專利名稱：一種用于升高血小板的融合蛋白及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術制藥領域，具體涉及一種血小板生成素模擬肽(TMP)及胰島 素樣生長因子IGF-I的融合蛋白工程菌的構建以及融合蛋白的制備。
背景技術：
原發(fā)或繼發(fā)性造血功能障礙，尤其是嚴重血小板減少發(fā)生多、危害重、治療難度 大，如何促進血小板數(shù)量和功能恢復是造血重建領域研究的熱點和難點之一。血小板生成 素(TP0)是巨核細胞增殖、成熟和血小板產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)因子，并且在成熟血小板生成中， TP0的作用強于目前已知的幾種相關造血因子。它通過與其受體c-Mpl結合而刺激巨核細 胞增殖與分化，并促進血小板的生成和釋放，控制循環(huán)血中血小板的數(shù)量和功能。然而作為 一個含300多個氨基酸殘基的蛋白質，它也存在著免疫原性強、制備成本高、不能口服以及 引起副作用等方面的不足。1997年美國的Steven等報道利用噬菌體肽庫篩選到一種與TP0無序列同源性而 具有與其相似功能的模擬肽。體外實驗顯示這段由14個氨基酸構成的短肽與c-Mpl受體 有很高的親和力，具有刺激rhTPO依賴性細胞株Ba/F3/c-mpl的增殖功能。但由于血小板 生成素模擬肽(TMP)是14個氨基酸的短肽，在體內(nèi)不穩(wěn)定，極容易降解，而且不容易用基因 工程的方式制備。與現(xiàn)有的技術相比較，本發(fā)明所提供的融合蛋白其優(yōu)勢在于，融合蛋白中的IGF-I 是一種從血清中發(fā)現(xiàn)的具有促進多種細胞生長功能的活性多肽，由70個氨基酸殘基組成 的單一肽鏈生長因子組成，其一級結構與胰島素有很高的同源性，屬于同一基因家庭，并且 在體內(nèi)體外都具有部分胰島素的代謝調(diào)節(jié)功能。經(jīng)研究表明，IGF是動物生長的直接調(diào)節(jié) 物，能夠刺激多種細胞的增殖與分化，促進蛋白質的合成和結締組織及骨髓的產(chǎn)生。而且 IGF-I還能與一些生長因子合用，可促進相應細胞的分化成熟，例如，IGF-I與紅細胞生成 素合用，能刺激紅細胞的成熟；與單核粒細胞集落刺激因子合用能刺激粒細胞的生成與成 熟。IGF-I刺激RNA，DNA的合成和細胞增殖，特別是對細胞的有絲分裂具有重大意義，其對 骨.肌肉、脂肪組織、肝、腎、腦，的生長都有重要作用。由于IGF-I具有廣譜的促進細胞生長的作用，因此將IGF-I與TMP融合，可通過與 TMP受體c-Mpl結合而刺激巨核細胞增殖與分化，并促進血小板的生成和釋放，加強TMP促 進血小板生成作用。本發(fā)明所提供的融合蛋白分子量小，利用生物技術方法生產(chǎn)成本低，穩(wěn) 定性高，可以通過靜脈、皮下、肌肉、腹腔注射等途徑給藥，與天然TP0比較，具有更好的升 血小板的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白，它由TMP及胰島素樣生長因子IGF-I組成。本發(fā)明的融合蛋白其主體部分包括兩部分，其中TMP的氨基酸具有SEQID NO :1序 列；胰島素樣生長因子IGF-I多肽區(qū)具有SEQ ID NO 2序列。的兩個主體部分保持各自的完整結構，所述的TMP與胰島素樣生 長因子IGF-I多肽區(qū)之間用連接肽進行連接，優(yōu)選的所述的連接肽由0-10個氨基酸殘基組 成，更優(yōu)選0-5個氨基酸殘基組成，實施例中是由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 5個氨基酸殘基組 成的短肽。本發(fā)明的融合蛋白具有5種形式，融合蛋白各形式的DNA序列分別為SEQ ID NO 3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、或 SEQ ID NO :7 序列，DNA 序列顯示各種形式 的融合蛋白中TMP與IGF-I多肽區(qū)之間DNA序列使用的是GGT TCT GGC TCT GGC，本領域技 術人員可以選用其他形式的連接肽DNA序列。本發(fā)明的另一目的是提供攜帶本發(fā)明融合蛋白DNA序列的重組表達載體。本發(fā)明的融合蛋白是利用基因重組技術制造的。本發(fā)明的融合蛋白根據(jù)氨基酸序列，利用氨基酸密碼子的簡并性特點，依據(jù)不同 表達宿主，包括大腸桿菌、酵母、CH0細胞等多種表達宿主的密碼子偏嗜性，本領域人員可以 編碼不同的核苷酸序列，使其在不同宿主內(nèi)高效表達。本發(fā)明所設計的核苷酸序列可以化 學合成，也可以采用PCR方法獲得。選擇在大腸桿菌內(nèi)高效表達的pET系列表達載體，在酵 母里表達的pPIC9k表達載體、在CH0細胞內(nèi)表達的pcDNA3. 1表達載體。在大腸桿菌內(nèi)pET3a+最適合該融合蛋白的表達、且純化方法也比較簡單，不會存 在標簽難以去除的問題。將其構建到表達載體pET3a+上，使其在大腸桿菌內(nèi)高效表達。 其存在形式為包涵體，制備方法為培養(yǎng)工程菌，離心收集菌體，破菌，收集包涵體，包涵體 經(jīng)洗滌、變性、復性后，分別使用陽離子層析介質和陰離子層析介質進行純化，獲得純度為 95%以上的樣品。將所獲得的純度較高的融合蛋白與TP0(市售)進行升血小板實驗。實驗方法為 所有小鼠腹腔注射卡鉬150mg/kg，即成血小板缺失模型。造模后1天，分別注射市售TP0及 融合蛋白，連續(xù)14天，分別于給藥前及給藥后3-4天所有小鼠采血，檢測血小板數(shù)值。結果 表明，TMP與IGF-1融合蛋白有明顯的升高血小板的作用。本發(fā)明的融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑，藥物載體包括水、鹽水、糖 類等。由本發(fā)明融合蛋白制成的藥物制劑優(yōu)選的是含水液體制劑和凍干制劑。本發(fā)明的融合蛋白及其藥物制劑可用于治療多種血小板減少癥等疾病，包括各種 原發(fā)性及繼發(fā)性血小板減少，如再生障礙性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、腫瘤放化療引 起的血小板減少及多種免疫性血小板減少癥。與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明的優(yōu)勢在于本發(fā)明所提供的融合蛋白具有TMP及胰島素樣生長因子兩種多肽的生物學活性， 通過這種融合蛋白表達的方式使TMP更為穩(wěn)定，延長其半衰期，并且使兩種多肽產(chǎn)生優(yōu)勢 互補，使得融合蛋白在促血小板生成方面的作用更為明顯。同時將IGF-I與TMP融合，可通 過與TMP受體靶向結合而刺激巨核細胞增殖與分化，能夠使得IGF-I具有靶向作用，而促進 血小板生成，減少其使用劑量，從而減少其對其他細胞及器官的影響。本發(fā)明所提供的融合 蛋白使兩種多肽實現(xiàn)了優(yōu)勢互補，加強了其促巨核細胞增殖-血小板生成的作用，并降低 了 IGF-I對其他細胞的影響，具有高效、副作用低的促血小板生成的作用。胰島素樣生長因子IGF-I與生長激素(GH)相比，在某種程度上可以把GH看作是 IGF-I前體，許多GH的促生長功能是通過IGF-I的效應實現(xiàn)的。IGF單獨使用能取得很好的效果，而生長激素使用時常需要大劑量的anabolics和胰島素的配合使用才能獲得好的 效果。因此，IGF-I與TMP的融合蛋白能夠更好的發(fā)揮促血小板生成作用，同時IGF-I由70 個氨基酸構成，而GH由191個氨基酸構成，IGF-I與TMP的融合蛋白更易于生物工程方法 制備，且本發(fā)明所提供的融合蛋白分子量小，易于吸收，可以通過靜脈、皮下、肌肉、腹腔注 射等方式給藥。本發(fā)明以IGF-TMP融合蛋白為例，以附圖的形式進行說明，但以下說明并不構成 對本專利的限制。本領域人員利用本發(fā)明的技術路線，可以制備其他不同形式的IGF與TMP 融合蛋白，如TMP-M-IGF、TMP-M-IGF-M-TMP、TMP-TMP-M-IGF、IGF-M-TMP-TMP 等。


圖1為pET/IGF-M-TMP重組質粒的構建圖2為pET/IGF-M-TMP重組質粒雙酶切鑒定電泳圖 3 為 pET/IGF-M-TMP 融合蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖4為融合蛋白升血小板活性分析結果
具體實施例方式以下通過實施例詳細說明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實施例并不構成對本發(fā)明的限 制。下面以大腸桿菌為宿主菌具體敘述一下該融合蛋白的構建與制備過程。實施例1 工程菌構建方法融合基因片段的人工合成根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率表，選擇在大腸桿菌中高效表達的密碼子，人為設 計IGF-M-TMP(M序列為GSGSG)融和蛋白基因的序列，委托上海生工生物工程有限公司合 成?，F(xiàn)以IGF-M-TMP(IMT)為例詳細敘述其構建和制備過程。IGF-M-TMP融合基因表達質粒的構建取IGF-M-TMP融合基因的質粒，使用Nde I和BamH I進行雙酶切回收小片段，同 時取pET-3a+原核表達載體，使用Nde I和BamH I進行雙酶切回收大片段，將回收的兩個 片段利用T4連接酶連接，轉化進大腸桿菌DH5 a中，篩選陽性重組子。經(jīng)雙酶切鑒定和序 列測序分析確定后將其命名為pET-IMT。pET-IMT表達工程菌的構建將pET-IMT的表達質粒分別轉化進表達菌株BL21 (DE3)中，挑取若干菌落，經(jīng)LB 過夜培養(yǎng)，次日提取質粒，經(jīng)Nde I和BamH I酶切鑒定后，選擇若干陽性克隆經(jīng)LB過夜培 養(yǎng)，次日以1 % 10 %的濃度轉接至新的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4個小時，監(jiān)測0D值達到 0. 4 0. 6時開始使用0. 5 2mmol/L IPTG誘導表達2到4小時，收集菌體，表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE分析，篩選高表達的菌株，掃描分析發(fā)現(xiàn)表達量均在30%左右，且表達產(chǎn)物大部 分為包涵體。實施例2 融合蛋白的制備對篩選出的高表達菌株進行大規(guī)模的誘導表達，收集菌體后使用破菌液(10 50mmol/L TrisUO 100 u g/ml溶菌酶，pH8. 0 8. 5)懸浮菌體，室溫攪拌20 60min， 現(xiàn)象為細胞破碎，核酸釋放，菌液粘稠，然后使用超聲細胞破碎儀冰浴破碎，離心后獲得一 定量的包涵體，觀察包涵體的狀態(tài)。
使用包涵體的洗滌液(0.1 0. 5 % TritonX-lOOUO 50mmol/L Tris-HCl、 0. 1 5mmol/L EDTA，pH8. 0 8. 5)對其進行2_3次的洗滌、確保清洗干凈，離心后收集包 涵體，使用(10 50mmol/L Tris-HCl,5 20mmol/L DTT、6mol/L 鹽酸胍或 8mol/L 尿素， PH8.6)抽提液以1 5 1 40的體積進行變性抽提，離心后取上清，使用(10 50mmol/ L Tris-HCl、0. 01 0. 5mmol/L GSSG)的復性液以1 50 1 150的體積進行稀釋復 性。然后將所得復性液進行超濾濃縮，調(diào)pH至8. 0 8. 5，使用10 50mmol/ LTris-Cl(pH8. 0)的平衡液平衡陰離子交換柱，上樣。隨后將穿過液的pH調(diào)節(jié)到4. 5，使用 10 50mmol/L NaAc-HAc, pH4. 0 4. 5的平衡液平衡陽離子交換柱，上樣后再次平衡，再 使用0 lmol/L NaCl進行線性梯度洗脫，使其進一步的純化濃縮。電泳檢測獲得的融和 蛋白純度可達到95%以上。實施例3 融合蛋白的升血小板活性測定所有小鼠腹腔注射卡鉬150mg/kg，即成血小板缺失模型。造模后1天，所有小鼠隨 機分為3組，雌雄各半。給藥組6只，腹腔注射50 yg IMT原液，連續(xù)14天；陽性藥組6只， 腹腔注射1. lX104IU/kg市售TP0，連續(xù)14天；空白組8只，腹腔注射生理鹽水0. 5ml，連續(xù) 14天。給藥前所有小鼠采血，檢測血小板數(shù)值。給藥后3-4天采血一次，具體采血間隔視小 鼠狀態(tài)決定，檢測血小板數(shù)值。結果實驗結果表明，如圖3所示本發(fā)明構建的融合蛋白可以顯著抑制注射卡帕的小 鼠外周血血小板的減少，顯示出較強的升血小板活性。SEQUENCE LISTING(序列信息表)<110>哈藥集團生物工程有限公司<120> 一種融合蛋白及其制備方法<130><160>7<210>1<211>14<212>RPT<213>Atificial<220><223>TMP氨基酸序列<400>1lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala1510<210>2<211>68<212>RPT<213>Atificial
<212>DNA0099]<213>Atificial0100]<220>0101]<223>編碼TMP與胰島素樣生長因子融合蛋白_3的DNA序列0102]<400>50103]atgattgaaggtccgtatctgcgtcagtggttagccgcacgcgcgggttctggctctggc600104]actctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggtttc1200105]tacttcaacaaaccgactggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggtatc1800106]gttgacgaatgctgcttccgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgctccg2400107]ctgaaaccggctaaatctgctggttctggctctggcatcgagggcccgtacttacgccag3000108]tggctggcggctcgtgcctaa3210109]<210>60110]<211>3060111]<212>DNA0112]<213>Atificial0113]<220>0114]<223>編碼TMP與胰島素樣生長因子融合蛋白_4的DNA序列0115]<400>60116]atgattgaaggtccgtatctgcgtcagtggttagccgcacgcgcgatcgagggcccgtac600117]ttacgccagtggctggcggctcgtgccggttctggctctggcactctgtgcggtgctgaa1200118]ctggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggtttctacttcaacaaaccgact1800119]ggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggtatcgttgacgaatgctgcttc2400120]cgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgctccgctgaaaccggctaaatct3000121]gcttaa3060122]<210>70123]<211>3060124]<212>DNA0125]<213>Atificial0126]<220>0127]<223>編碼TMP與胰島素樣生長因子融合蛋白_5的DNA序列0128]<400>70129]atgactctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggt600130]ttctacttcaacaaaccgactggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggt1200131]atcgttgacgaatgctgcttccgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgct1800132]ccgctgaaaccggctaaatctgctggttctggctctggcattgaaggtccgtatctgcgt2400133]cagtggttagccgcacgcgcgatcgagggcccgtacttacgccagtggctggcggctcgt3000134]gcctaa30權利要求
一種融合蛋白，其特征在于由血小板生成素模擬肽區(qū)(TMP)和胰島素樣生長因子IGF-I多肽區(qū)組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于TMP的氨基酸具有SEQID N0:1序 列；胰島素樣生長因子IGF-I多肽區(qū)具有SEQ ID NO 2序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于其連接方式可以為TMP-M-IGF、 IGF-M-TMP、TMP-M-IGF-M-TMP、TMP-TMP-M-IGF、IGF-M-TMP-TMP 中的任意一種。其中，TMP 代表血小板生成素模擬肽，IGF代表胰島素樣生長因子IGF-I，M代表連接肽。
4.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于TMP和IGF-I多肽區(qū)之間設有連接肽 進行連接。
5.根據(jù)權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于連接肽為0到10個氨基酸組成的連 接肽，更優(yōu)選0-5個氨基酸。
6.編碼權利要求1-5所述融合蛋白的DNA序列，其具有SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、或 SEQ ID NO :7 序列。
7.一種表達載體，其特征在于包含權利要求6所述的DNA序列的重組表達載體。
8.制備重組融合蛋白的方法，包括用權利要求7重組表達載體轉化、轉染或轉導宿主 細胞，分離、純化所述重組融合蛋白。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備重組融合表達蛋白的方法，其特征在于表達所用的宿 主為動物細胞、酵母、細菌，原核表達優(yōu)選大腸桿菌。
10.權利要求1所述的融合蛋白用于制備治療血小板減少癥的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了由血小板生成素模擬肽(TMP)和胰島素樣生長因子IGF-I組成的一種新型的融合蛋白以及這種融合蛋白的制備方法，本發(fā)明所提供的融合蛋白具有升高血小板的生物學活性。
文檔編號C12N15/62GK101863982SQ20091007181
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權日2009年4月17日
發(fā)明者冷國慶, 劉賀煜, 姜媛媛, 孫磊, 朱紅杰, 李會成, 李鄭武, 王晴, 趙華南, 陳玉軍 申請人:哈藥集團生物工程有限公司