專利名稱：膽汁三烯結(jié)合蛋白(bbp)的序列優(yōu)化和高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白分子的制備方法，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種具有高效表達(dá) 活性的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的制備方法。
背景技術(shù)：
某些有毒有害小分子化合物如農(nóng)藥、獸藥的殘留等，是產(chǎn)生食品安全問(wèn)題的主要 因素，如何制備特異識(shí)別的小分子化合物的配體已經(jīng)成為研究關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究發(fā) 現(xiàn)，膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子(bilin binding protein, BBP)對(duì)小分子具有較強(qiáng)的結(jié) 合能力，具有重要的生物學(xué)功能，可用于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏次級(jí)代謝產(chǎn)物。BBP是以小分子受體 蛋白-脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)為骨架的蛋白，蛋白質(zhì)折疊成β桶狀，提供了一個(gè)疏水 的口袋結(jié)構(gòu)，以便結(jié)合和運(yùn)輸疏水性小分子。與抗體相比，BBP結(jié)合小分子有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn) BBP分子骨架構(gòu)象更適合與小分子物質(zhì)結(jié)合，而抗體是免疫系統(tǒng)針對(duì)大分子物質(zhì)應(yīng)激產(chǎn)生 的蛋白，其構(gòu)象上更適合與大分子物質(zhì)結(jié)合；BBP片段比抗體小，通過(guò)基因工程更容易對(duì)其 進(jìn)行操作，無(wú)需免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合等復(fù)雜制備過(guò)程；BBP 口袋型識(shí)別位點(diǎn)具有很大的分子 接觸表面，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，避免了免疫球蛋白輕重鏈的非共價(jià)鍵結(jié)合。Gchlehuber S, Skerra A. Tuning ligandaffinity, specificity, and folding stability of an engineered lipocalin variant-a so-called'anticalin'-using a molecular random approach[J]. biophys chem, 2002,96 (2-3) :213-228) Beste 等以 BBP 為骨架基礎(chǔ)，結(jié)合噬菌體表面 展示技術(shù)，構(gòu)建了隨機(jī)突變肽庫(kù)，篩選到3個(gè)對(duì)熒光素有特異吸附的突變體，親和力高達(dá) 35. 2nmol/L，且交叉反應(yīng)率低。BBP最初是從大菜粉蝶(Pieris brassicae)中得到的，其提 取困難，成本高，提取效率低。因此，利用基因工程方法高效表達(dá)BBP分子，對(duì)篩選小分子模 擬抗體的研究具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述野生型BBP制備的缺點(diǎn)，降低其制備成本并有效保持其活性，本發(fā)明 提供了一種制備并純化膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)的方法及其多克隆抗體的制備方法。本發(fā) 明的新型膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子，是優(yōu)化后的野生型的BBP分子，其序列與原序列相 比，57個(gè)堿基被替換，序列中所有的大腸桿菌低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。與野生 型BBP相比，優(yōu)化后的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)基因更適合在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)；本 發(fā)明公開(kāi)了一種具有序列表中序列1所示新型膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子本發(fā)明還公開(kāi) 了一種編碼新型膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的基因，該基因具有序列表中序列2所示的 核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的制備方法。該方法包括 如下步驟(1)對(duì)野生型BBP序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成；(2) PCR合成優(yōu)化后BBP序列并與表達(dá)載體連接構(gòu)建pBV220_BBP表達(dá)載體；(3)純化蛋白用BCA方法進(jìn)行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京科學(xué)出版社，2000，51-54.)。；(4)膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的分離純化；制備膽汁三烯結(jié)合蛋白編碼基因可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，優(yōu)選PCR法。優(yōu) 選PCR重疊引物延伸法(黃培堂等譯，J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第 三版，pl091-1113)。所述表達(dá)載體可以是常規(guī)的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，如商業(yè)pET系列載體 和國(guó)內(nèi)廣泛使用的PBV220載體，優(yōu)選pBV220載體。大腸桿菌可以是適合原核系統(tǒng)表達(dá)的 配套大腸桿菌，當(dāng)使用PET類載體，宿主菌優(yōu)選E. coli BL21 (DE3)系列；當(dāng)使用pBV220載 體時(shí)宿主菌可選擇多種商業(yè)上提供的大腸桿菌，優(yōu)選E. coli DH5ci。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌 偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成BBP序列的引物，PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的BBP序列克隆至載體pEasy-T3 上，構(gòu)建克隆載體pEasy-BBP。測(cè)序后，將該序列克隆至表達(dá)載體pBV_220并轉(zhuǎn)化至DH5 α。 在熱激誘導(dǎo)下，在大腸桿菌DH5 α中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，經(jīng)分離純化，獲得了電泳純的膽汁三 烯結(jié)合蛋白(BBP)分子。純化蛋白用BCA方法進(jìn)行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù) 手冊(cè)[Μ].北京科學(xué)出版社，2000，51-54.)。經(jīng)熱激誘導(dǎo)后，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示攜帶重組質(zhì)粒pBV-220BBP的表達(dá)菌株在分子量21KD的位 置上產(chǎn)生一條特異蛋白條帶，與BBP蛋白分子量相符，而對(duì)照菌株中無(wú)此相應(yīng)蛋白條帶。凝 膠分析表明，PBV-220BBP表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的60%以上。本研究首次成功合成了優(yōu)化 后的BBP的序列，且我們所構(gòu)建的表達(dá)載體pBV-220BBP表達(dá)量高，經(jīng)純化后純度可達(dá)95% 以上。


圖1為BBP序列的優(yōu)化前后比較圖2為1. 5%凝膠電泳后回收純化PCR產(chǎn)物圖3為1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)優(yōu)化后bbp序列的PCR產(chǎn)物圖4為PCR擴(kuò)增后陽(yáng)性克隆圖5為bbp基因成功連接T載體圖6為轉(zhuǎn)化子菌落擴(kuò)增產(chǎn)物圖7為BamH I與EcoR I酶切表達(dá)載體pBV_220BBP擴(kuò)增產(chǎn)物 圖8為重組質(zhì)粒pBV-220BBP的表達(dá)菌株的表達(dá)產(chǎn)物 圖9為BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后BBP蛋白濃度 圖10為SDS-PAGE鑒定復(fù)性、純化后的BBP蛋白
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一膽汁三烯結(jié)合蛋白突變基因構(gòu)建、表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及表達(dá)。1.材料與方法1.1 材料1.1.1質(zhì)粒與菌株克隆載體pEasy-T3購(gòu)自北京全式金公司；表達(dá)載體pBV_220、大腸桿菌E. coli DH5a由本實(shí)驗(yàn)保存。1.1. 2酶及主要試劑膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、BamH I.EcoR I及T4DNA Ligase均購(gòu)自!Iomega 公司；Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京TIANGEN公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自TaKaRa公司。1.2 方法1. 2. IBBP序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢 索到的BBP基因序列，全部選用大腸桿菌偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成BBP序列的引物1-12 (表 1)。為了便于蛋白表達(dá)，引物FPBV和RPBV引入了 EcoR I和BamH I的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在3， 末端引入6XHis標(biāo)簽以利于進(jìn)一步純化。表1.互為重疊的寡聚核苷酸引物
權(quán)利要求
1.一種膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子，其特征在于優(yōu)化后的BBP序列與原序列相比，57 個(gè)堿基被替換，序列中所有的大腸桿菌低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子，其特征在于具有序列表中序列1 所示的堿基序列。
3.編碼權(quán)利要求1的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的基因，其特征在于具有序列表中 序列2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的制備方法，其特征在于包括 如下步驟(1)對(duì)野生型BBP序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成；(2)PCR合成優(yōu)化后BBP序列并與表達(dá)載體pBV-220連接，構(gòu)建pBV_220BBP表達(dá)載體；(3)在大腸桿菌DH5ci中進(jìn)行高效表達(dá)；(4)膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子的分離純化；
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于步驟( 所述表達(dá)載體是PBV220。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于步驟C3)所述大腸桿菌是E.coli DH5ci。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)分子。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，以野生型膽汁三烯結(jié)合蛋白基因序列為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)并合成優(yōu)化BBP序列的引物，PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的BBP序列與表達(dá)載體連接、在大腸桿菌中高效表達(dá)、純化等步驟，獲得了功能表達(dá)的BBP蛋白分子。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102040657SQ20091007095
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者孫思明, 寧保安, 王彩紅, 王紅勇, 高志賢 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所