專利名稱：：亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基。技術(shù)背景隨著我國亞麻花藥培養(yǎng)研究的不斷進展，花藥培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于亞麻抗性育種領(lǐng)域。利用單倍體細胞繼代培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的高頻率變異，可在細胞水平上篩選各類型突變體。由于產(chǎn)生突變的單倍體，只有一套染色體，所以不產(chǎn)生嵌合體，顯性和隱性的突變形狀同時表達，而且突變形狀穩(wěn)定，可加快抗性育種進程。目前,細胞懸浮培養(yǎng)已在抗性細胞篩選中廣泛應(yīng)用，通過細胞懸浮培養(yǎng)可以得到單細胞群體，在誘變劑和選擇劑作用時比較均勻，不易產(chǎn)生嵌合體。G.Melchers(1959)在金魚草懸浮細胞培養(yǎng)物中得到了溫度突變體.Zenk(1974)從單倍體煙草的細胞懸浮培養(yǎng)物篩選出抗2.4—D的細胞系。在亞麻抗性突變體篩選研究中多采用愈傷組織為篩選材料，由于愈傷組織在突變體篩選過程中，并非所有的細胞都能與培養(yǎng)基直接接觸，從而使細胞不能均勻地受到選擇壓力的作用，不利于突變體的篩選。N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中亞麻花粉愈傷組織分散性不好，雖然細胞增殖速度較快，但獲得的單細胞數(shù)量少，細胞團的比重較大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有在亞麻抗性突變體篩選中多采用愈傷組織為篩選材料，由于愈傷組織在突變體篩選過程中，由于細胞不能全部與培養(yǎng)基直接接觸，從而使細胞不能均勻地受到選擇壓力的作用，不利于突變體的篩選；N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中花粉愈傷組織的分散性不好，雖然細胞增殖速度較快，.但獲得的單細胞數(shù)量少，細胞團的比重較大的問題，提供了一種亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，解決該問題的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基(YHX)由1/2N6大量元素、B/微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中按重量由1/2N6大量元素2186:1mg、Bs微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素120mg、鹽酸吡哆素110mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—Dl.0mg、6—BAO,1mg、蔗糖2040g和余量為蒸餾水合成；合成后培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。1/2Ne大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83mg、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成。B5微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅0.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了1050mg/L的活性炭，不僅可以促進單倍體細胞的發(fā)育，而且可以清除細胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒副作用物質(zhì)。將亞麻花粉愈傷組織轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(YHX)中進行懸浮培養(yǎng)，與其它培養(yǎng)基相比，不僅分散性好，而且獲得的單細胞較多，懸浮培養(yǎng)3天，細胞開始分裂，最終獲得的單倍體胚性細胞色澤鮮黃、細胞分裂旺盛、分散性好和細胞團的比重??；本發(fā)明能大幅度提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。具體實施方式具體實施方式一本實施方式由1/2N6大量元素、Bs微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中的濃度按重量由1/2Ne大量元素2186.1mg、Bf微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素120mg、鹽酸吡哆素l10mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖2040g和余量為蒸餾水合成；合成后培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基是建立單倍體細胞懸浮系的關(guān)鍵因子。具體實施方式二:本實施方式的1/2N6大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83tng、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成；Bs微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅0.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。具體實施方式三本實施方式的與具體實施方式一的不同點在于活性炭的添加量為每升培養(yǎng)基30mg。其它于具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式選擇繼代培養(yǎng)1個半月左右的色澤嫩綠、有小顆粒組成的結(jié)構(gòu)緊密的花粉愈傷組織分別接種到培養(yǎng)基YHX、N6、B5、MS中，每25ml液體培養(yǎng)基中接入35g愈傷組織，放入振蕩培養(yǎng)箱中150次/min，溫度為25°C、在黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)510天，對獲得的細胞懸浮液，通過單層無菌紗布過濾后，再經(jīng)離心機在500rpm/min的條件下收集小細胞團和單細胞。接入到Y(jié)HX中的花粉愈傷組織分散性好、細胞分裂速度快，獲得的單細胞較多。而接入到Ne、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中的花粉愈傷組織分散性不好，雖然細胞增殖速度較快；但獲得的單細胞數(shù)量少，細胞團的比重較大。將從YHX、N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中收集的小細胞團和單細胞分別轉(zhuǎn)入到淺層液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，5天后，轉(zhuǎn)入固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導(dǎo)。15天后，統(tǒng)計亞麻單倍體胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。淺層液體培養(yǎng)基1/2N6+0.5mg/L2.4—D。固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基丄/2N6+2.4—D1.5mg/L+6—BA0.5mg/L表l不同培養(yǎng)基中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1中的實驗數(shù)據(jù)表明亞麻單倍體細胞懸浮培養(yǎng)基(YHX)胚性細胞的誘導(dǎo)率較高，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。權(quán)利要求1、亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于它由1/2N6大量元素、B5微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中按重量由1/2N6大量元素2186.1mg、B5微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素1～20mg、鹽酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量為蒸餾水合成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于1/2Ns大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83mg、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于B5微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅O.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于活性炭的添加量為每升培養(yǎng)基30mg。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單涪體細胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。全文摘要亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基，它涉及亞麻單倍體細胞懸浮系培養(yǎng)基。它解決了N<sub>6</sub>、B<sub>5</sub>、MS懸浮培養(yǎng)基中的花粉愈傷組織分散性不好、單細胞數(shù)量少和細胞團的比重大的問題。本發(fā)明在其每升培養(yǎng)基中的濃度按重量由1/2N<sub>6</sub>大量元素2186.1mg、B<sub>5</sub>微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素1～20mg、鹽酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4-D1.0mg、6-BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量為水合成；合成后培養(yǎng)基的pH值為5.5～6.0。本發(fā)明獲得的單倍體胚性細胞色澤鮮黃、細胞分裂旺盛、分散性好和細胞團的比重??；能大幅度提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。文檔編號C12N5/04GK101531990SQ200910071778公開日2009年9月16日申請日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者宋淑敏申請人:黑龍江省科學(xué)院亞麻綜合利用研究所