高分子，它有許多獨(dú)特的性能①結(jié)構(gòu)均一性具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(納米 級(jí))，高化學(xué)純度，高結(jié)晶度，高聚合度；②較好的分散和乳化性。③高抗張強(qiáng)度和
彈性模量、極佳的抗撕拉能力和形狀維持能力。 高持水能力。⑤形狀可塑性及物理 性質(zhì)的可調(diào)控性，如合成過(guò)程中通過(guò)改變培養(yǎng)方式或者添加特定的物質(zhì)，可以得到所需 特性的纖維素。⑥較高的生物相容性和良好的生物可降解性。
此外，細(xì)菌纖維素還具有其他一些優(yōu)越性能，因此，細(xì)菌纖維素在食品、醫(yī)藥、造 紙、紡織等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。例如在外科治療中作為皮膚代用品，用于治療燒
傷、潰瘍以及皮膚移植手術(shù)；用于制造超性能的聲音振動(dòng)膜；制作人造微血管；還可以 作為食品添加劑及紙品添加劑等。
盡管細(xì)菌纖維素的理化性質(zhì)及機(jī)械性能優(yōu)于植物纖維素，并已被證明在工業(yè)生產(chǎn)中 具有廣泛的商業(yè)應(yīng)用前景，但由于細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高，使其應(yīng)用受到限 制。細(xì)菌纖維素的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，為了提高其產(chǎn)量可以從多方面入手，分 離高產(chǎn)菌株和優(yōu)化菌株生長(zhǎng)代謝的營(yíng)養(yǎng)源及其發(fā)酵方式是一條可行的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可用于大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的葡糖醋桿菌sc-oi
3(G/wcowac"o6ac&r SC-01)。
本發(fā)明提供的葡糖醋桿菌為葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"aceto6ac欣sp. SC-Ol)，該菌 己于2009年5月26日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢，武漢大學(xué)內(nèi))，保 藏編號(hào)為CCTCC NO: M 209112。
本發(fā)明的葡糖醋桿菌SC-01 (G/wcowaceto6ac^sp. SC-01)分離自天津薊縣產(chǎn)腐爛的 柿子。該菌可以在1 培養(yǎng)基(2%葡萄糖，().5%蛋白胨，0.5%酵母浸粉，0.27%NaH2PO4 ， 0.115%擰檬酸，1%乙醇，pH 6.0)上生長(zhǎng)良好。菌落呈圓形，半透明，邊緣整齊。其 16SrDNA基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為1379bp，在GenBank中的登錄號(hào)為FJ999663。使用 BLAST對(duì)SC-01菌株的16S rDNA基因和GenBank中已登錄細(xì)菌進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā) 現(xiàn)該菌株與已報(bào)道的G/wcowacetotocto" x_y//m/s strain CGMCC1.1812的16S rDNA基因 序列相似性最高。葡糖醋桿菌SC-01 (G/"co朋c"o6ac^sp. SC-01)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)說(shuō) 明書附圖l。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述葡糖醋桿菌SC-01 (G/"co朋c柳to"w sp. SC-01)生產(chǎn)性能優(yōu)良的細(xì)菌纖維素的方法。
為了實(shí)現(xiàn)這一 目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"aceto6a"w sp. SC-01)生產(chǎn)性能優(yōu)良的細(xì)菌纖維素的方法是采用優(yōu)化的HS培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。具體 步驟如下首先將菌種接種至種子培養(yǎng)基中，25-35'C搖床振蕩培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為135rpm, 以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種時(shí)充分振蕩，使菌體分散均勻，25-35t恒溫靜 置培養(yǎng)10天或震蕩培養(yǎng)5天。取出纖維素膜，提純處理并干燥之后稱重。
利用葡糖醋桿菌SC-01 (G/"co加c她6ac^sp. SC-01)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素所用發(fā)酵培 養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一種或幾種；氮源為酵 母粉或蛋白胨或玉米漿干粉中的一種或幾種。
為了提高葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"acetoto"wsp. SC-01)的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，所 述發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中添加發(fā)酵液體積百分比為0.5%~2%的95%乙醇作為生長(zhǎng)因子促進(jìn)菌 株生長(zhǎng)，以產(chǎn)生更多的細(xì)菌纖維素。
本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25-35°C;發(fā)酵培養(yǎng)初始pH值為3.5-7.0。
本發(fā)明以葡糖醋桿菌SC-01 (G/wc0"aceto6arfwsp. SC-01)為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵制備細(xì) 菌纖維素。培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一種或幾種；氮源為酵母粉或蛋白胨或玉米漿干粉中的一種或幾種。本發(fā)明的菌株培養(yǎng)條件更加 靈活，菌株可以在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)改變培養(yǎng)條件，可以根據(jù)需要得 到所需特性的細(xì)菌纖維素，使細(xì)菌纖維素的合成有更好的可調(diào)控性。利用本發(fā)明的方法， 可以得到較高的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，更適于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。以前報(bào)道的一些菌種 在發(fā)酵的后期由于培養(yǎng)基中葡萄糖酸的產(chǎn)生，pH下降，從而抑制了細(xì)菌纖維素合成的 相關(guān)酶的活性，使細(xì)菌纖維素產(chǎn)量下降。本發(fā)明的菌株在初始pH為4時(shí)仍有較高的細(xì) 菌纖維素產(chǎn)量，優(yōu)于以前報(bào)道的菌種。利用本發(fā)明的菌株和培養(yǎng)方法得到的細(xì)菌纖維素 具有超純、超細(xì)、結(jié)晶度高、吸水性好、可降解、機(jī)械強(qiáng)度高、合成可調(diào)控等特點(diǎn)。因 此利用本發(fā)明的菌株和培養(yǎng)方法得到的細(xì)菌纖維素具有更廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"acetoZ>a"ersp. SC-01)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 下面結(jié)合具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中，所用的菌種均為葡糖醋桿菌SC-01 (G/wcowaceto&crer sp. SC-Ol)，實(shí)施例中所用的不同培養(yǎng)基配方如下
1. 篩選培養(yǎng)基
(1) 固體GYC培養(yǎng)基葡萄糖3 - 5g,酵母粉0.3 - lg， CaC031 -2g， 95%乙醇0.5 - 2ml， 瓊脂1.5 -2.5g，蒸餾水100ml， pH 6.8。另外加入100 pi 10mg/ml的制霉菌素抑制 真菌等的生長(zhǎng)。
(2) 液體HS培養(yǎng)基:葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g，Na2HPO4 0.27g， 95。/o乙醇2ml，蒸餾水100ml， pH 6.0。另外加入100 pl 10mg/ml的制霉菌素抑制真 菌等的生長(zhǎng)。
其中，制霉菌素用二甲基亞砜作溶劑配制成10mg/tnl， 0.22nm濾器過(guò)濾除菌。
2. 種子培養(yǎng)基葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g， Na2HPO40.27g， 950/o乙醇lml， MgS04'7H20 0.05g，蒸餾水100ml， pH6.0。
3. 發(fā)酵培養(yǎng)基-
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g，Na2HP04 0.27g， MgS04.7H20 0.05g， 95。/。乙醇lml，蒸餾水100ml， pH6.0。(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基2:甘露醇2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g，Na2HPO4 0.27g， MgS04-7H20 0.05g，蒸餾水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基3:甘露醇和蔗糖各lg,酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS(V7H20 0.05g，蒸餾水100ml， 950/o無(wú)菌乙醇2ml， pH6.0。
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基4:半乳糖和甘露醇各lg，酵母粉lg，檸檬酸0.115g， Na2HPO40.27g, MgS04'7H20 0.05g，蒸餾水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(5) 發(fā)酵培養(yǎng)基5:果糖2g，玉米漿干粉lg，檸檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS(V7H20 0.05g，蒸餾水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(6) 發(fā)酵培養(yǎng)基6:木糖和甘露醇各lg,酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，檸檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS04.7H20 0.05g，蒸餾水100ml， 95%無(wú)菌乙醇lml， pH4.0。
實(shí)施例l、分離葡糖醋桿菌SC-Ol ( G/"cwwceto6flcte/"sp.SC-01)
實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于天津薊縣產(chǎn)腐爛的柿子。
具體步驟如下取腐爛的柿子汁液，用100目篩過(guò)濾，以無(wú)菌生理鹽水10倍梯度 稀釋，分別稀釋為101406，取10M()S涂布到固體GYC培養(yǎng)基平板上，25-35t培養(yǎng)4 天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取帶有透明斑的菌落轉(zhuǎn)接至液體HS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，培 養(yǎng)液表面有膜狀物產(chǎn)生，將膜處理后經(jīng)檢測(cè)為細(xì)菌纖維素膜，初步判斷該菌為細(xì)菌纖維 素產(chǎn)生菌。經(jīng)革蘭氏染色，生理生化實(shí)驗(yàn)及16SrDNA基因序列分析以及BI0L0G鑒定， 確定該菌株為葡糖醋桿菌，并且命名為葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"acetok c^ sp. SC-01 )， 經(jīng)保藏，編號(hào)為CCTCC NO: M 209112。
實(shí)施例2、葡糖醋桿菌SC-Ol ( ( /"cwiflceto6<icfe"p.SC-01)的發(fā)酵
采用發(fā)酵培養(yǎng)基l。具體步驟如下首先將菌種接種到種子培養(yǎng)基中，25-35'C搖床 振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為135rpm，培養(yǎng)24h后，按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種時(shí)充 分振蕩，使菌體分散均勻，25-35'C恒溫靜置培養(yǎng)10天。取出纖維素膜，以去離子水多 次沖洗除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，將膜浸在0.1mol/L的NaOH中，IO(TC煮沸l(wèi)h,去 除膜中菌體和殘留培養(yǎng)基，至膜呈乳白色半透明，用去離子水浸泡過(guò)夜，然后用去離子 水多次沖洗直至pH為7.2左右，然后250ml離心管中4000rpm離心40min,棄上清，將 膜取出，置于吸水紙上吸取表面的水，稱濕重。將濕膜放至平皿中包上保鮮膜，扎孔， 于-20'C冰箱中預(yù)凍2h,然后冷凍真空干燥至恒重，稱其重量為細(xì)菌纖維素的干重。實(shí)施例3、采用發(fā)酵培養(yǎng)基2。具體步驟如下首先將菌種接種到種子培養(yǎng)基中，25-35°C 搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為135rpm，培養(yǎng)24h后，按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種 時(shí)充分振蕩，使菌體分散均勻，25-35"C恒溫震蕩培養(yǎng)5天。以下步驟同實(shí)施例2。 實(shí)施例4、采用發(fā)酵培養(yǎng)基3。具體步驟同實(shí)施例2。 實(shí)施例5、采用發(fā)酵培養(yǎng)基4。具體步驟同實(shí)施例3。 實(shí)施例6、采用發(fā)酵培養(yǎng)基5。具體步驟同實(shí)施例2。 實(shí)施例7、采用發(fā)酵培養(yǎng)基6。具體步驟同實(shí)施例3。
實(shí)施例8、采用發(fā)酵培養(yǎng)基6，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25'C。具體步驟同實(shí)施例2。 實(shí)施例9、采用發(fā)酵培養(yǎng)基6，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35t:。具體步驟同實(shí)施例3。
權(quán)利要求
1.一株葡糖醋桿菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)。該菌已于2009年5月26日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢，武漢大學(xué)內(nèi))，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 209112。
2. 利用葡糖醋桿菌SC-01 (G/wco"aceto6ac^ sp. SC-01)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方 法，包括以下步驟首先將菌種接種到種子培養(yǎng)基中，25-35'C搖床振蕩培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)速為135rpm，培養(yǎng)24h后，按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種時(shí)充分 振蕩，使菌體分散均勻，25-35'C恒溫靜置培養(yǎng)10天或震蕩培養(yǎng)5天。取出 纖維素膜，提純處理并干燥之后稱重。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的 碳源為葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一種或幾種；氮源 為酵母粉或蛋白胨或玉米漿干粉中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述培養(yǎng)過(guò)程 中添加發(fā)酵液體積百分比為0.5%~2%的95%乙醇作為生長(zhǎng)因子促進(jìn)菌株生 長(zhǎng)，以產(chǎn)生更多的細(xì)菌纖維素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述發(fā)酵 培養(yǎng)溫度為25 -35"C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述發(fā)酵 培養(yǎng)初始pH值為3.5-7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株葡糖醋桿菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)及其應(yīng)用。涉及一株葡糖醋桿菌及利用該菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。菌種接種至種子培養(yǎng)基，25-35℃搖床振蕩培養(yǎng)24h，以10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25-35℃恒溫靜置培養(yǎng)10天或震蕩培養(yǎng)5天。分離出纖維素、純化、干燥。培養(yǎng)基碳源為葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一種或幾種；氮源為酵母粉或蛋白胨或玉米漿干粉中的一種或幾種。該發(fā)明的菌株在低pH環(huán)境中仍有較高的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，適于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。利用本發(fā)明得到的細(xì)菌纖維素具有超純、超細(xì)、結(jié)晶度高、吸水性強(qiáng)、可降解和機(jī)械強(qiáng)度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101591626SQ200910069499
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者孔梅梅, 宋存江, 曹名鋒, 李保賓, 王淑芳, 蘇文萍 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)