專利名稱：提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-l-古龍酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別是涉及一種提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法。
背景技術(shù)：
維生素C是機(jī)體營養(yǎng)、生長所必需的一種微量水溶性維生素，在抗氧化和維持新陳代 謝平衡等方面起著重要的作用。維生素C可以作為藥品、保健品、食品添加劑及化妝品營 養(yǎng)劑，它的應(yīng)用范圍在擴(kuò)展，市場穩(wěn)定。
目前，我國生產(chǎn)維生素c的方法為"二步發(fā)酵法"，第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇
轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為混合發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L -古 龍酸。混合發(fā)酵所使用的混合菌系為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混菌發(fā)酵，其中，氧化 葡糖桿菌為產(chǎn)酸菌，巨大芽孢桿菌為伴生菌，若不加入巨大芽孢桿菌而單獨(dú)使用氧化葡糖 桿菌時，生長極端緩慢，產(chǎn)酸效率低，當(dāng)加入巨大芽孢桿菌，可使氧化葡糖桿菌生長速率 提高，產(chǎn)酸量增加，但是，它的加入可造成發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的浪費(fèi)，使成本提高， 同時，因其在發(fā)酵液中的濃度較高，因此，在處理混菌發(fā)酵液過程的成本也會大大增加， 混菌代謝物成分復(fù)雜，后處理困難。對環(huán)境造成污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸 的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養(yǎng)
稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g,牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g， 蛋白胨2-10g， KH2PO40.5-5g， MgSO40.1-0.7g， CaCO30.5-5g，加水至1L，調(diào)pH為6.5 7.0， 121'C滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養(yǎng)基中，28-35°C， 160-250r/min搖床振蕩，培養(yǎng)24-48小時，制成種子培養(yǎng)液； (2)發(fā)酵
稱取L-山梨糖40-120g，玉米漿10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g ，MgSO40.2-1.2g， CaCO3l-10g加水至1L，調(diào)pH為6.5-7.5， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培 養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為5%-15%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-35°C， 160-250 r/min搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)48-96小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時至36小時之間的任 意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。
所述巰基化合物為還原型谷胱甘肽，二硫蘇糖醇，半胱氨酸或輔酶A。還可以選用其 它的無毒的巰基化合物。
步驟(1)優(yōu)選為稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g,酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO40.2g， CaC03l g加水至1L，調(diào)pH為6.8， 121。C滅 菌20min，制成種子培養(yǎng)基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養(yǎng)基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養(yǎng)36小時，制成種子培養(yǎng)液。
步驟(2)優(yōu)選為稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO在5 g， CaC035g加水至1L，調(diào)pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C， 220 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰 基化合物，使巰基終濃度為3mM。
本發(fā)明能明顯提高氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.U10的生長 速度和產(chǎn)2-酮-L-古龍酸效率，達(dá)到部分取代伴生菌的伴生效果的目的。從而可以減少伴生 菌巨大芽孢桿菌的用量，減少培養(yǎng)基的成本，并可以減少巨大芽孢桿菌的菌體，芽孢和代 謝物對環(huán)境的污染。
本發(fā)明揭示了在添加巰基化合物的氧化葡糖桿菌單獨(dú)培養(yǎng)時，能明顯提高生長速度和 產(chǎn)2-酮-L-古龍酸效率，達(dá)到部分取代伴生菌的目的。針對這一狀況，本發(fā)明為今后揭示混 菌發(fā)酵的作用機(jī)制提供了一定的提示作用。


圖1為巰基化合物對氧化葡糖桿菌產(chǎn)酸能力的影響，圖例未加入巰基化合物；
參加入GSH 1.0mg/ml; 力口入DTT0.5mg/ml; X:加入cys 0.4 mg/ml; 加入CoA 2.5mg/ml。
圖2為巰基化合物對菌體生物量的影響，圖例未加入巰基化合物；參加入GSH 1.0mg/ml; 加入DTT 0.5mg/ml; X:加入cys 0.4 mg/ml;加入CoA2.5mg/ml。 圖3為不同濃度GSH對氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸能力的影響。 圖4為不同濃度GSH對氧化葡糖桿菌生物量的影響。
圖5為1.0mg/ml的GSH對不同起始濃度的氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸能力的影響， 圖例■:加入體積比為10%，未加入GSH;參加入體積比為1%，加入1.0mg/ml GSH; 加入體積比為10%，加入l.Omg/ml GSH; X:加入體積比為100%，加入l.Omg/ml GSH。圖6為1.0mg/ml的GSH對不同起始濃度的氧化葡糖桿菌生物量的影響，圖例 加入體積比為10%,未加入GSH;參加入體積比為1%，加入1.0mg/mlGSH; ▲:加入 體積比為10%，加入l.Omg/mlGSH; X:加入體積比為100%，加入1.0mg/ml GSH。
圖7不同時間加入1.0mg/ml GSH對氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸能力的影響。圖例 ■:未加入GSH;參加入時間為Oh; 加入時間為3h; X:加入時間為6h; 加
入時間為12h; 加入時間為24h; 加入時間為36h。
圖8不同時間加入1.0mg/mlGSH對氧化葡糖桿菌生物量的影響。圖例未加入
GSH;攀加入時間為Oh; 加入時間為3h; X:加入時間為6h; 加入時間為12h;
O:加入時間為24h; 加入時間為36h。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
本發(fā)明所使用的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得，保藏編號為CGMCC NO丄llO。 實(shí)施例1
提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (l)種子培養(yǎng):
稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO在2g, CaC03l g加水至1L，調(diào)pH為6.8， 121。C滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養(yǎng)基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養(yǎng)36小時，制成種子培養(yǎng)液； (2)發(fā)酵
稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO40.5 g， CaC035g 加水至1L，調(diào)pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C， 220 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)O小時，加入還原型谷胱甘肽，使其濃度為 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
可以用發(fā)酵培養(yǎng)l小時，發(fā)酵培養(yǎng)2小時，發(fā)酵培養(yǎng)5小時，發(fā)酵培養(yǎng)10小時，發(fā)酵 培養(yǎng)15小時，發(fā)酵培養(yǎng)18小時，發(fā)酵培養(yǎng)24小時，發(fā)酵培養(yǎng)30小時或發(fā)酵培養(yǎng)36小時 替代本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)0小時組成新的實(shí)施例。 實(shí)施例2
提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養(yǎng)
稱取L-山梨糖10g，玉米漿2g，牛肉膏2g，酵母浸粉2g，尿素0.5g，蛋白胨2g， KH2PO40.5g， MgSO40.1g， CaCO30.5g加水至1L，調(diào)pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成種
子培養(yǎng)基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養(yǎng)基中，28°C, 160r/min搖床振蕩，培養(yǎng)48小時，制成種子培養(yǎng)液； (2)發(fā)酵
稱取L-山梨糖40g，玉米漿10g，尿素10g， KH2PO40.5g， MgSO40.2g， CaC03lg 加水至1L，調(diào)pH為7.5， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為5%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C， 160 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)96小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時，加入二硫蘇糖醇，使巰基終濃度為 O.lmM。
可以用發(fā)酵培養(yǎng)l小時，發(fā)酵培養(yǎng)2小時，發(fā)酵培養(yǎng)5小時，發(fā)酵培養(yǎng)10小時，發(fā)酵 培養(yǎng)15小時，發(fā)酵培養(yǎng)18小時，發(fā)酵培養(yǎng)24小時，發(fā)酵培養(yǎng)30小時或發(fā)酵培養(yǎng)36小時 替代本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)0小時組成新的實(shí)施例。 實(shí)施例3
提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養(yǎng)
稱取L-山梨糖50g，玉米漿10g，牛肉膏10g，酵母浸粉10g，尿素5g，蛋白胨10g， KH2P045g， MgSO40.7g， CaC035g加水至1L，調(diào)pH為6.5， 121。C滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養(yǎng)基中，35'C， 250r/min搖床振蕩，培養(yǎng)24小時，制成種子培養(yǎng)液； . (2)發(fā)酵
稱取L-山梨糖120g，玉米漿50g，尿素25g， KH2P043g， MgS041.2g， CaCO310g 加水至1L,調(diào)pH為6.5， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為15%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C， 250 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)48小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)36小時，加入半胱氨酸，使巰基終濃度為 30mM。
可以用發(fā)酵培養(yǎng)O小時，發(fā)酵培養(yǎng)l小時，發(fā)酵培養(yǎng)2小時，發(fā)酵培養(yǎng)5小時，發(fā)酵 培養(yǎng)10小時，發(fā)酵培養(yǎng)15小時，發(fā)酵培養(yǎng)18小時，發(fā)酵培養(yǎng)24小時或發(fā)酵培養(yǎng)30小時 替代本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)36小時組成新的實(shí)施例。 實(shí)施例4
提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養(yǎng)
稱取L-山梨糖30g，玉米漿4g，牛肉膏2g，酵母浸粉5g，尿素1.5g，蛋白胨7g， KH2P04lg， MgSO在3g， CaC032g加水至1L，調(diào)pH為6.7， 12rC滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄110接種于所述種子 培養(yǎng)基中，3(TC， 200r/min搖床振蕩，培養(yǎng)36小時，制成種子培養(yǎng)液；(2)發(fā)酵
稱取L-山梨糖60g，玉米漿30g，尿素15g， KH2P041.5g， MgSO40.5 g， CaC035 g 加水至1L，調(diào)pH為6.8, 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，3(TC， 200 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)24小時，加入輔酶A，使巰基終濃度為5mM。
可以用在發(fā)酵培養(yǎng)O小時，發(fā)酵培養(yǎng)l小時，發(fā)酵培養(yǎng)2小時，發(fā)酵培養(yǎng)5小時，發(fā) 酵培養(yǎng)10小時，發(fā)酵培養(yǎng)15小時，發(fā)酵培養(yǎng)18小時，發(fā)酵培養(yǎng)30小時或發(fā)酵培養(yǎng)36小 時替代本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)24小時組成新的實(shí)施例。 實(shí)施例5
2-酮基-L-古龍酸和L-山梨糖含量測定方法 采用高效液相色譜法(HPLC)。
樣品制備取培養(yǎng)不同時間的發(fā)酵液lmL于1.5mL離心管中，10000r/min轉(zhuǎn)速離心3min， 取上清100nL于1.5mL離心管中，并加入900jiL流動相(5mMH2S04)得到稀釋十倍的樣 品。振蕩混勻后，用0.22^1111的纖維素微孔濾膜過濾樣品，得到待測樣品。
高效液相色譜條件色譜柱bio-radHPX-87H，流動相5mMH2S04，流速0.6mL/min， 柱溫65°C，示差檢測器。 實(shí)施例6
還原型谷胱甘肽(GSH)， 二硫蘇糖醇(DTT)，半胱氨酸(cys)和輔酶A (CoA)提 高氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) CGMCC NO丄llO生長速度和產(chǎn)酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110為目標(biāo)菌株，測定該菌 株在有無巰基化合物添加的情況下的酸產(chǎn)量和生物量變化。
采用實(shí)施例'l的方法進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵，用0mg/mlGSH或lmg/mlGSH或0.5mg/ml DTT或0.4 mg/ml cys或2.5mg/ml CoA替代實(shí)施例1中的lmg/mlGSH，使巰基終濃度為3mM 時，進(jìn)行測試。
測試結(jié)果如圖l，圖2所示，結(jié)果顯示加入GSH后，發(fā)酵72小時后氧化葡糖桿菌發(fā) 酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為37.75 mg/ml,而空白組(未加巰基化合物)酸產(chǎn)量為11.25 mg/ml，提高了 2.276倍。發(fā)酵72小時后氧化葡糖桿菌的生物量為0.81mg/ml，相比于空白 組的0.27 mg/ml,提高了2倍。加入DTT后，發(fā)酵72小時后氧化葡糖桿菌發(fā)酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為36.52 mg/ml,,而空白組酸產(chǎn)2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml,提高了 2.246倍。72小時后氧化葡糖桿菌的生物量為0.59mg/ml，相比于空白組的0.27 mg/ml，提 高了1.18倍。加入cys后，發(fā)酵72小時后氧化葡糖桿菌發(fā)酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度 為30.43 mg/ml，而空白組酸產(chǎn)2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml，提高了 1.704倍。72小時 后氧化葡糖桿菌的生物量為0.56mg/ml，相比于空白組的0.27mg/ml，提高了 1.078倍。力口 入CoA后，發(fā)酵72小時后氧化葡糖桿菌發(fā)酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為35.00 mg/ml， 而空白組酸產(chǎn)2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml，提高了 2.211倍。72小時后氧化葡糖桿菌的 生物量為0.87mg/ml，相比于空白組的0.27 mg/ml，提高了 2.22倍。上述結(jié)果表明巰基化合物加入后能大幅度的提高氧化葡糖桿菌的產(chǎn)酸能力和生長速度。 實(shí)施例7
加入不同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) CGMCC NO丄llO生長速度和產(chǎn)2-酮基-古龍酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄110為目標(biāo)菌株，測定該菌 株在添加不同濃度的巰基化合物情況下的2-酮基-古龍酸產(chǎn)量和生物量變化。
采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵，用0mg/ml GSH,或0.1 mg/ml GSH，或0.5 mg/ml GSH，或0.8 mg/ml GSH,或1.0 mg/ml GSH，或2.0 mg/ml GSH，或5.0mg/ml GSH 替代實(shí)施例1中的1.0mg/mlGSH，進(jìn)行測試。
以氧化葡糖桿菌為目標(biāo)菌株，測定該菌株加入O.l， 0.5， 0.8， 1.0， 2.0， 5.0mg/mlGSH 后，2-酮基-古龍酸產(chǎn)量和生物量變化。如下圖3所示，結(jié)果顯示隨著加入lmg/mlGSH的 促進(jìn)產(chǎn)2-酮基-古龍酸的效果最好，其余含量對氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮基-古龍酸和生長的促 進(jìn)作用弱于加入lmg/mlGSH的促進(jìn)效果，上述不同濃度的GSH加入后72小時2-酮基-古 龍酸產(chǎn)量依次為18.5， 20.13， 43.52， 48.67， 52.35， 42.11， 34.65mg/ml。如圖4所示的生 物量提高的趨勢與圖3中產(chǎn)酸結(jié)果相吻合。上述不同濃度的GSH加入后72的生物量依次 為0.27， 0.27, 0.71， 0.75， 0.81， 0.76， 0.65mg/ml。 實(shí)施例8
加入相同濃度的還原型谷胱甘肽(GSH)對不同接種濃度的氧化葡糖桿菌(CGMCC NO丄110)提高生長速度和產(chǎn)2-酮基-古龍酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌為目標(biāo)菌株，測定不同起始濃度的氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮基-古龍酸能力 的影響。 .
采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基的制備，接下來 第一種情況將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C， 220r/min搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時。
第二種情況將所述種子培養(yǎng)液以體積比為1%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 。C， 220r/min搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
第三種情況將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 'C， 220r/min搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
第四種情況將所述種子培養(yǎng)液以體積比為100%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C， 220r/miri搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
還原型谷胱甘肽(GSH)提高不同濃度氧化葡糖桿菌生長速度和產(chǎn)酸效率的測試。測 定1.0mg/ml GSH的對初始菌體濃度不同的的氧化葡糖桿菌的產(chǎn)酸能力和生物量的影響。結(jié) 果如圖5表明，對不同初始濃度的氧化葡糖桿菌，GSH均有促進(jìn)其產(chǎn)2-酮基-古龍酸的作用，且最終2-酮基-古龍酸產(chǎn)量與初始濃度呈正相關(guān)。圖6中的生物量變化趨勢也表明GSH能
夠促進(jìn)各起始濃度的氧化葡糖桿菌生長，其中生物量與初始濃度正相關(guān)。
實(shí)施例9
在不同發(fā)酵時刻加入相同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖桿菌CGMCC NO丄llO產(chǎn)2-酮基-古龍酸效率和生長速度的測試。
以氧化葡糖桿菌為目標(biāo)菌株，測定在不同發(fā)酵時刻加入相同濃度還原型谷胱甘肽對氧 化葡糖桿菌產(chǎn)酸能力的影響。
采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵，用未加入GSH或發(fā)酵時刻0小時，3小時， 6小時，12小時，24小時，36小時替代實(shí)施例1中的0時刻加入，進(jìn)行測試。
測定該菌株以0， 3， 6， 12， 24， 36小時加入lmg/ml GSH后，2-酮基-古龍酸產(chǎn)量和 生物量變化。如圖7所示，結(jié)果顯示隨著加入GSH的時間的延長，其對氧化葡糖桿菌產(chǎn) 2-酮基-古龍酸和生長的的促進(jìn)作用依次減弱，24小時加入后對產(chǎn)酸和生長的促進(jìn)作用幾乎 消失，不加入GSH和O, 3， 6， 12， 24， 36小時加入1.0mg/ml GSH的72小時時2-酮基-古龍酸產(chǎn)量依次為11.25， 49.48， 41.69， 36.92， 35.05， 10.15， 10.14mg/ml。圖8表明氧化 葡糖桿菌的生物量也呈現(xiàn)與產(chǎn)2-酮基-古龍酸量相同的趨勢。不加入GSH和O， 3， 6， 12， 24， 36小時加入1.0mg/mlGSH的72小時時生物量依次為0.27， 0.81， 0.68, 0.56， 0.52, 0.32， 0.32mg/ml。
權(quán)利要求
1.提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是包括如下步驟(1)種子培養(yǎng)稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-10g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，調(diào)pH為6.5～7.0，121℃滅菌20min，制成種子培養(yǎng)基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接種于所述種子培養(yǎng)基中，28-35℃，160-250r/min搖床振蕩，培養(yǎng)24-48小時，制成種子培養(yǎng)液；(2)發(fā)酵稱取L-山梨糖40-120g，玉米漿10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO31-10g加水至1L，調(diào)pH為6.5～7.5，121℃滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；將所述種子培養(yǎng)液以體積比為5％-15％的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-35℃，160-250r/min搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)48～96小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述巰基 化合物為還原型谷胱甘肽，二硫蘇糖醇，半胱氨酸或輔酶A。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述步驟(1) 為稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO40.2g， CaC03l g加水至1L，調(diào)pH為6.8， 121。C滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養(yǎng)基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養(yǎng)36小時，制成種子培養(yǎng)液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述步驟(2) 為稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO40.5 g， CaC035g 加水至1L，調(diào)pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；將所述種子培養(yǎng)液以體積比為10%的比例，接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C, 220 r/min 搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰 基化合物，使巰基終濃度為3mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的方法，步驟為(1)種子培養(yǎng)將斜面的氧化葡糖桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，制成種子培養(yǎng)液；(2)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)48～96小時，在所述發(fā)酵培養(yǎng)0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。本發(fā)明能提高氧化葡糖桿菌生長速度和產(chǎn)2-酮-L-古龍酸效率，達(dá)到部分取代伴生菌的伴生效果的目的，從而可以減少伴生菌巨大芽孢桿菌的用量，減少培養(yǎng)基的成本，并可以減少污染。
文檔編號C12P7/40GK101603060SQ20091006969
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者宏 儀, 元英進(jìn), 劍 周, 王麗麗, 佳 薛, 倩 馬 申請人:天津大學(xué)