專利名稱：一種復(fù)合微生物抗菌素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種廣譜復(fù)合微生物抗菌素及其制備方法，屬食品微生物技術(shù)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
所謂微生物抗菌素是微生物代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對(duì)同種的或親緣關(guān)系 較近的種有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)。這些物質(zhì)可以殺滅或抑制與之相同或相似生境 的其他微生物，所有產(chǎn)生抗菌素的微生物都存在著特異性免疫基因，產(chǎn)生的抗菌素不會(huì)對(duì)產(chǎn) 生菌本身造成傷害。隨著研究的進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)食品腐敗微生物和病原微生物具有廣 譜抑菌活性的抗菌素。
乳酸菌抗菌素在我國的研究始于八十年代末，但是主要是針對(duì)于Nisin的研究，新菌株 和高產(chǎn)菌株的篩選以及分子生物學(xué)的研究，而對(duì)其它乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素?zé)o論在理論上還是 在應(yīng)用上的研究都不夠成熟。1988年，中科院微生物所開始對(duì)Nisin進(jìn)行理論和應(yīng)用的基礎(chǔ) 研究，分離和篩選出能夠產(chǎn)生nisinZ的乳酸鏈球菌菌株；我國在1990年將其列為食品添加 劑增補(bǔ)品種。到了20世紀(jì)90年代，國內(nèi)學(xué)者才開始研究其他乳酸菌細(xì)菌素。除nisin外， 我國乳酸菌細(xì)菌素的研究主要集中在菌株篩選、分離純化和一般生物學(xué)特性研究，通過優(yōu)化 發(fā)酵條件和誘變細(xì)菌素產(chǎn)生菌提高細(xì)菌素的產(chǎn)量。對(duì)細(xì)菌素的分子生物學(xué)研究較少。乳酸菌 在自然界中分布廣泛，而且是人類和動(dòng)物腸道中正常菌群中的優(yōu)勢(shì)菌，乳酸菌不僅具有許多 對(duì)人類和動(dòng)物健康有益的生理功能，而且能夠產(chǎn)生很多具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機(jī)酸(如 乳酸)、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，這些抑菌物質(zhì)不僅能有效的保持食品的風(fēng)味和組織狀 態(tài)，還可以抑制食品中存在的腐敗菌和病原菌的生長，從而防止食品的腐敗，延長食品的保 藏期。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑，它對(duì) 動(dòng)物無毒性，很容易被人體自身消化道中的蛋白酶降解，所以不會(huì)在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)。
乳酸菌細(xì)菌素作為食品類抗菌素并非廣譜抗菌，對(duì)革蘭氏陽性菌抑菌效果比較明顯，但
對(duì)革蘭氏陰性菌、霉菌、酵母等真菌抑殺效果不明顯。本發(fā)明專利選用倆株乳酸菌復(fù)合發(fā)酵
產(chǎn)生細(xì)菌素，與真菌細(xì)胞多糖等內(nèi)容物按比例復(fù)配，制備一種具有廣譜抗菌作用的微生物復(fù)
合抗菌素，主要應(yīng)用于各類食品保鮮，該抗菌素不受溫度、pH值的限制，對(duì)霉菌、酵母以及
各類食品腐敗菌抑制效果朋顯。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種復(fù)合微生物抗菌素及其制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明中所涉及的比例除另有注明之外為質(zhì)量比，本發(fā)明
3的產(chǎn)品采用這樣的方法來制備的-1.制備過程
1. 1乳酸菌混合發(fā)酵制備細(xì)菌素 1. 1. 1菌種來源
發(fā)酵菌株購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，名稱和編號(hào)為鼠李糖乳桿菌CICC 6141 (A)，嗜酸乳桿菌CICC 6075 (B)。
1.1.2發(fā)酵過程
1.2.2. 1MRS培養(yǎng)基的制備
蛋白胨1°/。，牛肉膏1%，酵母提取物0. 5%， K異O. 2%，檸檬酸二胺0. 2%，乙酸鈉0. 5%， 葡萄糖2%，吐溫80 0. 1%， MgS(X 7H2O0. 058%， MnS04 ■ 0. 025%,其余為去離子水，pH6. 2 —6.4， 121。C滅菌20分鐘。
L2.2.2發(fā)酵菌株的活化
分別量取0. 9%的生理鹽水lOml于5只試管內(nèi)，經(jīng)121'C滅菌20分鐘冷卻至30'C，分別 將鼠李糖乳桿菌CICC 6141和嗜酸乳桿菌CICC 6075倆株乳酸菌安瓶內(nèi)的凍干菌粉末在無菌 狀態(tài)下全部倒入0.9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在3(TC恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。
1.2.2.3乳酸菌復(fù)合發(fā)酵，
將活化后的乳酸菌按10%的接種量分別接種于1. 2. 2.1培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)48h，結(jié) 束發(fā)酵。
1.丄.3細(xì)菌素的提取過程 1.1.3.1細(xì)菌素粗提液的制備
將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液于10000轉(zhuǎn)/分鐘，高速離心15min，取上清液，置于4'C保存各用。
1. 1. 3. 2硫酸銨分級(jí)沉淀細(xì)菌素
制備好的離心上清液用0.45pm濾菌膜處理后裝在錐形瓶中，每瓶裝有100mL，然后分 別加入固體硫酸銨使其飽和度為70%，振蕩過夜。8000轉(zhuǎn)/分鐘、4'C離心30min，收集沉淀， 用少量蒸餾水溶解。
1.1.3.3凝膠層析純化細(xì)菌素
將預(yù)溶脹的Sephacryl S-100凝膠柱采用乙酸鈉緩沖液(0.05mol/L，pH5.1 )，平衡Sephacryl S-100凝膠柱。采用上樣量為lmL的細(xì)菌素(硫酸銨沉淀后樣品)，用乙酸鈉緩沖液洗脫蛋白 質(zhì)，洗脫速度為0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脫液，每10min收集1管，每管3mL，收集15號(hào)試管的組分，該組分為純化后的細(xì)菌素。 1. 1.3.4凍干濃縮
純化后的細(xì)菌素，進(jìn)行凍干濃縮，在真空、低溫的條件下排除純化后的細(xì)菌素中95-99% 以上的水分，最終得到粉末狀的細(xì)菌素。 1. 2黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物的制備 1.2. l黑曲霉菌體來源
黑曲霉菌絲體來源于檸檬酸發(fā)酵廠家的廢棄產(chǎn)物——黑曲霉菌體。
1. 2. 2制備方法
將黑曲霉菌體按l: 6的比例加水，經(jīng)DSH150型號(hào)高剪切膠體磨，粉碎勻漿后，使黑曲霉 菌絲體破碎，破碎組織小于5ym，將黑曲霉菌體勻漿液加熱至55。C，添加1.5%纖維素酶(2 萬單位/克)、1.5%果膠酶(2萬單位/克)、2%e-葡聚糖酶(3萬單位/克)、2%酸性蛋白酶(5 萬單位/克)，充分混勻后55'C保溫水解6小時(shí)，然后升溫至10(TC，保持10分鐘滅酶，冷卻 后經(jīng)管式離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下高速離心，取離心上清液，真空濃縮至固形物為 50-55°/。，然后參照1.1.3.4步驟進(jìn)行冷凍干燥，獲得黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末(C)。
1.3復(fù)合微生物抗菌素的制備
按重量比為A細(xì)菌素B細(xì)菌素C = (15-20): (18-25): (20-35)的比例充分混勻， 制成復(fù)合微生物抗菌素成品。
2. 應(yīng)用效果
下面通過具體實(shí)驗(yàn)來證明本發(fā)明專利的應(yīng)用效果 2. 1試驗(yàn)材料與方法 2. 1. 1指示菌種
沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，用0.9%生理鹽水活化2-4小時(shí)，等體積混合備用。 2. 1. 2實(shí)驗(yàn)方法
2.0%的素瓊脂，冷至5(TC左右，按每平皿10mL傾倒在無菌平皿中，潔凈工作臺(tái)中晾干 用無菌鑷子取預(yù)先滅菌的牛津杯放在倒有瓊脂的平皿中，無菌刮棒涂布指示菌培養(yǎng)過夜，制 備含0. 7%瓊脂指示菌培養(yǎng)基，冷至5(TC左右，每100mL軟瓊脂培養(yǎng)基接種lmL指示菌在事先 放好牛津杯的平板上，傾倒lOraL含有指示菌的軟瓊脂培養(yǎng)基，晾干，在牛津杯的孔中加入 100yL濃度為10—6g/n]l微生物復(fù)合抗菌素，在潔凈工作臺(tái)中鼓風(fēng)擴(kuò)散3小時(shí)，置于35。C培養(yǎng) 48小時(shí)后用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。
2. 2結(jié)果與分析瓊脂平板中的牛津杯周圍透明，沒有指示菌的生長，而平板其它部位長滿了指示菌，說
明本發(fā)明專利能夠有效抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的生長。
(四)


圖1為微生物復(fù)合抗菌素對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果圖。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述
實(shí)施例一
1.制備過程
1. 1乳酸菌混合發(fā)酵制備細(xì)菌素 1. 1. 1菌種來源
發(fā)酵菌株購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，名稱和編號(hào)為鼠李糖乳桿菌CICC 6141 (A)，嗜酸乳桿菌CICC 6075 (B)。
1.丄.2發(fā)酵過程
1.2.2. 1MRS培養(yǎng)基的制備
蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母提取物0.5%， K2HPO40. 2%，檸檬酸二胺0. 2%，乙酸鈉0. 5%， 葡萄糖2%，吐溫80 0. 1%， MgS(X 7H200. 058%， MnS04 4H20 0. 025%，其余為去離子水，pH6. 2 —6.4， 12rC滅菌20分鐘。
1.2.2.2發(fā)酵菌株的活化
分別量取0. 9%的生理鹽水10ml于5只試管內(nèi)，經(jīng)121'C滅菌20分鐘冷卻至30°C，分別 將鼠李糖乳桿菌CICC 6141和嗜酸乳桿菌CICC 6075倆株乳酸菌安瓶內(nèi)的凍干菌粉末在無菌 狀態(tài)下全部倒入0.9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在3(TC恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。
1.2.2.3乳酸菌復(fù)合發(fā)酵
將活化后的乳酸菌按10°/。的接種量分別接種于1. 2. 2. 1培養(yǎng)基中，37'C厭氧培養(yǎng)48h，結(jié) 束發(fā)酵。
1. L3細(xì)菌素的提取過程
1.1.3. l細(xì)菌素粗提液的制備
將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液于10000轉(zhuǎn)/分鐘，高速離心15min，取上清液，置于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 1. 1. 3. 2硫酸銨分級(jí)沉淀細(xì)菌素
制備好的離心上清液用0.45um濾菌膜處理后裝在錐形瓶中，每瓶裝有100mL，然后分別加入固體硫酸銨使其飽和度為70%，振蕩過夜。8000轉(zhuǎn)/分鐘、4'C離心30min，收集沉淀， 用少量蒸餾水溶解。
1.1.3.3凝膠層析純化細(xì)菌素
將預(yù)溶脹的Sephacryl S-100凝膠柱釆用乙酸鈉緩沖液(0.05mol/L，pH5.1 )，平衡Sephacryl S-100凝膠柱。采用上樣量為lmL的細(xì)菌素(硫酸銨沉淀后樣品)，用乙酸鈉緩沖液洗脫蛋白 質(zhì)，洗脫速度為0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脫液，每IOmin收集1管，每管3mL， 收集15號(hào)試管的組分，該組分為純化后的細(xì)菌素。
1. 1. 3. 4凍干濃縮
純化后的細(xì)菌素，進(jìn)行凍干濃縮，在真空、低溫的條件下排除純化后的細(xì)菌素中95-99% 以上的水分，最終得到粉末狀的細(xì)菌素。 1. 2黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物的制備 1.2. 1黑曲霉菌體來源
黑曲霉菌絲體來源于檸檬酸發(fā)酵廠家的廢棄產(chǎn)物——黑曲霉菌體。 1. 2. 2制備方法
將黑曲霉菌體按l: 6的比例加水，經(jīng)DSH150型號(hào)高剪切膠體磨，粉碎勻漿后，使黑曲霉 菌絲體破碎，破碎組織小于5ym，將黑曲霉菌體勻漿液加熱至55。C，添加1. 5%纖維素酶(2 萬單位/克)、1.5%果膠酶(2萬單位/克)、2%e-葡聚糖酶(3萬單位/克)、2%酸性蛋白酶(5 萬單位/克)，充分混勻后55。C保溫水解6小時(shí)，然后升溫至10(TC，保持10分鐘滅酶，冷卻 后經(jīng)管式離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下高速離心，取離心上清液，真空濃縮至固形物為 50-55%，然后參照1. 1. 3. 4步驟進(jìn)行冷凍干燥，獲得黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末(C)。
1. 3復(fù)合微生物抗菌素的制備
按重量比為A細(xì)菌素B細(xì)菌素C=15: 18: 20的比例充分混勻，制成復(fù)合微生物抗菌
素成品。
實(shí)施例二 l.制備過程
1. 1乳酸菌混合發(fā)酵制備細(xì)菌素 1. 1. 1菌種來源
發(fā)酵菌株購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，名稱和編號(hào)為鼠李糖乳桿菌CICC
6141 (A)，嗜酸乳桿菌CICC 6075 (B)。
J. 1.2發(fā)酵過程
1.2.2. 1MRS培養(yǎng)基的制備蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母提取物0.5%， K2HP040. 2%，檸檬酸二胺0. 2%，乙酸鈉0. 5%， 葡萄糖2%，吐溫訓(xùn).1%， MgS04 7H200. 058%, MnS04 4H20 0. 025%，其余為去離子水，pH6. 2 _6. 4， 121。C滅菌20分鐘。
1. 2. 2. 2發(fā)酵菌株的活化
分別量取0. 9%的生理鹽水10ml于5只試管內(nèi)，經(jīng)12rC滅菌20分鐘冷卻至30°C ，分別 將鼠李糖乳桿菌CICC 6141和嗜酸乳桿菌CICC 6075倆株乳酸菌安瓶內(nèi)的凍干菌粉末在無菌 狀態(tài)下全部倒入0.9%的生理鹽水中，震蕩使其溶解，在30。C恒溫箱中靜止活化30分鐘，備用。
1.2.2.3乳酸菌復(fù)合發(fā)酵
將活化后的乳酸菌按10%的接種量分別接種于1. 2. 2. 1培養(yǎng)基中，37"厭氧培養(yǎng)48h，結(jié) 束發(fā)酵。
1. 1.3細(xì)菌素的提取過程
1. 1. 3. 1細(xì)菌素粗提液的制備
將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液于10000轉(zhuǎn)/分鐘，高速離心15min，取上清液，置于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 1. 1. 3. 2硫酸銨分級(jí)沉淀細(xì)菌素
制備好的離心上清液用0.45pm濾菌膜處理后裝在錐形瓶中，每瓶裝有100mL，然后分 別加入固體硫酸銨使其飽和度為70%，振蕩過夜。8000轉(zhuǎn)/分鐘、4。C離心30min，收集沉淀， 用少量蒸餾水溶解。
1.1.3.3凝膠層析純化細(xì)菌素
將預(yù)溶脹的Sephacryl S-100凝膠柱采用乙酸鈉緩沖液(0.05mol/L， pH5.1 )，平衡Sephacryl S-100凝膠柱。采用上樣量為lmL的細(xì)菌素(硫酸銨沉淀后樣品)，用乙酸鈉緩沖液洗脫蛋白 質(zhì)，洗脫速度為0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脫液，每10min收集1管，每管3mL， 收集15號(hào)試管的組分，該組分為純化后的細(xì)菌素。
1. 1. 3. 4凍干濃縮
純化后的細(xì)菌素，進(jìn)行凍干濃縮，在真空、低溫的條件下排除純化后的細(xì)菌素中95-99% 以上的水分，最終得到粉末狀的細(xì)菌素。 1. 2黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物的制備 1.2.1黑曲霉菌體來源
黑曲霉菌絲體來源于檸檬酸發(fā)酵廠家的廢棄產(chǎn)物——黑曲霉菌體。 1.2.2制備方法
8將黑曲霉菌體按h 6的比例加水，經(jīng)DSH150型號(hào)高剪切膠體磨，粉碎勻漿后，使黑曲霉 菌絲體破碎，破碎組織小于5ym，將黑曲霉菌體勻漿液加熱至55。C，添加1.5%纖維素酶(2 萬單位/克)、1.5%果膠酶(2萬單位/克)、2%e-葡聚糖酶(3萬單位/克)、2%酸性蛋白酶(5 萬單位/克)，充分混勻后55i:保溫水解6小時(shí)，然后升溫至100。C,保持10分鐘滅酶，冷卻 后經(jīng)管式離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下高速離心，取離心上清液，真空濃縮至固形物為 50-55%，然后參照1. 1. 3. 4步驟進(jìn)行冷凍干燥，獲得黑曲霉菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末(C)。
1.3復(fù)合微生物抗菌素的制備
按重量比為A細(xì)菌素B細(xì)菌素C=20: 25: 35的比例充分混勻，制成復(fù)合微生物抗菌
素成品。
權(quán)利要求
1、一種復(fù)合微生物抗菌素及其制備方法，其特征是(1)乳酸菌細(xì)菌素的制備將鼠李糖乳桿菌(A)，嗜酸乳桿菌(B)分別在MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48小時(shí)，發(fā)酵液高速離心后取上清液加入固體硫酸銨，將產(chǎn)生的沉淀用蒸餾水溶解，經(jīng)凝膠層析純化后進(jìn)行冷凍干燥，獲得乳酸菌細(xì)菌素。(2)菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末的制備將黑曲霉菌體按1∶6的比例加水，經(jīng)膠體磨粉碎勻漿后，加熱至55℃，添加1.5％纖維素酶、1.5％果膠酶、2％β-葡聚糖酶、2％酸性蛋白酶，混勻后55℃保溫水解6小時(shí)，100℃/10分鐘滅酶，冷卻后取離心上清液進(jìn)行冷凍干燥獲得菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末(C)。(3)微生物復(fù)合抗菌素的制備按重量比為A細(xì)菌素∶B細(xì)菌素∶C＝(15-20)∶(18-25)∶(20-35)的比例充分混勻，制成成品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種復(fù)合微生物抗菌素及其制備方法。將鼠李糖乳桿菌(A)，嗜酸乳桿菌(B)分別在MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48小時(shí)，發(fā)酵液高速離心后取上清液加入固體硫酸銨，將產(chǎn)生的沉淀用蒸餾水溶解，經(jīng)凝膠層析純化后進(jìn)行冷凍干燥，獲得乳酸菌細(xì)菌素；將黑曲霉菌體按1∶6的比例加水，經(jīng)膠體磨粉碎勻漿后，加熱至55℃，添加1.5％纖維素酶、1.5％果膠酶、2％β-葡聚糖酶、2％酸性蛋白酶，混勻后55℃保溫水解6小時(shí)，100℃/10分鐘滅酶，冷卻后取離心上清液進(jìn)行冷凍干燥獲得菌絲體內(nèi)溶物酶解凍干粉末(C)。按重量比為A細(xì)菌素∶B細(xì)菌素∶C＝(15-20)∶(18-25)∶(20-35)的比例充分混勻，制成成品。
文檔編號(hào)A23L3/3463GK101524180SQ20091007185
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者吳海波, 牛愛地, 宇 王, 韓建春 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)