專利名稱：傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物疾病檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種以包含決定羊癢病抗性/敏感性的羊朊蛋 白編碼基因PRNP的第136、 154和171位密碼子為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)的生物制劑，借助實(shí)時(shí)熒 光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR)檢測(cè)體系及其之后的終點(diǎn)讀板 模式，對(duì)PRNP的第136、 154和171位密碼子進(jìn)行檢測(cè)，用來(lái)判定被檢測(cè)羊是否含有傳 染性羊癢病抗性基因，即一種傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備方法和 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羊癢病(scrapie)俗稱"瘙癢病"，屬于傳染性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)的一種，是由羊癢病朊病毒引起成年綿羊和山羊 的一種慢性進(jìn)行性的、致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Stanley BPrusiner. The Prion Diseases. Scientific A鵬rican, 1995， 48-57)。瘙癢是癢病的一個(gè)顯著特征，也是其名字的來(lái) 源。此外，共濟(jì)失調(diào)、麻痹、衰弱、震顫、姿勢(shì)不穩(wěn)、癡呆、知覺(jué)過(guò)敏、行為異常等神 經(jīng)癥狀也是其主要的臨床癥狀，死亡率達(dá)100%。組織病理學(xué)病變局限于祌經(jīng)系統(tǒng)，以神 經(jīng)元空泡化，灰質(zhì)海綿狀病變，神經(jīng)元喪失，神經(jīng)膠質(zhì)和星狀細(xì)胞增生，病原因子PrPsc 蓄積和淀粉樣蛋白斑塊形成為特征，病變通常為兩側(cè)對(duì)稱(Aguzzi A， H印pner FL. Pathogenesis of prion diseases: a progress report. Cell Death and Differentiation. 2000， 7:889-902; Combrisson H， Robasine G， BRUGERE， etal. Urody畫(huà)ic parameters in scrapie-afected ewes and their modifications in the course of the disease. Neurourology and rodynamics. 1998, 17: 555-563)。
羊癢癢病迄今已有270多年的歷史記載，是最早所知的傳染性海綿狀腦病，多發(fā)于 綿羊和山羊，目前在世界許多地方流行。本病最早于18世紀(jì)發(fā)生于英格蘭，以后陸續(xù)傳 入比利時(shí)、法國(guó)、德國(guó)、西班牙、南非、印度、冰島、澳大利亞、新西蘭、加拿大和美 國(guó)。病原主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟和淋巴結(jié)中。不同品種、性別的綿羊和山羊均 可發(fā)病，但以美國(guó)薩福克種羊的敏感性較高。該病通常發(fā)生于病羊污染牧地中放牧的羊 群。以2 4歲的羊多發(fā)?？赏ㄟ^(guò)直接接觸和間接接觸感染。感染母羊的胎盤組織中含有 病原，因此也可通過(guò)胎盤垂直傳播?；疾∧秆蚝凸虻暮蟠?，其癢病的發(fā)病率較高。
本病除羊尸體消瘦和皮膚損傷外沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的病變，其診斷主要依靠臨癥狀2見(jiàn)察
與病理組織學(xué)檢查進(jìn)行確診。此外，本病還可通過(guò)病羊的肉骨粉等傳染給牛，而^g牛感 染為瘋牛病。人食用了被瘋牛病病原污染的食品，可感染上傳染性海綿狀腦病——親斤變 異型克雅氏病(即nvCJD)。因此，羊癢病的診斷是根除和控制瘋牛病、克雅氏病的關(guān)鍵。 羊癢病等傳染性海綿狀腦病病原是一種無(wú)核酸的蛋白質(zhì)侵染顆粒(即朊病毒)，是由宿主神經(jīng)細(xì)胞表面正常的一種唾液酸糖蛋白(PrPc)在三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后形成的異 常蛋白(PrPsc)?，F(xiàn)在認(rèn)為是由于PrPsc侵入后，與正常的PrPc結(jié)合形成PrPsc-PrPc二 聚體，導(dǎo)致PrPc構(gòu)型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPsc-PrPsc，此二聚體解體后產(chǎn)生兩個(gè)PrPsc， 周而復(fù)始，使PrPsc數(shù)量呈指數(shù)增加(Kazuhiko A, Noriyuki N， Suehiro S , etal. Biological and Biochemical Characteristics of Prion Strains Conserved in Persistently Infected Cell Cultures [J]. Journal of virology. 2005， 79: 7104-7122; Thierry B， Carole C, Anne-GaSlle B. Molecular Analysis of the Protease-Resistant Prion Protein in Scrapie and Bovine Spongiform Encephalopathy Transmitted to Ovine Transgenic and Wild-Type Mice [J]. Journal of Virology, 2004， 78: 6243-6251)。
到目前為止，科學(xué)家們利用上述這種特性在檢測(cè)瘋牛病和羊癢病等方面已開(kāi)發(fā)出了 免疫組織化學(xué)方法、免疫轉(zhuǎn)印方法、組織印記法、ELISA方法、western-blot方法等
(Stanley B Prusiner. Prion Diseases and the BSE crisis[J]. Science, 1997， 278(10):245-251; Somerville R, Hamilton S， Fernie K. Transmissible spongiform encephalopathy strain, PrP genotype and brain region all affect the degree of glycosylation of PrPSc[J]. The Journal of general virology, 2005， 86:241-246)。 但上述方法均為死后診斷和確診法，不利于本病的控制和根除。
研究表明，羊癢病的發(fā)生與綿羊朊蛋白編碼基因PRNP遺傳多樣性密切相關(guān)，主要表 現(xiàn)在綿羊PRNP第136、 154和171位密碼子組成的PRNP基因型與綿羊?qū)ΠW病的抗病性相關(guān)
(Vaccaria G, Contea M L， Morellia G， etal. Primer extension assay for prion protein genotype determination in sheep. Mol Cell Probe, 2004, 18(1): 33-37; Westaway D, Zuliani V, Cooper CM, Da Costa M， Neuman S， Jenny AL， Detwiler L， Prusiner SB. Homozygosity for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders sheep susceptible to natural scrapie. Genes Dev, 1994， 8 (8) : 959-969; TranulisMA. Influence of the prion protein gene, Prnp， on scrapie susceptibility in she印.Apmis, 2002， 110(1): 33-43)。在密碼子136， 154和171分別編碼不同的氨 基酸，用代表特定氨基酸的字母來(lái)表示，如一只綿羊的PRNP基因型表示為ARQ/AHQ,表示 密碼子136上編碼的兩個(gè)氨基酸是丙氨酸，密碼子154上編碼的兩個(gè)氨基酸分別是精氨酸 和組氨酸，密碼子171上編碼的兩個(gè)氨基酸都是谷氨酰胺。患有TSE的病羊其基因組中的 三個(gè)等位基因發(fā)生了突變，即136位點(diǎn)上的A突變成了V、 154位點(diǎn)上的R基因突變成了H基 因，171位點(diǎn)上的Q基因突變成了R或H，研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基 因型，具有此基因型的羊基本上不會(huì)感染TSE， VRQ/VRQ基因型綿羊?qū)ρ虬W病最易感，亍旦 不是所有品種的綿羊都有VRQ型PRNP等位基因，例如薩?？搜?，而ARQ/ARQ、 VRQ/ARQ、 AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型，易患TSE(Buschmann A， Luhken G, Schultz J， etal. Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a
5scrapie-resistant genotype (PrPARR/ARR)[J]. The Journal of general virology. 2004， 85(9): 2727-2733; Hamir A N, Kunkle R A, Richt J A， et al. Experimental transmission of sheep scrapie by intracerebral and oral routes to genetically susc印tible Suffolk she印in the United States[J"]. J Vet Diagn Invest. 2005， 17(1): 3-9; Baylis， M. ， and K. M. Mclntyre. 2004 . Transmissible spongiform encephalopathies:scrapie control under new strain[J].Nature, 2004， 432(7019) :810 - 9011)。也有研究稱含有雜合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊癢病，但 是當(dāng)有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴隨時(shí)，羊很少有感染羊癢病的報(bào)道。
由于羊癢病潛伏期長(zhǎng)，不能進(jìn)行血清學(xué)診斷和免疫預(yù)防，病死率極高，是一種嚴(yán)重 危害養(yǎng)殖業(yè)的疾病。因此它不僅限制了國(guó)際間綿羊的貿(mào)易，也給本病的控制與消滅帶來(lái) 了很大難度，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失很大。2003年5月歐盟出臺(tái)了在各成員國(guó)實(shí)施TSE 抗性基因型的研究與篩選工作，其法案號(hào)為(EC) N0999/2001,其中的第14條規(guī)定各成 員國(guó)要根據(jù)歐盟的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)防止、控制和根除羊癢病。而我國(guó)尚沒(méi)有針對(duì)TSE抗性基因的快 速篩選平臺(tái)，現(xiàn)只有通過(guò)測(cè)序技術(shù)來(lái)診斷P脂P基因型，但此方法成本較高且時(shí)間偏長(zhǎng)， 只可用于實(shí)驗(yàn)室分析研究，而不能用于日常檢測(cè)監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種安全、準(zhǔn)確、快速的傳染性羊癢病抗性基 因快速分型檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種傳染性羊癢病抗性基因快 速分型檢測(cè)試劑，包含三對(duì)特異性引物和七條特異性探針，分別針對(duì)羊朊蛋白編碼基因
PRNP的第136、 154和171位密碼子進(jìn)行診斷，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度分別為136bp、 106bp和 97bp，引物和探針序列為
136位密碼子檢測(cè)用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3' A型檢測(cè)探針136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3， V型檢測(cè)探針136-A: 5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3'
154位密碼子檢測(cè)用
上游引物154-1: 5， -GGCAATGACTATGAGGACCG-3，
下游引物154-2: 5， -GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3，
R型檢測(cè)探針154-R: 5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3，
H型檢測(cè)探針5' -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3， 171位密碼子檢測(cè)用上游引物171-1: 5， -CCCAACCAAGTGTACTAC-3'
下游引物17卜2: 5' -TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3，
R型檢測(cè)探針171-R: 5， -FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
H型檢測(cè)探針171-H: 5' -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3'
Q型檢測(cè)探針171-Q: 5' -VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3'。 所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑的制備方法，包括以下步驟 (1)選擇決定著對(duì)羊癢病抗性/敏感性的羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、 154和
171位密碼子基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其中包含136位編碼氨基酸A的基因片段的擴(kuò)
增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為
其中包含136位編碼氨基酸V的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 示，為
TGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGTACCGTTACCCCA ACCAAGT
其中包含154位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，為
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含154位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 示，為
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含171位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示，為
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.6所 示，為
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位編碼氨基酸Q的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.7所 示，為CAGTCAAGCAACACACAGTCA
(2) 根據(jù)各等位基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；
(3) 探針合成同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)按照等位基因分別標(biāo) 記為FAM和VIC， 3，端標(biāo)記MGB;
(4) 經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳條件。
所述(4)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為10ixmol/L， 20wL 體系中加入2uL引物及0.5yL探針，探針的特異性使其可區(qū)分等位基因，用于羊癢病 抗性/敏感性基因分型。
所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備在羊癢病抗性基因分型方 面及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是研究建立特異、敏感、安全、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法，在檢 疫、診斷、流行病學(xué)研究具有重要意義。通過(guò)抽取少量羊血即可對(duì)羊癢病的抗性基因進(jìn) 行檢測(cè)，達(dá)到了活體監(jiān)測(cè)的目的，而且整個(gè)過(guò)程只需兩小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，這 不但有利于我國(guó)申請(qǐng)無(wú)瘋牛病國(guó)家的認(rèn)證認(rèn)可工作，同時(shí)可為我國(guó)動(dòng)物及其產(chǎn)品的進(jìn)出 口提供有利的科學(xué)依據(jù)。另外，也可縮短我國(guó)與西方先進(jìn)國(guó)家間的技術(shù)差距，打破西方 國(guó)家設(shè)置的技術(shù)壁壘，建立我國(guó)的防范措施和技術(shù)壁壘，杜絕敏感性基因型種羊的引入， 從根本上防止此病的傳入。再者，它還有利于動(dòng)物產(chǎn)品及飼料的安全控制，保障人類健 康和公共衛(wèi)生環(huán)境。


圖1為重組質(zhì)粒pET-P54及不同病毒DNA實(shí)時(shí)熒光PCR曲線。 圖2為標(biāo)準(zhǔn)模板熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。 圖3為ASFV P54標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
一種傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑，包含三對(duì)特異性引物和七條^寺異'性 探針，分別針對(duì)羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、 154和171位密碼子進(jìn)行診斷，矛廣增 目標(biāo)長(zhǎng)度分別為136bp、 106bp和97bp,引物和探針序列為
136位密碼子檢測(cè)用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3， A型檢測(cè)探針136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3， V型檢測(cè)探針136-A: 5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3，
154位密碼子檢測(cè)用
上游引物154-1: 5， -GGCAATGACTATGAGGACCG-3'下游引物154-2: 5， -GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3，
R型檢測(cè)探針154-R: 5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3，
H型檢測(cè)探針154-H: 5， -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3' 171位密碼子檢測(cè)用
上游引物17卜1: 5， -CCCAACCAAGTGTACTAC-3，
下游引物171-2: 5， -TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3，
R型檢測(cè)探針171-R: 5， -FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
H型檢測(cè)探針171-H: 5， -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3，
Q型檢測(cè)探針171-Q: 5， -VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3，。
所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑的制備方法，由以下步驟組成 (1)選擇決定著對(duì)羊癢病抗性/敏感性的羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、 154和 171位密碼子基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其中包含136位編碼氨基酸A的基因片段的擴(kuò) 增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為
其中包含136位編碼氨基酸V的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，為
TGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGTACCGTTACCCCA ACCAAGT
其中包含154位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，為
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含154位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.4所 示，為
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含171位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5戶"
示，為
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 6朋: 示，為CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位編碼氨基酸Q的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.7所 示，為
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
(2) 根據(jù)各等位基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；
(3) 探針合成同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)按照等位基因分別標(biāo) 記為FAM和VIC， 3，端標(biāo)記MGB;
(4) 經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳條件。
所述(4)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為10ymol/L， 20uL 體系中加入2wL引物及0.5uL探針，探針的特異性使其可區(qū)分等位基因，用于羊癢病 抗性/敏感性基因分型。
所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備在羊癢病抗性基因分型方 面及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。 實(shí)施例l羊基因組DNA的提取
發(fā)明中使用的各基因型羊基因組DNA模板為意大利Institut zooprofilattic speriraen DELLA SARDEGNA惠贈(zèng)，按照Roche旋轉(zhuǎn)柱DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA。
實(shí)施例2 PRNP等位基因第136、 154和171位密碼子檢測(cè)引物及探針的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)(GenBank收錄號(hào)AY907689) P脂P基因序列設(shè)計(jì)PRNP編碼區(qū)第136位(A)密碼 子的MGB探針及引物；根據(jù)(GenBank收錄號(hào)AY907685) PRNP基因序列設(shè)計(jì)P脂P編碼 區(qū)第136位(V)密碼子的MGB探針及引物；根據(jù)(GenBank收錄號(hào)AY907685) PRNP基因 序列設(shè)計(jì)PRNP編碼區(qū)第154位(R)密碼子的MGB探針及引物；根據(jù)(GenBank收錄號(hào) AY822666. 1) PRNP基因序列設(shè)計(jì)PRNP編碼區(qū)第154位(H)密碼子的MGB探針及引物；根 據(jù)(GenBank收錄號(hào)AB373795. 1) PRNP基因序列設(shè)計(jì)PRNP編碼區(qū)第171位(R)密碼子的 MGB探針及引物；根據(jù)(GenBank收錄號(hào)AY907683) PRNP基因序列設(shè)計(jì)PRNP編碼區(qū)第 171位(H)密碼子的MGB探針及引物;根據(jù)(GenBank收錄號(hào)AY907685) PRNP基因序列 設(shè)計(jì)P脂P編碼區(qū)第171位(Q)密碼子的MGB探針及引物;探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)按照 等位基因分別為標(biāo)記為FAM和VIC， 3'端標(biāo)記MGB，探針及引物序列如下
136位密碼子檢測(cè)用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3， A型檢測(cè)探針136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3'V型檢測(cè)探針136-A: 154位密碼子檢測(cè)用
上游引物154-1: 5， 下游引物154-2: 5，
R型檢測(cè)探針154-R: H型檢測(cè)探針154-H:
171位密碼子檢測(cè)用
上游引物171-1: 5' 下游引物171-2: 5'
R型檢測(cè)探針171-R: H型檢測(cè)探針:171-H: Q型檢測(cè)探針171-Q:
5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3，
-GGCAATGACTATGAGGACCG-3'
-GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3'
5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3'
5' -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3'
-CCCAACCAAGTGTACTAC-3'
-TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3'
5，-層-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
5' -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3'
5， —VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3'
所有引物委托invitrogen公司合成，探針委托Applied Biosystems合成c
實(shí)施例3目的基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增
基因擴(kuò)增預(yù)混液Taqman Universal PCR MasterMix購(gòu)于Applied Biosystems i式劑 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是Roche LightCycler 480型，熒光PCR管(板)和管蓋(封 口膜)購(gòu)自Roche公司。
1 PCR反應(yīng)混合液的配制
以實(shí)施例1中提取的DNA為模板，以實(shí)施例2中設(shè)計(jì)的各種熒光引物及探針進(jìn)行熒 光定量PCR反應(yīng)，選取20 P L如下PCR反應(yīng)體系
模板DNA: 2uL;上游引物(lOumol/L) : 2uL;下游引物(10umol/L) : 2nL; FAM標(biāo)記的探針(lOuraol/L) : 0. 5uL; VIC標(biāo)記的探針(10ixmol/L) : 0. 5uL; 2Xmastermix: lOixL;雙蒸水補(bǔ)齊。
136的上下游引物及136A和136V探針為一個(gè)檢測(cè)體系，用來(lái)鑒別136等位基因密碼 子A和V; 154的上下游引物及154R和154H探針為一個(gè)檢測(cè)體系，用來(lái)鑒別154等位基 因密碼子R和H; 171的上下游引物及171R和171H探針為一個(gè)檢測(cè)體系，用來(lái)鑒別171 等位基因密碼子R和H; 171的上下游引物及171R和171Q探針為一個(gè)檢測(cè)體系，用來(lái)鑒 別171等位基因密碼子R和Q， 171的兩個(gè)檢測(cè)體系相結(jié)合，可判定被測(cè)羊的171 <立密碼 子(R/H/Q)類型。
2 PCR反應(yīng)程序?yàn)?50°C 反應(yīng)10min; 95°C 預(yù)變性10min;95°C 變性15s，
60°C 退火延伸lmin，共40個(gè)循環(huán)；
退火、延伸階段采集數(shù)據(jù)。
3結(jié)果分析
在Roche公司提供的分析軟件Roche LightCycler 480中輸入兩個(gè)檢測(cè)通道 483-533nm和523-568nm，分別檢測(cè)FAM和VIC信號(hào)。以136位檢測(cè)體系為例，若樣品種 含有如SEQ ID NO. 1所示序列，在483-533nm通道(FAM)即可檢測(cè)出陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，亦 說(shuō)明該被測(cè)樣本含有編碼136A的等位基因，同樣，若樣品種含有如SEQ IDN0.2所示序 列，在523-568nm通道(VIC)即可檢測(cè)出陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，亦說(shuō)明該被測(cè)樣本含有編碼136V 的等位基因。從圖1和圖2可見(jiàn)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線。熒光 定量動(dòng)力學(xué)曲線基線平整，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生；對(duì)數(shù)區(qū)較明顯，斜率大且固定(為平行 線)，為較理想的擴(kuò)增曲線，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針完全符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的要求。圖1中擴(kuò)增曲線從右邊起由上至下依次對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品136AA， 154RR， 171RR， 154RH， 171RQ， 136VA, 171RH, 136VV， 154冊(cè)，171HQ， 171HQ, 171QQ， 171HH及陰性對(duì)照；圖2 中擴(kuò)增曲線從右邊起由上至下依次對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品154HH, 136VV， 171HQ, 171QQ, 171HH, 154RH， 171HQ， 171RQ， 136VA， 171朋，136AA， 154RR， 171RR及陰性對(duì)照。
實(shí)施例4羊癢病抗性基因的分型 1檢測(cè)底物的制備
以實(shí)施例3的擴(kuò)增產(chǎn)物為檢測(cè)底物。 2檢測(cè)條件
61°〇預(yù)熱ls， 6(TC連續(xù)讀板，同時(shí)收集5個(gè)信號(hào)，收集波長(zhǎng)為483-533nm通道(FAM) 和523-568nm通道(VIC)。 3結(jié)果分析
在Roche公司提供的分析軟件Roche LightCycler 480中選擇EndPoint Genotyping 模式，在483-533咖通道和523-568nm通道連續(xù)收集信號(hào)，機(jī)器將根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)將兩 種熒光信號(hào)進(jìn)行比較計(jì)算，自動(dòng)分型。結(jié)果如圖3所示，橫坐標(biāo)表示483-533nm通道檢 測(cè)到的熒光值，也就是FAM標(biāo)記對(duì)應(yīng)的探針?biāo)鶛z測(cè)到的等位基因密碼子熒光值，g;l坐標(biāo) 表示523-568nra通道檢測(cè)到的熒光值，也就是VIC標(biāo)記對(duì)應(yīng)的探針?biāo)鶛z測(cè)到的等4立基因 密碼子熒光值。靠近橫坐標(biāo)的點(diǎn)2為只能檢測(cè)出FAM熒光信號(hào)的純合子，其對(duì)應(yīng)f示準(zhǔn)品 基因型從左至右依次為136AA， 154HH, 171RR;靠近縱坐標(biāo)的點(diǎn)1為只能檢測(cè)出VIC熒光 信號(hào)的樣品，多為純合子，另外，由于171密碼子需要由兩套檢測(cè)體系才能確定其基因 型，故均標(biāo)記VIC熒光染料的探針對(duì)應(yīng)的基因型171HQ也屬于此列，圖中點(diǎn)1對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) 品基因型從上至下依次為171QQ, 136VV， 154HH, 171HQ, 171HQ， 171HH;位于坐標(biāo)軸對(duì) 角線附近的點(diǎn)3對(duì)于FAM和VIC兩種熒光信號(hào)都能檢出，其被檢物為雜合子，圖中對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品基因型從上至下依次為154RH, 136VA, 171RH, 171RQ;圓點(diǎn)4為陰性對(duì)照。
本發(fā)明設(shè)計(jì)使用的引物及探針，建立了快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的傳染性羊
癢病抗性基因分型檢測(cè)體系，可用于傳染性羊癢病抗性基因分型的快速檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間
僅為數(shù)小時(shí)，可用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法，并作為出入境檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)活羊引入的檢
測(cè)項(xiàng)目，以杜絕羊癢病敏感型品種傳入
本發(fā)明以意大利Institut zo叩rofilattic sperimen DELLA SARDEGNA惠贈(zèng)的
PRNP136、 154和171密碼子各種基因型陽(yáng)性模板為對(duì)照，采用終點(diǎn)讀板基因分型模式 (Endpoint Genotyping)，得到基因分型散點(diǎn)圖(見(jiàn)圖3)。各標(biāo)準(zhǔn)品均按其基因型表現(xiàn)
為純合子(136AA、 136VV、 154RR、 154HH、 171RR、 171HH、 171QQ)及雜合子(136VA、
154RH、 171RH、 171RQ和17mQ)，說(shuō)明引物及探針設(shè)計(jì)的特異性完全能夠用于等位基
因分型快速分析。
本研究平臺(tái)的建立，通過(guò)抽取少量羊血即可對(duì)羊癢病的抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到了 活體監(jiān)測(cè)的目的，而且整個(gè)過(guò)程只需兩小時(shí)，不需測(cè)序鑒定基因型所必須進(jìn)行的擴(kuò)增克 隆等步驟，不但降低了生物危害性，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，這不但有利于我國(guó)申請(qǐng) 無(wú)瘋牛病國(guó)家的認(rèn)證認(rèn)可工作，同時(shí)可為我國(guó)動(dòng)物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口提供有利的科學(xué)依 據(jù)。另外，也可縮短我國(guó)與西方先進(jìn)國(guó)家間的技術(shù)差距，打破西方國(guó)家設(shè)置的技術(shù)壁壘， 建立我國(guó)的防范措施和技術(shù)壁壘，杜絕敏感性基因型種羊的引入，從根本上防止此病的 傳入。再者，它還有利于動(dòng)物產(chǎn)品及飼料的安全控制，保障人類健康和公共衛(wèi)生環(huán)境。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以 在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
序列表(SEQUENCE LISTING) 〈110〉天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心 〈120>傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用 〈160〉 7
〈170〉 Paiteritln version 3. 5
〈210〉 1 〈211〉 893 〈212〉 腿〈213> 綿羊(0vis aries)
〈220>
<221〉 allele
〈222〉 (428). . (563)
<223> 136位密碼子編碼丙氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AY907689
〈400〉 1
tgctgcagac tttaagtgat ttttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatgg鄉(xiāng)tggctggggc caacctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tggg犯gtgc ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caamgggggg caagtgtgat 780cctsttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840 ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
<210> 2
<211> 893
〈212〉 DNA
〈213〉 綿羊(Ovis aries)
〈220〉
〈221〉 allele <222> (428). . (563)
<223> 136位密碼子編碼纈氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AY907685
〈400〉 2
tgctgcagac tttaagtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgacca朋a cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c認(rèn)ctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc CEitggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtc卿g 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgt 480
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagca朋t 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caaagggggg caagtgtgat 780
cctcttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840
ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 3
〈211〉 893
〈212〉 腿
〈213〉 綿羊(Ovis aries)
<220>
〈221〉 allele
〈222〉 (505)..(612)
〈223〉 154位密碼子編碼精氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AY907685
〈400〉 3
tgctgcagac ttt幼gtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtxagc cccatggagg tggctggggc caacctcatg gaggtggctg 300gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccUggt ggctacatgc tgggaagtgt ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caaagggggg caagtgtgat 780
cctcttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840
ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 4
<211〉 176
〈212〉 腿
〈213> 綿羊(Ovis aries)
〈220〉
〈221〉 allele 〈222〉 (54). (159)
〈223〉 154位密碼子編碼組氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AY822666. 1 〈400〉 4
ggccttggtg gctacatgct gggaagtgcc atgagcaggc ctcttataca ttttggcaat 60gactatgagg accgttacta tcatgaaaac atgtaccgtt accccaacca agtgtactac 120 agactagtgg atcagtatag taaccagaac aactttgtgc atgactgtgt caacat 176
<210> 5
〈211〉 402
〈212〉 腿
<213> 綿羊(Ovis aries)
<220>
〈221〉 allele 〈222〉 (201).. (297)
<223〉 171位密碼子編碼精氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AB373795. 1
<400〉 5
ggtcaaggtg gtagccacag tcagtggaac aagcccagta agccaaaaac caacatgaag. 60
catgtggcag gagctgctgc agctggagca gtggtagggg gccttggtgg ctacatgctg 120
ggaagtgcca tgagcaggcc tcttatacat tttggcaatg actatgagga ccgttactat 180
cgtgaaaaca tgtaccgtta ccccaaccaa gtgtactaca gaccagtgga tcggtatagt 240
aaccagaaca actttgtgca tgactgtgtc aacatcacag tcaagcaaca cacagtcscc 300
accaccacca agggggagaa cttcaccgaa actgacatca agataatgga gcgagtggtg 360
gagcaaatgt gcatcaccca gtaccagaga gaatcccagg ct 402
〈210〉 6 〈211> 893 <212> DNA〈213〉 綿羊(0vis aries)
〈220>
〈221〉 allele 〈222> (553).. (650)
〈223〉 171位密碼子編碼組氨酸的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào):AY907683
<400〉 6
tgctgcagac tttaagtgat ttttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c認(rèn)ctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtc卿g 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaa犯accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgc ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcattata gtaacceLgaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg朋actgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caacgggggg caagtgtgat 780cctgttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840 ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 7
<211〉 893
〈212〉 腿
<213〉 綿羊(0vis aries)
<220〉
<221〉 allele <222> (553).. (650)
〈223〉 171位密碼子編碼谷酰胺的朊蛋白基因，序列來(lái)自GenBank，編號(hào)AY卯7685
〈400〉 7
tgctgcagac tttaagtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c朋cctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgt 480
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600caactttgtg catgactgtg tc犯catcac agtcaagcaa cscacagtca ccaccaccac 660caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg g兆cg3gtgg tggsgca犯t 了20gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac c犯agggggg caagtgtgat 780cctcttt"tct tcccctcctg tga"tcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 89權(quán)利要求
1、一種傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑，其特征在于，包含三對(duì)特異性引物和七條特異性探針，分別針對(duì)羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、154和171位密碼子進(jìn)行診斷，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度分別為136bp、106bp和97bp，引物和探針序列為136位密碼子檢測(cè)用上游引物136-15’-CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3’下游引物136-25’-ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3’A型檢測(cè)探針136-A5’-FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3’V型檢測(cè)探針136-A5’-VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3’154位密碼子檢測(cè)用上游引物154-15’-GGCAATGACTATGAGGACCG-3’下游引物154-25’-GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3’R型檢測(cè)探針154-R5’-FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3’H型檢測(cè)探針154-H5’-VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3’171位密碼子檢測(cè)用上游引物171-15’-CCCAACCAAGTGTACTAC-3’下游引物171-25’-TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3’R型檢測(cè)探針171-R5’-FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3’H型檢測(cè)探針171-H5’-VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3’Q型檢測(cè)探針171-Q5’-VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3’。
2、權(quán)利要求1所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑的制備方法，其特征 在于，包括以下步驟(1)選擇決定著對(duì)羊癢病抗性/敏感性的羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、 154和 171位密碼子基因序列保守片段為靶目標(biāo)，其中包含136位編碼氨基酸A的基因片段的擴(kuò) 增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，為其中包含136位編碼氨基酸V的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 示，為其中包含154位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，為-ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC其中包含154位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID N0.4所 示，為ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC其中包含171位編碼氨基酸R的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示，為CAGTCAAGCAACACACAGTCA其中包含171位編碼氨基酸H的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所 示，為CAGTCAAGCAACACACAGTCA其中包含171位編碼氨基酸Q的基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所 示，為CAGTCAAGCAACACACAGTCA(2) 根據(jù)各等位基因特點(diǎn)和引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物和探針；(3) 探針合成同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)按照等位基因分別標(biāo) 記為FAM和VIC， 3'端標(biāo)記MGB;(4) 經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定反應(yīng)最佳條件。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑的制備方法，其 特征在于，所述(4)中的反應(yīng)最佳條件為上下游引物及探針的使用濃度為10ixmol/L， 20y L體系中加入2 u L引物及0. 5 y L探針，探針的特異性使其可區(qū)分等位基因，用于羊 癢病抗性/敏感性基因分型。
4、 權(quán)利要求1所述的傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑在羊癢病抗性基因分 型方面及生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種傳染性羊癢病抗性基因快速分型檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用，設(shè)計(jì)合成了三套特異性的引物及Taqman探針，分別針對(duì)決定羊癢病抗性/敏感性的羊朊蛋白編碼基因PRNP的第136、154和171位密碼子進(jìn)行檢測(cè)，用來(lái)判定被檢羊是否含有傳染性羊癢病抗性基因。本發(fā)明借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系及其之后的終點(diǎn)讀板模式，建立了一種快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的基因分型方法，檢測(cè)時(shí)間僅為數(shù)小時(shí)。借助該方法可建立一整套完善的預(yù)警監(jiān)測(cè)體系來(lái)預(yù)防羊癢病的發(fā)生，可用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法，并作為出入境檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)活羊引入的檢測(cè)項(xiàng)目，以杜絕羊癢病敏感型品種傳入。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101671727SQ20091007081
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者琳 李, 欒慎順, 妍 肖, 董志珍, 蔡國(guó)瑞, 陳本龍 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心