專利名稱：一種大量產(chǎn)生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株大量產(chǎn)生β-聚蘋果酸的誘變菌株 出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸[Poly (malic-acid)或Poly malate，簡稱為PMLA]是以蘋果酸為唯一單 體的均聚高分子聚合物，是一種新型的完全生物降解性高分子材料。該種材料降解的產(chǎn)物 無毒無害，不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，近年來這種高分子材料的開發(fā)研究得到了飛速發(fā)展。 PMLA主要有三種結(jié)構(gòu)S卩α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人體內(nèi)的只有β型PMLA。 作為一種脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、 無免疫原性和可化學(xué)衍生性，在藥物方面具有很強(qiáng)的用途，可以作為藥物載體用于心血管 及腦腫瘤方面的研究，還可作為微膠囊材料、生物醫(yī)學(xué)材料如手術(shù)縫合線及傷口、燒傷治療 的繃帶等生物醫(yī)學(xué)材料，直接用于人體，還可用于化妝產(chǎn)品及食品包裝等材料。盡管早在20世紀(jì)60年代晚期就已發(fā)現(xiàn)聚蘋果酸，但一直到20年后當(dāng)它從幾種生 物中分離出來時才受到了重視。1969年Shimada等發(fā)現(xiàn)一種由蘋果酸組成的高分子化合 物能抑制圓弧青霉(Penicillium cyclopium)的酸性蛋白酶，當(dāng)時酯鍵中的羧基位置還沒 有確定，沉寂幾年后，聚蘋果酸在黏菌(physarumpolyc印halum)中被重新發(fā)現(xiàn)。而后幾年 聚蘋果酸的發(fā)展幾乎處于停滯期，1989年Fischer等在黏菌(physarum polycephalum)中 再次發(fā)現(xiàn)聚蘋果酸它是DNA聚合酶α的抑制劑。迄今為止，以Shimada，F(xiàn)ischer, Holler et al，Lee等為代表的國外學(xué)者對PMLA的性能，合成和應(yīng)用做了較深入地研究，而我國 在這方面的研究相對較少，直到近幾年才有學(xué)者對聚蘋果酸的合成與性能做了基礎(chǔ)性的研 究。因此加強(qiáng)聚蘋果酸的研究，構(gòu)建可降解生物高分子的一個研究平臺，具有重要的理論價 值和應(yīng)用價值。聚蘋果酸的合成方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法兩種?；瘜W(xué)合成法又分為直 接聚合和開環(huán)聚合兩種。直接聚合法雖然步驟簡單，產(chǎn)物分離提純?nèi)菀?，產(chǎn)率較高，只是聚 蘋果酸分子量低，反應(yīng)溫度較高，多為Y "PMLA,實(shí)際應(yīng)用價值較低，而且催化劑有毒；開環(huán) 聚合法合成產(chǎn)物雖以聚蘋果酸為主，但合成過程步驟較多產(chǎn)率低，中間產(chǎn)物分離提純 繁瑣；生物途徑制備的聚蘋果酸主要是通過微生物發(fā)酵合成，生物合成PMLA具有突出的優(yōu) 點(diǎn)，產(chǎn)物均為β型、分子量高、生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)物純度較高，微生物發(fā)酵得到的PMLA分子 量可達(dá)200 760kDa，而化學(xué)法合成的分子量最多為174kDa，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)PMLA產(chǎn)量 不高，而且極高的生產(chǎn)成本未能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，以致影響了該物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明利用復(fù)合誘變技術(shù)篩選獲得一株β -聚蘋果酸高產(chǎn)菌株，并對培養(yǎng)基進(jìn)行 優(yōu)化，提高β-聚蘋果酸的產(chǎn)量，有效降低了生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了 聚蘋果酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的方法與常規(guī)誘變方法相比篩選過程大為簡化，工作效率更高的 β “聚蘋果酸高產(chǎn)菌株的誘變方法，有效提高β “聚蘋果酸產(chǎn)率。本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為1.采用多組復(fù)合誘變技術(shù)選育β-聚蘋果酸高產(chǎn)菌株(1)選擇生長良好的β -聚蘋果酸生產(chǎn)菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水 洗下孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、 6、7、8min，將菌懸液梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)，計(jì)算致死率；(2)根據(jù)(1)致死率選擇高、中、低三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKB016的 孢子懸浮液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把(2)三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)；(4)將(3)中的誘變菌株接種到以琥珀酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(5)將(4)中的種子液以10%接種量接種到以檸檬酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中
培養(yǎng)；(6)將(5)中的種子液以10%接種量接種到以醋酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培 養(yǎng)；(7)取(6)中的種子液接種到含CaCO3的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基中 菌落大濕潤、色澤黑亮、透明圈明顯的菌株，即得高產(chǎn)聚蘋果酸誘變菌株TKPM00006(該菌 株于2009年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號 CGMCC No. 3337 ；分類命名出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；保藏單位地址北京 市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)。2.出芽短梗霉TKPM00006的培養(yǎng)方法為(1)菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006 轉(zhuǎn)接至 PDA 斜面培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)3 5d ；(2)種子培養(yǎng)選取生長良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃 度約IO6個/mL的孢子懸浮液，按10% (ν/ν)接種量接種裝有IOOmL液體種子培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中，25°C，200r/m條件下培養(yǎng)2 3d，制得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將(2)中的種子培養(yǎng)液以8 10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng) 基中，在24 30°C下，200r/m振蕩培養(yǎng)7 12d;3.出芽短梗霉TKPM00006所用到的培養(yǎng)基為(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, pH 4. 0 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 8%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨(dú) 滅菌)，pH 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 12%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 · 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0· 05%，CaCO3 3% (單獨(dú)滅菌)，pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(4)選擇培養(yǎng)基
①3% 琥珀酸，丁二酸銨 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨(dú)滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；②3% 檸檬酸，丁二酸銨 0. 3 %，丁二酸 0. 2 %，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨(dú)滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；③3% 醋酸，丁二酸銨 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 3% (單獨(dú)滅菌)， pH 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(5)初篩培養(yǎng)基PDA+0. 5 % CaC03 (分開滅菌)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是采用該誘變方法降低了篩選的盲目性，有效 簡化了篩選過程，同時優(yōu)化了高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，大大提高了誘變育種的工作效率。 并且篩選出的高產(chǎn)菌發(fā)酵液為乳黃色，省卻了活性炭除黑色素步驟，有利于后續(xù)提取工作， 降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的誘變菌株TKPM00006與常規(guī)β -聚蘋果酸生產(chǎn)菌相比，其β -聚蘋果酸 生產(chǎn)能力更為高，并由此能夠有效提高β “聚蘋果酸的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 制性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1從土壤中篩選出的生產(chǎn)β -聚蘋果酸的菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ100171.菌體形態(tài)該菌株有酵母樣和真菌菌絲體兩種形態(tài)，分泌聚蘋果酸的為酵母狀 細(xì)胞，菌絲體狀細(xì)胞缺少高分子，幼齡營養(yǎng)細(xì)胞橢圓形至檸檬形，數(shù)個菌體可連成桿狀，常 具有節(jié)孢子、厚垣孢子、芽分生孢子。無性繁殖方式多樣，主要類似于酵母菌的多邊芽殖形 式到形成明顯的真菌絲。2.菌落形態(tài)最初粘稠，臟白色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，最終為黑色。菌落質(zhì)地由粘 稠狀到堅(jiān)硬和革狀，菌落邊緣呈明顯的根狀，菌落中心凹陷較為濕潤，若長期培養(yǎng)周邊由乳 白色轉(zhuǎn)為黃褐色。3.培養(yǎng)特征此菌為高耗氧菌，最適溫度為24 30°C，微酸環(huán)境利于生長， PH4. 5 5. 0，180 200r/m下振蕩培養(yǎng)7 12d。發(fā)酵過程中pH呈現(xiàn)先升高后下降的趨 勢，發(fā)酵結(jié)束時PH降至最低。發(fā)酵液顏色有橙黃色、黃褐色、烏青色和黑色，顏色不穩(wěn)定。4.可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、琥珀酸、檸檬酸、醋酸，檸檬酸 鈉、醋酸鈉和油酸等其中之一。5.可以利用的氮源有機(jī)氮蛋白胨、牛肉膏、玉米浸提液等，無機(jī)氮丁二酸銨、硝 酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。上述氮源可單獨(dú)使用也可復(fù)合使用。實(shí)施例2以高產(chǎn)菌株TKPM10017為出發(fā)菌株采用多組復(fù)合誘變技術(shù)篩選菌株 TKPM000061.誘變菌株的獲得
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(1)選擇生長良好的β -聚蘋果酸生產(chǎn)菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水 洗下孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、 6、7、8min，菌懸液梯度稀釋涂平板，于25°C避光培養(yǎng)，計(jì)算致死率；(2)選擇lmin、3min、5min三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKB016的孢子懸 浮液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，進(jìn)行10倍系列稀釋10—1 10_6， 取10-4、10_5、10-6三個稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，25°C避光培養(yǎng)4 5d ；(4)將上述(3)中混合均勻的誘變菌株混合液接種到以琥珀酸為惟一碳源的發(fā) 酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為3%琥珀酸，0.3%丁二酸銨，0. 04% K2CO3,0.01% KH2PO4, 0. 01% MgSO4. 7H20，5ppm ZnSO4. 7Η20，0· 05%玉米浸出液，2% CaCO3(單獨(dú)滅菌)。將種子液 置于25°C恒溫?fù)u床，200r/m,振蕩培養(yǎng)7d ；(5)將上述(4)中的培養(yǎng)液以10%接種量(ν/ν)接種到以3%檸檬酸為唯一碳源 的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基其余成分同(3)；(6)將上述(5)中的培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種到以3%醋酸為唯一碳源的 發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基其余成分同(3)；(7)取上述(6)中的種子液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-4、10_5、10-6三個稀釋度的菌 懸浮液涂布固體平板，固體培養(yǎng)基成分為PDA+0.5%CaC03(分開滅菌)；25°C倒置培養(yǎng)4 5d ；(8)從上述平板中挑選菌落大、黑亮濕潤、透明圈明顯的菌落，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)，檢測聚蘋果酸產(chǎn)量，結(jié)果篩選出高產(chǎn)菌株TKPM00006。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為12%葡 萄糖，0. 3% 丁二酸銨，0. 2% 丁二酸，0. 04% K2C03,0. 01 % KH2PO4,0. 01 % MgSO4. 7H20，5ppm ZnSO4. 7Η20，0· 05% 玉米浸出液，3% CaCO3 (分開滅菌)，500mL 搖瓶裝液量 150mL,25°C, 200r/m，振蕩培養(yǎng)8d。2.誘變菌株TKPM 00006的特性(1)菌體形態(tài)主要為酵母樣形態(tài)，細(xì)胞橢圓形，大小均勻，數(shù)個菌體可連成桿狀， 芽分生孢子。(2)菌落形態(tài)最初粘稠，乳白色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，最終為黑色。菌落質(zhì)地粘稠 濕潤，圓滑，色澤黑亮，菌落邊緣呈些微的根狀。(3)培養(yǎng)特征25°C，180 200r/m下振蕩培養(yǎng)7 12d，發(fā)酵液顏色穩(wěn)定為乳黃 色，不產(chǎn)黑色素。(4)可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸其中之一。(5)可以利用的氮源丁二酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨及玉米浸提液。上述氮源可單獨(dú)使用也可復(fù)合使用。(6)可以分別以琥珀酸、檸檬酸、醋酸為唯一碳源進(jìn)行生長，并生長良好；實(shí)施例3出芽短梗霉TKPM00006的培養(yǎng)1.培養(yǎng)基的配制(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, ρΗ4· 0 4· 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 8%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO40. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨(dú) 滅菌)，ρΗ 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 12%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ‘ 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (單獨(dú)滅菌)，ρΗ 4. 5，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；2.菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan) TKPM00006轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒 溫培養(yǎng)箱中，25 °C培養(yǎng)3 5d ；3.種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養(yǎng)基的三角瓶 中，于25°C，200r/m下培養(yǎng)2 3d ；4.發(fā)酵培養(yǎng)將3中制得的種子培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C， 200r/m下培養(yǎng)7 12d ；檢測結(jié)果出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵 生產(chǎn)β -聚蘋果酸產(chǎn)量為18. 4士 1. 3g/L.
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權(quán)利要求
一種大量產(chǎn)生β 聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量產(chǎn)生聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉 ΤΚΡΜ10017，其特征在于所述誘變菌株ΤΚΡΜ00006是以從我國寧夏回族自治區(qū)銀川市王太 堡果園土壤中篩選出的β _聚蘋果酸生產(chǎn)菌ΤΚΡΜ10017的基礎(chǔ)上采用多組復(fù)合誘變技術(shù)選 育獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量產(chǎn)生聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉 ΤΚΡΜ00006，其特征在于所述的誘變處理方法為(1)選擇生長良好的β-聚蘋果酸生產(chǎn)菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌種，用無菌生理鹽水洗下 孢子，制做IO6個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射1、2、3、4、5、6、7、 8min，將菌懸液梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)，計(jì)算致死率；(2)根據(jù)(1)致死率選擇高、中、低三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKPM00006的 孢子懸浮液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把(2)三個不同照射時間的菌懸液混合均勻，梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)；(4)將(3)中的混合均勻的誘變菌株混合液10%接種量接種到以琥珀酸為唯一碳源的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(5)將(4)中的種子液以10%接種量接種到以檸檬酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(6)將(5)中的種子液以10%接種量接種到以醋酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(7)取(6)中的種子液接種到含CaCO3的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基中菌落 大濕潤、色澤黑亮、透明圈明顯的菌株，即得高產(chǎn)聚蘋果酸誘變菌株
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大量產(chǎn)生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006 及其培養(yǎng)方法，其特征在于菌株的特征為(1)菌體形態(tài)主要為酵母樣形態(tài)，細(xì)胞橢圓形，大小均勻，數(shù)個菌體可連成鏈狀，芽分 生孢子。(2)菌落形態(tài)最初粘稠，乳白色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，最終為黑色。菌落質(zhì)地粘稠濕 潤，色澤黑亮，菌落邊緣呈些微的根狀。(3)培養(yǎng)特征25°C，180 200r/m下振蕩培養(yǎng)7 12d，發(fā)酵液顏色穩(wěn)定為乳黃色，不產(chǎn)黑色素。(4)可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸其中之一。(5)可以利用的氮源丁二酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨及玉米浸提液。 上述氮源可單獨(dú)使用也可復(fù)合使用。(6)可以分別以琥珀酸、檸檬酸、醋酸為唯一碳源進(jìn)行生長，并生長良好；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大量產(chǎn)生β_聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006 及其培養(yǎng)方法，其特征在于其培養(yǎng)方法為(1)菌種活化將出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) TKPM00006轉(zhuǎn)接至PDA斜面 培養(yǎng)基，于25 °C恒溫培養(yǎng)3 5d ；(2)種子培養(yǎng)選取生長良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃度約 IO6個/mL的孢子懸浮液，按10% (ν/ν)接種量接種到種子培養(yǎng)基中，于25°C，200r/m下培養(yǎng)2 3d，制得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將(2)中的種子培養(yǎng)液以8 10% (ν/ν)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，于25°C，200r/m下振蕩培養(yǎng)7 12d。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大量產(chǎn)生β-聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006及利用該誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，該菌株是以從我國寧夏回族自治區(qū)銀川市王太堡果園土壤中篩選出的β-聚蘋果酸生產(chǎn)菌TKPM10017的基礎(chǔ)上采用多組復(fù)合誘變技術(shù)選育出的高產(chǎn)β-聚蘋果酸的誘變菌株。在優(yōu)化條件下β-聚蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到18.4±1.3g/L。
文檔編號C12P7/62GK101979499SQ200910071018
公開日2011年2月23日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者喬長晟, 徐勇虎, 王鳳榮, 蔣磊, 賈士儒, 鐘堃 申請人:天津科技大學(xué)