專利名稱：：強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基及篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基及篩選除磷功能菌的方法。
背景技術(shù)：
：目前篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法是將從強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中取出的污泥置于含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，再將發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液稀釋，然后涂布于固體傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到強(qiáng)化生物除磷功能菌，但該方法還存在以下問題1、該法針對性差，所以在培養(yǎng)過程中非強(qiáng)化生物除磷功能菌大量繁殖，雜菌滋生，導(dǎo)致強(qiáng)化生物除磷功能菌的比例下降，所分離得到強(qiáng)化生物除磷功能菌的菌株數(shù)量少，僅占分離得到的全部菌株數(shù)的15%左右；2、該法所采用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不合理，使得培養(yǎng)過程中強(qiáng)化生物除磷功能菌的生長受到限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法針對性差，得到強(qiáng)化生物除磷功能菌的菌株數(shù)量少及所用的培養(yǎng)基不適合強(qiáng)化生物除磷功能菌生長的問題。而提供了一種強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基及篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法。本發(fā)明強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基為強(qiáng)化生物除磷功能菌所依次進(jìn)行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用的培養(yǎng)基為厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；其中每升厭氧培養(yǎng)基是由0.1^).3g的NaAC、130150mg的(朋4)2504、1315mg的CaCl2.2H20、170l鄰mg的MgS04'7H20、0.20.4mL的微量元素液、0.81.2mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升好氧培養(yǎng)基是由130150mg的KH2PO4、230~260mg的K2HP04、120~160mg的,4)2804、12~16mg的CaCl2'2H20、160200mg的MgS04'7H20、0.1~0.6mL的微量元素液、0.51.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧培養(yǎng)基的pH值為7叼.2;每升固體分離培養(yǎng)基由0,l0.3g的NaAC、3240mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、1.2~1.4g的卿)2804、120160mg的CaCl2'2H20、L62g的MgS04'7H20、l~6mL的微量元素液、5~15mL的維生素液、1416g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體分離培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升液體分離培養(yǎng)基是由0.1~0.3g的NaAC、3240mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、1.2~L4g的(NH4)2S04、120160mg的CaCl2.2H20、1.62g的MgS04.7H20、l~6mL的微量元素液、5~15mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH值為77.2。本發(fā)明篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法按照以下步驟進(jìn)行一、配制上面所述的厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥60ml進(jìn)行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于lOOmL的血清瓶中；三、將60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基倒于步驟二的血清瓶中與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)23~25h;四、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)23~26h;五、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心:，'去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)2326h;六、循環(huán)操作步驟四至五2~4次，對活性污泥進(jìn)行馴化，得到厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液；七、將步驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)2326h;八、取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；九、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制'的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)20~24h;十、挑取步驟九中固體分離培熬基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十一、重復(fù)操作步驟八至十38次獲得純菌株；十二、對步驟九得到的純菌株進(jìn)行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌。在厭氧培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中，強(qiáng)化生物除磷功能菌分解體內(nèi)的聚磷顆粒或糖原釋放能量吸收NaAC形成聚-beta-羥基-鏈烷酸酯(PHAs);在好氧培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，強(qiáng)化生物除磷功能菌分解在體內(nèi)的的PHAs作為能量來源吸收磷酸鹽或合成糖原；本發(fā)明的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分合理，與現(xiàn)有的篩選用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基相比，本發(fā)明方法所用的培養(yǎng)基適合強(qiáng)化生物除磷的生長。本發(fā)明的篩選方法中在厭氧培養(yǎng)基中靜止放置2226h，可以將專性好氧菌篩掉，保留強(qiáng)化生物除磷功能菌，然后再放入好氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中一些沒有在厭氧階段聚集PHA的菌株就不會生長，而強(qiáng)化生物除磷功能菌繼續(xù)生長；且在厭氧培養(yǎng)基6中和好氧培養(yǎng)基中均培養(yǎng)1天左右的時間，這種極限狀態(tài)不適合非強(qiáng)化生物除磷功能菌的生長，減少了雜菌數(shù)量；本發(fā)明又經(jīng)過等梯度稀釋、固體分離培養(yǎng)基培養(yǎng)勸液體分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)一步減少了雜菌的數(shù)量，本發(fā)明篩選方法針對性強(qiáng)，雜菌數(shù)量少，所分離得到的強(qiáng)化生物除磷功能菌數(shù)量多，占分離得到的全部菌株數(shù)的70%以上。具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一本實施方式強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基為強(qiáng)化生物fe磷功能菌所依次進(jìn)行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；其中每升厭氧培養(yǎng)基是由(U0.3g的NaAC、130~150mg的,4)2804、13~15mg的CaCl2'2H20、170190mg的MgS04'7H20、0.2~0.4mL的微量元素液、0.8~1.2mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升好氧培養(yǎng)基是由130150mg的KH2P04、230260mg的K2HP04、120~160mg的(NH4)2S04、12~16mg的CaCl2.2H20'、160~200mg的MgS04'7H20、(U0.6mL的微量元素液、0.5-1.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升固體分離培養(yǎng)基由0.10.3g的NaAC、3240mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、l'21.4g的(NH02SO4、120~160mg的CaCl2'2H20、1.62g的MgS04'7H20、16mL的微量元素液、515mL的維生素液、1416g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體分離培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升液體分離培養(yǎng)基是由0.一0.3g的NaAC、3240mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、1.2~1.4g的(NH4)2S04、120160mg的CaCl2'2H20、1.6~2g的MgS04.7H20、l~6mL的微量元素液、515mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH值為77.2。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一不同的是厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液休分離培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3-6H20的濃度為l,5g/L、H3B03的濃度為0.15g/L，CuSO4'5H2O的濃度為0.03g/L、KI的濃度為(U8g/L、MnCl2'4H20的濃度為0.12g/L、Na2M04.2H20的濃度為0.06g/L、ZnS04.7H20的濃度為0.12g/L和CoCl2'6H20的濃度為0.15g/L。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一或二不同的是厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為50mg/L的維生素Bp濃度為50mg/L的維生素B2、濃度為100mg/L維生素B6、濃度為lg/L的維生素B12、濃度為20mg/L的葉酸、濃度為50mg/L的煙酸，濃度為50mg/L的泛酸鈣、濃度為50mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為20mg/L的生物素組成。其它與具體實施方式二相同。具體實施方式四本實施方式篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法按照以下步驟進(jìn)行一、配制如具體實施一所述的厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥60ml進(jìn)行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于100mL的血清瓶中；三、將60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基倒于步驟二的血清瓶中與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)2325h;四、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)23~26h;五、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)2326h;六、循環(huán)操作步驟四至五24次，對活性污泥進(jìn)行馴化，得到厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液；七、將步驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)2326h;八、取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；九、用平板涂希法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)20~24h;H^—、重復(fù)操作步驟八至十3~8次獲得純菌株；十二、對步驟九得到的純菌株進(jìn)行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌。本實施方式步驟一中每升厭氧培養(yǎng)基是由0.1~0.3g的NaAC、13(M50mg的(NH4)2S04、1315mg的CaCl2.2H20、170190mg的MgS04.7H20、0.20.4mL的擴(kuò)量元素液、0.81.2mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升好氧培養(yǎng)基是由130150mg的KH2PO4、230260mg的K2HP04、120160mg的(NH4)2S04、12~16mg的CaCl2,2H20、160~200mg的MgS04.7H20、0.10.6mL的微量元素液、0.51.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升固體分離培養(yǎng)基由0.1~0.3g的NaAC、3240mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、1.21.4g的(NH4)2S04、120~160mg的CaCl2'2H20、1.62g的MgS04.7H20、卜6mL的微量元素液、515mL的維生素液、14~16g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體分離培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升液體分離培養(yǎng)基是由0.1~0.3g的NaAC、32~40mg的KH2P04、6268mg的K2HP04、1.21.4g的,4)2804、120~160mg的CaCl2'2H20、1.6~2g的MgSCV7H20、16mL的微量元素液、5~15mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH值為7~7.2。本實施方式厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3-6H20的濃度為1.5g/L、H3B03的濃度為0.15g/L，CuS(V5H20的濃度為0.03g/L、KI的濃度為0.18g/L、MnCl2'4H2O的濃度為0,12g/L、Na2MO4'2H2O的濃度為0.06g/L、ZnSCV7H20的濃度為0.12g/L和CoCl2《H20的濃度為0.15g/L。本實施方式厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為50mg/L的維生素B"濃度為50mg/L的維生素B2、濃度為100mg/L維生素B6、濃度為lg/L的維生素B12、濃度為20mg/L的葉酸、濃度為50mg/L的煙酸，濃度為50mg/L的泛酸鈣、濃度為50mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為20mg/L&5生物素組成。本實施方式步驟四中將離心后的沉淀放入含有步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的瓶中，然后用透氣濾膜封口。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式四不同的是步驟二中的污泥在轉(zhuǎn)速為40005000轉(zhuǎn)/分的條件下，離心1520分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式四相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式四或五不同的是步驟四、步驟五和步驟七中離心轉(zhuǎn)速均為40005000轉(zhuǎn)/分，離心時間均為15~20分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式四相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式六不同的是步驟九中等梯度稀釋的稀釋梯度倍數(shù)為10Lioq咅。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式六相同。具體實施方式八本實施方式與具體實施方式四、五或七不同的是步驟十二中純菌株的性能檢測方法按照以下步驟進(jìn)行A、配制具體實施方式四中步驟一所述的厭氧培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；B、取lmL具體實施方式四分離得到的純菌株的菌液置于40mL步驟A配制的液體分離培養(yǎng)基中，在162(TC搖床中培養(yǎng)11.5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15209分鐘，棄上清留沉淀；C、再向離心管中50mL加入30ml步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于162(TC的搖床中培養(yǎng)1.5~2.5h;D、將離心管置于40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15~20分鐘，棄上清留沉淀；E、再向步驟D50mL的離心管中加入30ml步驟A配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣1.52.5小吋；F、將離心管置于4000^5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15~20分鐘，棄上清留沉淀；G、循環(huán)操作步驟C至F1015次進(jìn)行菌種的馴化；H、向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于162(TC的搖床中培養(yǎng)1.52.5小時；I、將離心管置于40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1520分鐘，棄上清留沉淀；J、向步驟H50mL的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)1.52.5小時，用鉬酸銨浮光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為l-b/a，即確定了生物除磷功能菌的除磷性能；其中其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的休積比為0.5:l;步驟E和步驟I中每升好氧檢測培養(yǎng)基是由3540mg的KH2P04、6268mg的K2HP04、120~160mg的0^)2804、12~16mg的CaCl2'2H20、160~200mg的MgS04'7H20、0.1~0.6mL的微量元素液、0.5~1.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧檢測培養(yǎng)基的pH值為77.2。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式四、五或七相同。本實施方式步驟一中每升厭氧培養(yǎng)基是由(U0.3g的NaAC、130~150mg的(NH4)2S04、1315mg的CaCl2'2H20、170190mg的MgS04'7H20、0.2~0.4mL的微量元素液、0.81.2mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為77.2;每升液體分離培養(yǎng)基是由0.1~0.3g的NaAC、32~40mg的KH2P04、62~68mg的K2HP04、l'21.4g的(NH4)2S04、120~160mg的CaCl2.2H20、1.6~2g的MgS04.7H20、16mL的微量元素液、515mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH值為7~7.2。其中厭氧培養(yǎng)基和液休分離培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3-6H20的濃度為1.5g/L、H3B03的濃度為0.15g/L，CuSO4'5H2O的濃度為0.03g/L、KI的濃度為0.18g/L、MnCl2'4H20的濃度為0.12g/L、Na2M04'2H20的濃度為0.06g/L、ZnS04'7H20的濃度為0.12g/L和CoCl2'6H20的濃度為(U5g/L;厭氧培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為50mg/L的維生素B!、濃度為50mg/L的維生素B2、濃度為lOOmg/L維生素B6、濃度為lg/L的維生素B12、濃度為20mg/L的葉酸、濃度為50mg/L的煙酸，濃度為50mg/L的泛酸鈣、濃度為50mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為20mg/L的生物素組成。本實施方式步驟J中向50mL離心管中加入30ml好氧檢測極端兩相培養(yǎng)基，在室溫條件下曝氣1.52小時，分別在培養(yǎng)到20分鐘、40分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘時取樣0.6ml，置于1.5ml離心管中，40005000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘之后，分別取0.5ml上清液于另一個1.5ml離心管中，用鉬酸銨分光光度法測定菌液中的磷濃度，記錄檢測得到的最高磷濃度為b。具體實施方式九本實施方式與具體實施方式八不同的是步驟十二中對純菌株進(jìn)行鏡檢，通過鏡檢觀察確定具體實施方式四分離得到純菌株的形態(tài)是四聚體形態(tài)，即確定出純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌中的聚糖菌。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式八相同。具體實施方式十本實施方式與具體實施方式四不同的是篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法按照以下步驟進(jìn)行一、配制如具體實施方式一所述的厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥60ml進(jìn)行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于lOOmL的血清瓶中；三、厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)將60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基倒于步驟二中的血清瓶中與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)2325h;四、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)23~26h;五、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的lOOmL三角瓶中，在室溫條件下靜止培養(yǎng)23~26h;六、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟五培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)23~26h;七、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的lOOmL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)2326h;八、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟七培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀^[入含有"ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)2326h;九、將步驟八培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，在室溫條件下靜止培養(yǎng)23-26h;十、11將步驟九培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)23~26h;H"—、取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；十二、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)20~24h;十三、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h得到純菌株；十四、再取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；十五、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十六、挑取歩驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟--配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h得到純菌株；十七、再取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；十八、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十九、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h得到純菌株；二十、再取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；二十一、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;二十二、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h得到純菌株；二十三、對步驟十六、十九和二十二得到的純菌株進(jìn)行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式四相同。具體實施方式十一本實施方式篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法按照以下步驟進(jìn)行一、配制如具體實施方式一所述的厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥60ml進(jìn)行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于100mL的血清瓶中；三、厭氧培#基培養(yǎng)將60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基倒于步驟二的血清瓶中，與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)25h;四、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)26h;五、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)2326h;六、循環(huán)操作步驟四至五3次，對活性污泥進(jìn)行觀化，得到厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液；七、將步驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)25h;八、取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；九、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)23h;十、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)22h;十一、重復(fù)操作步驟八至十5次獲得純菌株；十二、對步驟九得到的純菌株進(jìn)行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌。本實施方式步驟一中每升厭氧培養(yǎng)基是由0.2g的NaAC、140mg的,4)2804、14mg的CaCl2.2H20、180mg的MgSO(7H20、0.3mL的微量元素液、lmL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為7.2;每升好氧培養(yǎng)基是由140mg的KH2P04、250mg的K2HP04、150mg的(]^)2804、14mg的CaCl2.2H20、180mg的MgS04'7H20、0.4mL的微量元素液、lmL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧培養(yǎng)基的pH值為7.2;每升固體分離培養(yǎng)基由0.2g的NaAC、35mg的KH2P04、64mg的K2HP04、1.3g的(NH4)2S04、140mg的CaCl2'2H20、L8g的MgS04'7H20、3mL的微量元素液、lOmL的維生素液、15g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體分離培養(yǎng)基的pH值為7.2;每升液體分離培養(yǎng)基是由0.2g的NaAC、35mg的KH2P04、65mg的K2HP04、1.3g的(NH4)2S04、150mg的CaCl2'2H20、1.8g的MgS04'7H20、3mL的微量元素液、10mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH^:為7.2。本實施方式厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的微量元素液中FeClr6H20的濃度為1.5g/L、H3B03的濃度為0.15g/L，CuSCV5H20的濃度為0.03g/L、KI的濃度為0.18g/L、MnCl2'4H2O的濃度為0.12g/L、Na2MO4.2H2O的濃度為0.06g/L、ZnS04'7H20的濃度為0.12g/L和CoCl2'6H20的濃度為0.15g/L。本實施方式厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為50mg/L的維生素B,、濃度為50mg/L的維生素82、濃度為100mg/L維生素B6、濃度為lg/L的維生素B^、濃度為20mg/L的葉酸、濃度為50mg/L的煙酸，濃度為50mg/L的泛酸鈣、濃度為50mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為20mg/L的生物素組成。本實施方式步驟十二中純菌株的性能檢測方法按照以下步驟進(jìn)行A、配制具體實施方式四中步驟一所述的厭氧培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；B、取imL具體實施方式四分離得到的純菌株的菌液置于40mL步驟A配制的液體分離培養(yǎng)基中，在162(TC搖床中培養(yǎng)1~1.5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在4000-5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15~20分鐘，棄上清留沉淀；C、再向離心管中50mL加入30ml步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于162(TC的搖床中培養(yǎng)1.52.5h;D、將離心管置于4000~5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1520分鐘，棄上清留沉淀；E、再向步驟D50mL的離心管中加入30ml步驟A配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣1.52.5小時F、將離心管置于40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15~20分鐘，棄上清留沉淀；G、循環(huán)操作步驟C至F1015次進(jìn)行菌種的馴化；H、向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于1620'C的搖床中培養(yǎng)1.52.5小時；I、將離心管置于4000~5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15-20分鐘，棄上清留沉淀；J、向步驟H50mL的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)1.5-2.5小時，用鉬酸銨分光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為l-b/a,即確定了生物除磷功能菌的除磷性能；其中其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的體積比為0.5:1;步驟E和步驟I中每升好氧檢測培養(yǎng)基是由3540mg的KH2PO4、6268mg的K2HP04、120~160mg的(NH4)2S04、12~16mg的CaCl2.2H20、160~200mg的MgS04.7H20、0.1~0.6mL的微量元素液、0.51.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧檢測培養(yǎng)基的pH值為77.2。本實施方式步驟十二中對純菌株進(jìn)行鏡檢，通過鏡檢觀察確定本實施方式分離得到純菌株的形態(tài)是四聚體形態(tài)，即確定出純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌中的聚糖菌o本實施方式的篩選過程均在超凈工作臺中進(jìn)行，并觀察步驟三中的厭氧培養(yǎng)基中乙酸的變化，步驟四中的好氧培養(yǎng)基中磷酸鹽的變化；其中在厭氧培養(yǎng)階段乙酸吸收量保持在25mg左右，在好氧培養(yǎng)階段磷酸鹽吸收量都保持在2.0mg左右，本實施方式步驟三、四的培養(yǎng)過程中淘汰了將污泥中的非功能菌，而污泥中強(qiáng)化生物除磷功能菌繼續(xù)生長；本實施方式的雜菌數(shù)量少，本實施方式所用的培養(yǎng)基適合強(qiáng)化生物除磷功能菌的生長。本實施方式共分離得到了B株菌，將這33株菌分別進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示，有8株菌為戴爾福特菌屬(i^辨/asp)的菌株，有6株菌為病菌/綠膿桿菌屬14(i^Moww7oysp)—的菌株，有15株菌為不動桿菌屬(v4c!'"ewkcfwsp)的菌株，有l(wèi)株菌為寡養(yǎng)單胞菌屬(5Ve/2o,rap/wmo"ossp)的菌株，有1株菌為副球菌屬(P"racocczwsp)的菌株，有1株菌為氣單胞菌屬G^ww朋必sp)的菌株，有1株菌為短芽孢桿菌屬0Bw礎(chǔ)""7/船sp)的菌株；本實施方式分離得到了的菌株中有"株菌具有明顯的除磷能力為聚磷菌，占總篩菌數(shù)的42.4°/。；通過鏡檢觀察確定分離得到純菌株中具有四聚體形態(tài)的菌株有l(wèi)l株菌，即有l(wèi)l株菌為聚糖菌，占總篩菌數(shù)的33.3%,關(guān)于聚糖菌在OehmenA與《WaterResearch》上發(fā)表的一篇名為《強(qiáng)化生物除磷的發(fā)展微觀和宏觀》的文章中也有記載。本實施方式分離得到的強(qiáng)化生物除磷功能菌占分離得到的全部菌株的75.7%，強(qiáng)化生物除磷功能菌的數(shù)量多；而采用現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌方法由于針對性差，所用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基不適合強(qiáng)化生物除磷功能菌，雜菌多，該法分離得到的化生物除磷功能菌的數(shù)量極少，僅為15%左右。將本實施方式獲得的33株菌進(jìn)行性能檢測，檢測結(jié)果如表1所示，其中除磷率低于20%的為非除磷功能菌。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表1中可以看出，本實施方式篩選得到的強(qiáng)化生物除磷功能菌的除磷率可達(dá)到100%，除磷效果好。權(quán)利要求1、強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基，其特征在于所述的篩選用培養(yǎng)基為強(qiáng)化生物除磷功能菌所依次進(jìn)行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；其中每升厭氧培養(yǎng)基是由0.1～0.3g的NaAC、130～150mg的(NH4)2SO4、13～15mg的CaCl2·2H2O、170～190mg的MgSO4·7H2O、0.2～0.4mL的微量元素液、0.8～1.2mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧培養(yǎng)基的pH值為7～7.2；每升好氧培養(yǎng)基是由130～150mg的KH2PO4、230～260mg的K2HPO4、120～160mg的(NH4)2SO4、12～16mg的CaCl2·2H2O、160～200mg的MgSO4·7H2O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧培養(yǎng)基的pH值為7～7.2；每升固體分離培養(yǎng)基由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH2PO4、62～68mg的K2HPO4、1.2～1.4g的(NH4)2SO4、120～160mg的CaCl2·2H2O、1.6～2g的MgSO4·7H2O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的維生素液、14～16g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體分離培養(yǎng)基的pH值為7～7.2；每升液體分離培養(yǎng)基是由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH2PO4、62～68mg的K2HPO4、1.2～1.4g的(NH4)2SO4、120～160mg的CaCl2·2H2O、1.6～2g的MgSO4·7H2O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體分離培養(yǎng)基的pH值為7～7.2。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的微量元素液中FeClr6H20的濃度為1.5g/L、H3B03的濃度為0.15g/L，CuS04.5H20的濃度為0.03g/L、KI的濃度為0.18g/L、MnCl2'4H20的濃度為0.12g/L、Na2M04'2H20的濃度為0.06g/L、ZnS04'7H20的濃度為0.12g/L和CoCl2.6H20的濃度為0.15g/L。，3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基，其牛寺征在于厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基中的維生素液中維生素B,的濃度為50mg/L、維生素B2濃度為50mg/L、維生素B6的濃度為100mg/L、維生素B!2的濃度為lg/L、葉酸的濃度為20mg/L、煙酸的地度為50mg/L，泛酸鈣的濃度為50mg/L、對氨基苯甲酸的濃度為50mg/L和生物素的濃度為20mg/L。4、篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法，其特征在于篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法按照以下步驟進(jìn)行一、配制如權(quán)利要求1所述的厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥60ml進(jìn)行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于100mL的血清瓶中；三、厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)將60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基倒于步驟二的血清瓶中與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)2325h;四、好養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)2326h;五、厭養(yǎng)譜養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有60ml步驟一配制的厭氧培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣5分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)2326h;六、循環(huán)操作步驟四至五2~4次，對活性污泥進(jìn)行馴化，得到厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液；七、將歩驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有75ml的步驟一配制的好氧培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)2326h;八、取lmL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行等梯度稀釋；九、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一紀(jì)制的固體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十、挑取步驟九中固體分離培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體分離培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)2024h;十一、重復(fù)操作步驟八至十3~8次獲得純菌株；十二、對步驟九得到的純菌株進(jìn)行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法，其特征在于.步驟二中的污泥在轉(zhuǎn)速為40005000轉(zhuǎn)/分的條件下，離心1520分鐘。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法，其特征在于步驟四、步驟五和步驟七中離心轉(zhuǎn)速均為40005000轉(zhuǎn)/分，離心時間均為15-20分鐘。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法，其特征在于步驟九中等梯度稀釋的稀釋梯度倍數(shù)為10、10"咅。8、根據(jù)權(quán)利要求4、5或7所述的強(qiáng)化生物除磷功能菌的篩選方法，其特征在于步驟十二中純菌株的性能檢測方法按照以下步驟進(jìn)行A、配制權(quán)利要求4中步驟一所述的厭氧培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；B、取lmL權(quán)利要求4分離得到的純菌株的菌液置于40mL步驟A配制的液體分離培養(yǎng)基中，在162(TC搖床中培養(yǎng)11.5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1520分鐘，棄上清留沉淀；C、再向50mL離心管中加入30ml步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于162(TC的搖床中培養(yǎng)L52.5h;D、將離心管置于4000~5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1520分鐘，棄上清留沉淀;E、再向步驟D50mL的離心管中加入30ml步驟A配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣1.52.5小時；F、將離心管置于40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心15~20分鐘，棄上清留沉淀；G、循環(huán)操作步驟C至F1015次進(jìn)行菌種的馴化；H、向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟A配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣5分鐘，密封置于162(TC的搖床中培養(yǎng)L52.5小時；I、將離心管置于40005000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1520分鐘，棄上清留沉淀；J、向步驟H50mL的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)1.5~2.5小時，用鉬酸銨分光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為l-b/a，即確定了生物除磷功能菌的除磷性能；其中其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的體積比為0.5:1;歩驟E和歩驟I中每升好氧檢測培養(yǎng)基是由35~40mg的KH2P04、6268mg的K2HP04、120~160mg的(麗4)2S04、12~16mg的CaCl2.2H20、160200mg的MgS04.7H20、0.10.6mL的微量元素液、0.5~1.5mL的維生素液和余量的蒸餾水組成,好氧檢測培養(yǎng)基的pH值為77.2。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的強(qiáng)化生物除磷功能菌的篩選方法，其特征在于步驟十二中對純菌株進(jìn)行鏡檢，通過鏡檢觀察確定權(quán)利要求4分離得到純菌株的形態(tài)為四聚體形態(tài)，即確定純菌株為強(qiáng)化生物除磷功能菌中的聚糖菌。:'全文摘要強(qiáng)化生物除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基及篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法，它涉及一種除磷功能菌篩選用培養(yǎng)基及篩選除磷功能菌的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的篩選強(qiáng)化生物除磷功能菌的方法針對性差，得到強(qiáng)化生物除磷功能菌的菌株數(shù)量少及所用的培養(yǎng)基不適合強(qiáng)化生物除磷功能菌生長的問題。篩選用培養(yǎng)基為厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基和液體分離培養(yǎng)基；方法一、配制培養(yǎng)基；二、取污泥；三、厭氧培養(yǎng)基；四、好氧培養(yǎng)基；六、厭氧培養(yǎng)基；七、循環(huán)操作四至六2～4次、八、等梯度稀釋；九、固體分離培養(yǎng)基；十、液體分離培養(yǎng)基；十一、重復(fù)八至十3～8次；十二、檢測。本發(fā)明方法針對性強(qiáng)，篩選得到的功能菌數(shù)量多，培養(yǎng)基適合功能菌的生長。文檔編號C12N1/00GK101560470SQ20091007209公開日2009年10月21日申請日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者涵亢,任南琪,王秀蘅申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)