專利名稱：棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得及利用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得及利用方法，其屬食用菌生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食用菌生產(chǎn)是在栽培料上繁殖特定菌類并獲得子實體的過程，由于菌類無處不在，食用菌栽培原料上也一樣，含有大量的雜菌，這些菌類的存在對栽培菌類具有很大影響，因此在正常菌類播種前，需要對這些菌類進行技術(shù)處理，達到的最高目標是栽培料的無菌化，最低目標是既便存有一些菌類，對正常菌類的生長也不產(chǎn)生大的負面影響。處理料內(nèi)雜菌的方法是高壓、常壓蒸汽滅菌、發(fā)酵控菌和藥物抑殺菌，究竟選用何種處理方法與菇類的適應(yīng)性和料的種類等因素密切相關(guān)。以棉籽殼作主料栽培不同的
食用菌種類為例，栽培平菇時的處理方法常選用的是藥物抑殺菌；栽培雙孢菇時的料處理方法常選用的是一次或二次發(fā)酵控菌；栽培金針菇、杏鮑菇、白靈菇、靈芝、猴頭、黑木耳等大多數(shù)種類時的滅菌處理方法則是蒸汽滅菌，在蒸汽滅菌當中應(yīng)用最廣泛的又是常壓蒸汽滅菌。
棉籽殼是人工代料栽培食用菌最常用的大宗原料，俗稱主料，為提高栽培效果，需拌加10 30%的麩皮，少量的玉米面、豆粉，以及微量的石膏、石灰等輔料。主輔料與1 1.1 (-1.7)倍重(w/w)的水混合拌勻，就形成了種植食用菌的栽培料。棉籽殼、麩皮等主輔料均含有雜菌，二者相比，麩皮的雜菌含量為高，所以，栽培料配方中麩皮比例越高，雜菌總量就越高。
對于需要應(yīng)用常壓蒸汽滅菌來處理栽培料的食用菌種類講，滅菌處理的效果直接影響栽培菌類菌絲在料內(nèi)的生長勢和生長量，進而決定生物轉(zhuǎn)化率(產(chǎn)量)的高低，其間的關(guān)系是食用菌在滅菌效果好的料內(nèi)生長勢好和生長量大，將來出菇時產(chǎn)量高。因此，在栽培料配方一定的前提下，達到好的滅菌效果是實現(xiàn)高產(chǎn)的根本出路。
1、 食用菌常壓蒸汽滅菌技術(shù)現(xiàn)狀
(1) 設(shè)施類型常壓滅菌設(shè)施常見的有滅菌k、滅菌槽、滅菌包三
種樣式，均為自行建造或組配的非標設(shè)施。其中，滅菌灶是蒸料倉與蒸汽發(fā)生裝置(大鐵鍋)一體的滅菌設(shè)施，蒸汽由直接加熱鐵鍋內(nèi)的水而產(chǎn)生;滅菌包是蒸料倉與蒸汽發(fā)生裝置分離的滅菌設(shè)施，蒸汽由蒸汽鍋爐或加熱水桶產(chǎn)生，通過管道輸入到蒸料倉。
滅菌灶是在灶上安放大鐵鍋，然后在鍋臺上用水泥、磚和鋼筋砌建蒸料倉而成。
滅菌槽是用水泥、磚砌成的長方形或方形蒸倉，蒸料倉的頂部或一側(cè)開口作裝出料口用。
滅菌包是在平整的地面上直接碼放待滅菌的、已裝填有栽培料的塑料袋，然后加蓋塑料薄膜、苫布，將料袋堆臨時包裹而成的蒸料倉。
(2) 常壓滅菌過程包括如下步驟:①往蒸料倉內(nèi)擺放待滅菌的料袋；②用木板塑料布等堵嚴或苫嚴料倉口 ；③點火產(chǎn)汽升溫或往蒸料倉里通蒸汽，見冒大氣時開始計時，維持一段時間停止加熱或供氣；④自然冷卻出鍋，滅菌結(jié)束。
從上述常壓滅菌的設(shè)施和操作來看，其滅菌效果與蒸汽量、待滅菌的料量、作用時間及物料排列疏密程度等多種因素有關(guān)，不是一個規(guī)范的工藝。由于常壓蒸汽的穿透力有限，加上蒸料倉內(nèi)的栽培料所處的位置不同，栽培料的干濕狀態(tài)含水量不同，所以其受熱的方式存在很大的不同，有的是被蒸汽直接穿透加熱，但絕大部分是蒸汽加熱栽培袋內(nèi)的濕料，再產(chǎn)生的次級蒸汽用于滅菌。
2、 食用菌常壓蒸汽滅菌效果檢驗的現(xiàn)狀(1) 滅菌料袋直接培養(yǎng)法該法是被推薦用來檢測的方法，其是將滅菌后的料袋，放到培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 7天后觀察有無雜菌菌落出現(xiàn)。實際生產(chǎn)中種菇戶不可能添置專門的培養(yǎng)箱用于滅菌檢驗，由于滅菌量大袋多，培養(yǎng)箱容積也不能滿足檢驗需要；再者從原理上分析，這種培養(yǎng)方法
較適合霉菌的檢驗，霉菌具有絲狀的菌絲和大的菌落，容易觀察到，而細菌在棉籽殼上不易形成肉眼可見的菌落，加上流動性差，處于料袋里層的
細菌極不可能擴散到表面形成菌落;所以直接培養(yǎng)料袋法來進行雜菌檢驗不實用也不可靠，實際生產(chǎn)中未被采用。
(2) 依靠滅菌時長來判定生產(chǎn)上對常壓滅菌如何達標，最明確的指標是滅菌時間，且差別很大，從6小時到16小時或更多的都有，都是從各自的經(jīng)驗來說的，使生產(chǎn)者無所適從。另外，僅有滅菌時間指標，又誤導(dǎo)了生產(chǎn)者，使其認為只要滅菌耗時長就能達到好的滅菌效果，而從不顧及滅菌料的多寡等因素，甚至把長的滅菌時間當成了優(yōu)良滅菌效果的代名詞。生產(chǎn)實際中，滅菌時間長的栽培料同樣出現(xiàn)問題，所以，用滅菌時間判定滅菌效果不可靠。
(3) 應(yīng)用高壓蒸汽滅菌監(jiān)測法檢驗栽培料常壓蒸汽滅菌效果的可能性
① 高壓滅菌化學(xué)指示卡檢測法高壓滅菌化學(xué)指示卡與特定滅菌參數(shù)緊密相關(guān)，指示的是高于IO(TC時某溫度(普遍的是121。C和134°C)的受熱溫度和受熱時間，食用菌栽培料常壓滅菌的溫度一般均低于100°C，密閉好、火力猛的情況下，短時間可高于10(TC，但極少能升至103°C，所以不能用來指示食用菌栽培料的常壓滅菌效果。
② 高壓滅菌生物指示劑監(jiān)測法高壓蒸汽滅菌生物指示劑是由嗜熱脂肪桿菌(ATCC 7953)芽孢菌片、恢復(fù)培養(yǎng)基和外管組成。適用于121。C下排氣式壓力蒸汽滅菌器、132。C 134。C預(yù)真空或脈動真空壓力蒸汽滅菌器、134"C 136"C臺式或卡式壓力蒸汽滅菌器滅菌效果的監(jiān)測和制藥工業(yè)、醫(yī)院制劑生產(chǎn)等各行業(yè)使用的壓力蒸汽滅菌器滅菌效果的監(jiān)測。應(yīng)用范圍不包括蒸汽常壓滅菌。若直接用于栽培料的常壓滅菌檢測，表面存在 以下障礙①操作復(fù)雜，滅菌后還需在無菌條件下將被滅的菌載體轉(zhuǎn)移至 液體培養(yǎng)基內(nèi)。②菌培養(yǎng)條件嚴格，需要50 6(TC恒溫培養(yǎng)設(shè)施。③成
本高， 一個測試管就需要20元，首先限制了在食用菌栽培料常壓滅菌監(jiān) 測上的應(yīng)用。另一方面，在將脂肪桿菌(ATCC 7953)芽孢菌片用于栽培 料常壓滅菌監(jiān)測的實驗表明，按相同的處理方法和程序進行常壓滅菌，常 溫培養(yǎng)表現(xiàn)為不能生長或死亡，但還有殘留細菌類雜菌存在，該殘留菌類 在栽培料的營養(yǎng)條件下，在栽培菌類菌絲正常發(fā)菌階段所處的20 35°C 范圍內(nèi)，能正常生長，進而危害正常菌的生長。所以現(xiàn)有高壓滅菌生物指 示菌及其劑型均不適于進行食用菌栽培料的常壓蒸汽滅菌效果監(jiān)測。
綜上所述，目前對食用菌栽培料的常壓滅菌效果監(jiān)測還沒有可靠適用 的生物監(jiān)測手段，而該技術(shù)的核心是有關(guān)指示菌的獲得方法及其利用技 術(shù)，這些均是要進行常壓滅菌效果監(jiān)測需解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究出一種從棉籽殼栽培料中獲得與栽培料內(nèi)常壓滅菌殘留 菌危害發(fā)生條件相一致，且能夠指示常壓滅菌效果的菌類的方法，再把獲 得的菌類制成了一種簡易直觀的劑型，用于判定棉籽殼栽培料常壓蒸汽滅 菌的效果。
為了解決上述技術(shù)的問題，本發(fā)明棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示 菌的獲得，是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
(1) 雜菌分散細菌培養(yǎng)基其配方為栽培料1 50%、蛋白胨1%、酵
母浸粉0. 5%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%、瓊脂粉1. 5 2。/Q，制作時先 用部分水冷浸提栽培料中雜菌，然后與預(yù)溶的其它組分混合煮沸，即可分 裝成試管，試管封口，將雜菌分散到處于封閉體系的細菌培養(yǎng)基中；
(2) 不同時長的常壓蒸汽滅菌處理處理含雜菌分散細菌培養(yǎng)基時間 按等差時長排列，時長的最大取值長于全部殺死雜菌所需的時間；(3) 較低常溫恢復(fù)培養(yǎng)選用20 24'C溫度培養(yǎng)，此溫度是栽培菌 類發(fā)菌階段所處環(huán)境偏低的溫度，也是細菌類雜菌生長繁殖需要偏低的溫 度，從而保證所選擇的是與栽培菌類生長所需溫度一致的菌類；
(4) 最抗常壓滅菌條件的殘留菌揀出在達到完全殺菌狀態(tài)前最后 出現(xiàn)的單孢菌落；
(5) 棉籽殼栽培料上生長能力檢驗檢驗殘留菌在純栽培料上的生
長能力，選用的是低麩皮含量(麩皮:棉籽殼為0 5:100 95)的純栽培 料培養(yǎng)基，配方為栽培料5 50%、瓊脂粉1. 5 2%，制作時取栽培料煮汁， 接種后20 24'C培養(yǎng)，從而保證所選擇的是與栽培菌類生長所需營養(yǎng)一 致的菌類；
(6) 常壓滅菌指示能力檢驗檢驗殘留菌指示滅菌效果的能力，是用 等重量的栽培料和殘留菌麩皮制劑，分別按干料、濕料、水浸料三種狀態(tài)， 同時進行不同時長常壓滅菌處理，灌注常規(guī)細菌培養(yǎng)基后在較低室溫下
(20 24。C)培養(yǎng)，比較細菌恢復(fù)生長情況，從而保證所選擇的是具有指 示栽培料內(nèi)處于各種水分狀態(tài)下的雜菌被常壓蒸汽殺滅效果能力的菌類;
本發(fā)明棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的利用方法，通過以下技術(shù) 方案實現(xiàn)
(1) 直觀型指示劑含有指示菌芽孢、增色劑的滅菌固體粉狀細菌
培養(yǎng)基，分裝在透明耐高溫瓶內(nèi)，每個指示劑單元(每瓶)含有一定數(shù)量 的指示菌芽孢。
(2) 滅菌固體粉狀細菌培養(yǎng)基常規(guī)細菌培養(yǎng)基，其加水凝結(jié)成塊 后，本身即具有或添加增色劑后而具有與菌落顏色反差大的顏色，能夠直 接觀察出指示菌的生長情況；
(3) 增色劑 一種水溶性顏料物質(zhì)，添加在固體粉狀細菌培養(yǎng)基內(nèi)，
加水后凝成的瓊脂塊與菌落顏色具有大的反差，能夠直接觀察出指示菌的 生長情況。本發(fā)明棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得，還可以通過以下 技術(shù)方案實現(xiàn)以上所述的試管封口采用棉花或透氣膠塞塞封。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是為研發(fā)棉籽殼栽培料常壓滅 菌效果的生物檢測技術(shù)奠定了指示菌獲得及其指示菌制作方法基礎(chǔ)。應(yīng)用 本方法，能使棉籽殼栽培料的滅菌效果由不易評價轉(zhuǎn)變成能夠被快速直觀 監(jiān)測，促使殺菌效率獲得穩(wěn)定提升，進而提高生物轉(zhuǎn)化率。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述 1、指示菌的獲得方法
獲得指示菌流程:確定高雜菌含量栽培料配方一栽培料雜菌浸提一含 雜菌細菌培養(yǎng)基制備一常壓蒸汽處理含雜菌的細菌培養(yǎng)基一室溫(20 24 'C)恢復(fù)培養(yǎng)一最抗常壓條件殘留菌(單孢)撿出一殘留菌擴繁一栽培料 生長能力檢驗一滅菌效果指示能力檢驗一指示菌獲得。具體過程如下
(1) 確定栽培料配方選定陳舊棉籽殼麩皮為7:3的栽培料配方。
(2) 栽培料預(yù)處理按(1)所述配方確定的比例稱好棉籽殼和麩皮， 混合均勻，35匸烘箱內(nèi)烘干，粉碎至過40目篩，高速攪拌器混合均勻。
(3) 含雜菌細菌培養(yǎng)基制備含雜菌細菌培養(yǎng)基配方為栽培料10%、 蛋白胨1%、酵母浸粉0. 5%、氯化鈉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%、瓊脂粉1. 5%。 具體制作是
① 浸提栽培料中雜菌稱取栽培料后，放入三角瓶或燒杯內(nèi)，常壓滅 菌前1小時，加入欲制作培基所需蒸餾水總量的70% ，振蕩器振蕩25分 鐘，雙層紗布過濾并擠壓濾渣，濾液即為雜菌懸液。
② 含雜菌細菌培養(yǎng)基制備用欲制作培基所需蒸餾水總量的30%預(yù) 溶化瓊脂后，倒入雜菌浸提液，再加入預(yù)濕或預(yù)溶的蛋白胨、酵母浸粉、 氯化鈉、磷酸氫二鉀，沸騰后定容，分裝試管，每試管裝10毫升培養(yǎng)基。 這樣每支試管將各包含1克栽培料所含的雜菌。(4) 常壓蒸汽處理含細菌培養(yǎng)基試管將已裝在鐵絲筐內(nèi)的含菌試管 迅速放入常壓滅菌鍋內(nèi)，封閉鍋蓋，開始計時，調(diào)大火力使溫度迅速達到
iocrc，然后調(diào)小火力，保持住i(xrc，到時間后關(guān)火，迅速出鍋，擺放斜面。
設(shè)定的常壓滅菌最短滅菌時長為1小時，最長滅菌時長初定為14小 時，時間間隔為l小時，同一個滅菌鍋完成所有各時間段的滅菌處理。處 理順序為先長時間后短時間，若初定的最長時長試管培養(yǎng)后有細菌恢復(fù)生 長，則由此往延長時長方向做起，增加的時間間隔仍為1小時，直至連續(xù) 兩個時長處理沒有細菌恢復(fù)生長時止。
從用水浸提栽培料雜菌，到含雜菌培養(yǎng)基試管的制備，均應(yīng)在1小時 內(nèi)完成，到1小時時，對含菌試管進行常壓滅菌處理。
(5) 殘留菌的室溫恢復(fù)培養(yǎng)擺放試管的培養(yǎng)室溫度應(yīng)控制在20 24°C。
(6) 最抗常壓滅菌的殘留菌(單孢)撿出在培養(yǎng)階段不斷觀察，會 發(fā)現(xiàn)試管有菌恢復(fù)的比例隨著滅菌時長的延長越來越小，若最后連續(xù)2 個滅菌時長處理均不出現(xiàn)細菌恢復(fù)，表明己達到完全殺菌狀態(tài)。在達到完 全殺菌狀態(tài)前出現(xiàn)的單孢菌落就是最耐常壓滅菌的菌類，將該菌轉(zhuǎn)接到 LB細菌培養(yǎng)基斜面試管上，培養(yǎng)留存。
LB細菌斜面試管培養(yǎng)基配方為蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉 0.5%、瓊脂粉1.5 2%、 pH7.4 7.6。分裝試管，12rC下滅菌50分鐘， 擺放斜面。
(7) 殘留菌在栽培料上生長能力檢驗檢驗用培養(yǎng)基配方純棉籽殼 栽培料10%、瓊脂粉1.5%。制作過程是用沸水煮栽培料25分鐘，雙層紗 布過濾，濾液溶化瓊脂，分裝試管，12rc高壓滅菌i小時，出鍋擺放斜 面。
具體檢驗過程將殘留菌劃線接種在檢驗用培養(yǎng)基上，20 24。C溫度下培養(yǎng)。若在24 36小時內(nèi)能形成明顯大片菌落，表示該菌能在栽培料
所提供的營養(yǎng)水平上，和在栽培菌類正常發(fā)菌所處環(huán)境溫度(20 35°C) 下生長活動，然后將其制成麩皮菌劑進入常壓滅菌效果指示能力檢驗程
(8) 制備殘留菌麩皮菌劑
① 培養(yǎng)斜面菌種斜面培養(yǎng)基為LB細菌培養(yǎng)基，配方及制作同上述。 劃線接種步驟(7)獲得的殘留菌，36i:下培養(yǎng)48小時。
② 制備殘留菌麩皮菌劑選用固體發(fā)酵法。發(fā)酵料配方中麩皮(10 60目粒度)、豆粉、磷酸氫二鉀、水的配比為500:100:1:440。發(fā)酵料各 組分混合均勻后，12rC滅菌2小時。接入用無菌水洗脫的斜面試管殘留 菌菌苔，發(fā)酵料麩皮、豆粉總干重與所用液體菌種體積的比例為6:1。 36 。C下培養(yǎng)48小時，24。C下培養(yǎng)48小時，35。C下干燥48小時，80。C下20 分鐘殺死營養(yǎng)體，35"C下烘干至恒重，無菌條件下研磨或粉碎開干結(jié)的麩 皮塊。
平板計數(shù)，平板計數(shù)用培養(yǎng)基為LB細菌培養(yǎng)基，配方及制作同上述。 用無菌麩皮把殘留菌麩皮菌劑的殘留菌孢子數(shù)調(diào)整到10、fu/克。
(9) 指示常壓蒸汽滅菌效果的能力檢驗
① 常壓蒸汽滅菌效果能力檢驗用培養(yǎng)基配方為LB細菌培養(yǎng)基，但 根據(jù)驗證需要，有的制成斜面試管，有的先分裝在500毫升輸液瓶內(nèi)，滅 菌后再無菌分裝在經(jīng)常壓滅菌處理，已經(jīng)含有殘留菌麩皮菌劑或栽培料的 試管內(nèi)。
② 驗證用材料及預(yù)處理驗證用材料為殘留菌麩皮菌劑和栽培料，樣 品重以干重計均為0.23克。根據(jù)驗證材料拌加水情況，分設(shè)干料、濕料 和水浸料三種情形作常壓滅菌處理。
干料處理將殘留菌麩皮菌劑和栽培料分裝在無菌的試管內(nèi)。 濕料處理在進入IO(TC蒸鍋前2小時用無菌水拌濕，在按折干料重0. 23克量的濕料分裝在無菌的試管內(nèi)。栽培料拌加的水量是干重的1. 25
倍，麩皮菌劑拌加的水量是其干重的1倍。
水浸料處理將殘留菌麩皮菌劑和栽培料在進入IO(TC蒸鍋前O. 5小 時無菌分裝在LB斜面試管的底部。
(D指示滅菌效果能力的檢驗殘留菌麩皮菌劑和栽培料以干料、濕 料、水浸料三種狀態(tài)同時進入IO(TC常壓滅菌程序。滅菌時長分別為1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10個小時。含有干料和濕料的試管滅菌后，無菌 條件下倒入LB細菌培養(yǎng)基，每支管裝量10毫升，擺放斜面，含有水浸料 的試管滅菌后直接擺放斜面。20 24。C培養(yǎng)。根據(jù)殘留菌麩皮菌劑和栽培 料同一料處理狀態(tài)的出菌情況，判定殘留菌對常壓滅菌效果的指示能力， 標準是當含殘留菌的試管沒有細菌菌落出現(xiàn)時，同一常壓滅菌時間的栽 培料試管已經(jīng)且均沒有細菌菌落產(chǎn)生。通過本實驗的殘留菌，表明其具有 指示滅菌效果的能力，即成為所要獲得的指示菌。
2、指示菌的利用方法
指示菌的利用即是把其制作成生物指示劑瓶，其制作過程是指示菌 繁殖一制作指示菌麩皮干粉菌劑一干粉菌劑的稀釋一計算指示劑的配比 —指示劑的混勻一分裝一應(yīng)用。以下為具體做法。
(1) 指示菌繁殖指示菌繁殖即培養(yǎng)斜面菌種，所用斜面試管培養(yǎng)基 為LB細菌培養(yǎng)基，配方及制作同上述。劃線接種獲得的指示菌，36t:下培 養(yǎng)48小時。
(2) 制作指示菌麩皮干粉菌劑選用固體發(fā)酵法。發(fā)酵料配方中麩皮 (10 60目粒度)、豆粉、磷酸氫二鉀、水的配比為500:100:1:440。發(fā)
酵料各組分混合均勻后，12rC滅菌2小時。接入用無菌水洗脫的斜面試 管殘留菌菌苔。發(fā)酵料麩皮、豆粉總干重與所用液體菌種體積的比例為 6:1。 36。C下培養(yǎng)48小時，24。C下培養(yǎng)48小時，35。C下干燥48小時，80 。C下20分鐘殺死營養(yǎng)體，35'C下烘干至恒重，無菌條件下研磨開干結(jié)的麩皮塊。平板計數(shù)。平板計數(shù)用培養(yǎng)基為LB細菌培養(yǎng)基。
(3) 干粉菌劑的稀釋用滅菌的10 60目粒度的麩皮稀釋所獲得的 指示菌麩皮干粉菌劑，使指示菌孢子濃度為1(T"'Vfu/克。
(4) 指示劑的組成和配比計算指示劑由指示菌、滅菌粉狀固體細菌
培養(yǎng)基、增色劑組成。指示菌為孢子濃度為1(T"'cfu/克的麩皮菌劑；滅
菌粉狀固體細菌培養(yǎng)基配方為蛋白胨1%、酵母浸粉0. 5%、氯化鈉0. 5%、 磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂粉2%;增色劑為焦糖色。l個指示劑單元包含的 指示菌量是固定的，為0.23克；所需滅菌粉狀固體細菌培養(yǎng)基的量與分
裝容器大小有關(guān)，焦糖色的量則與固體細菌培養(yǎng)基的量有關(guān)，其為該固體
細菌培養(yǎng)基形成瓊脂平板所加水重量的0. 5%。若以擬裝40毫升瓊脂培養(yǎng) 基的IOO毫升輸液瓶為分裝容器，麩皮菌劑、滅菌粉狀固體細菌培養(yǎng)基、 焦糖色的比例關(guān)系為23:168:20。這樣1個指示劑單元則含有0.23克麩 皮菌劑、1. 68克滅菌粉狀固體細菌培養(yǎng)基和0. 2克焦糖色。
(5) 指示劑的混勻若以擬裝40毫升瓊脂培養(yǎng)基的100毫升輸液瓶 為分裝容器，則按23:168:20的比例分別稱取麩皮菌劑、滅菌粉狀固體細, 菌培養(yǎng)基和焦糖色，用混勻器混勻。
(6) 分裝若以擬裝40毫升瓊脂培養(yǎng)基的100毫升輸液瓶為分裝容 器，需將麩皮菌劑、固體培養(yǎng)基、增色劑按23:168:20的比例混勻，然后 稱取2. ll克混合物倒入輸液瓶內(nèi)。分裝后膠塞封口，干燥處存放。輸液 瓶具有透明、結(jié)實、廉價易得的特點。
(7) 指示劑的應(yīng)用
① 瓶內(nèi)注水臨滅菌前兩個小時內(nèi)，用一次性注射器分次吸取共40 毫升自來水，注入指示瓶內(nèi)。搖晃均勻。
② 伴隨滅菌將指示瓶裝入料袋內(nèi)的中間位置，或者擠在料袋中間， 含指示劑瓶的料袋或指示瓶應(yīng)放在距蒸汽管道出口較遠、位置偏低，蒸汽 最不宜達到的地方，伴隨栽培料袋一同滅菌。 一噸栽培料(干重)建議用2 3個指示瓶。
③ 出鍋培養(yǎng)出鍋后將指示瓶趁熱放置在常溫下溫度最高、遮陰的地 方培養(yǎng)。若出鍋時瓶內(nèi)培養(yǎng)基已經(jīng)凝固，擺放時則隨凝固的形狀擺放，使 凝固的培養(yǎng)基平面朝上。
④ 滅菌效果判定培養(yǎng)1 2天后，若培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大面積近白色 不透明的菌苔，表明該批次料滅菌不達標；若培養(yǎng)基表面出現(xiàn)單個白色或 近白色不透明的菌落，表明該批次料滅菌基本達標；若不出現(xiàn)菌落表示滅 菌達標。對滅菌不達標的料，如己接種應(yīng)加強通風管理，特別是降低發(fā)菌 溫度，防止雜菌爆發(fā)產(chǎn)生危害，未接種的建議重新滅菌；對基本達標的料， 也應(yīng)加強通風管理，降低發(fā)菌溫度，防止雜菌過快恢復(fù)生長。另一方面， 再滅菌時，應(yīng)延長滅菌時間，降低料袋排列緊密程度，增加火力。
權(quán)利要求
1、一種棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得，其特征在于(1)雜菌分散細菌培養(yǎng)基其配方為栽培料1～50％、蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化鈉0.5％、磷酸氫二鉀0.2％、瓊脂粉1.5～2％，制作時先用部分水冷浸提栽培料中雜菌，然后與預(yù)溶的其它組分混合煮沸，即可分裝成試管，試管封口，將雜菌分散到處于封閉體系的細菌培養(yǎng)基中；(2)不同時長的常壓蒸汽滅菌處理處理含雜菌分散細菌培養(yǎng)基時間按等差時長排列，時長的最大取值長于全部殺死雜菌所需的時間；(3)較低常溫恢復(fù)培養(yǎng)選用20～24℃溫度培養(yǎng)，此溫度是栽培菌類發(fā)菌階段所處環(huán)境偏低的溫度，也是細菌類雜菌生長繁殖需要偏低的溫度，從而保證所選擇的是與栽培菌類生長所需溫度一致的菌類；(4)最抗常壓滅菌條件的殘留菌揀出在達到完全殺菌狀態(tài)前最后出現(xiàn)的單孢菌落；(5)棉籽殼栽培料上生長能力檢驗檢驗殘留菌在純栽培料上的生長能力，選用的是低麩皮含量(麩皮∶棉籽殼為0～5∶100～95)的純栽培料培養(yǎng)基，配方為栽培料5～50％、瓊脂粉1.5～2％，制作時取栽培料煮汁，接種后20～24℃培養(yǎng)，從而保證所選擇的是與栽培菌類生長所需營養(yǎng)一致的菌類；(6)常壓滅菌指示能力檢驗檢驗殘留菌指示滅菌效果的能力，是用等重量的栽培料和殘留菌麩皮制劑，分別按干料、濕料、水浸料三種狀態(tài)，同時進行不同時長常壓滅菌處理，灌注常規(guī)細菌培養(yǎng)基后在較低室溫下(20～24℃)培養(yǎng)，比較細菌恢復(fù)生長情況，從而保證所選擇的是具有指示栽培料內(nèi)處于各種水分狀態(tài)下的雜菌被常壓蒸汽殺滅效果能力的菌類；
2、如權(quán)利要求1所述的棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的利用 方法，其特征在于(1) 直觀型指示劑含有指示菌芽孢、增色劑的滅菌固體粉狀細菌 培養(yǎng)基，分裝在透明耐高溫瓶內(nèi)，每個指示劑單元(每瓶)含有一定數(shù)量 的指示菌芽孢。(2) 滅菌固體粉狀細菌培養(yǎng)基:常規(guī)細菌培養(yǎng)基，其加水凝結(jié)成塊后， 本身即具有或添加增色劑后而具有與菌落顏色反差大的顏色，能夠直接觀 察出指示菌的生長情況；(3) 增色劑 一種水溶性顏料物質(zhì)，添加在固體粉狀細菌培養(yǎng)基內(nèi)， 加水后凝成的瓊脂塊與菌落顏色具有大的反差，能夠直接觀察出指示菌的 生長情況。
3、如權(quán)利要求1所述的棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的的獲得，其特征在于所述的試管封口采用棉花或透氣膠塞塞封。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得及利用方法。屬于食用菌生產(chǎn)的技術(shù)領(lǐng)域。其用于解決對食用菌栽培料的常壓滅菌效果監(jiān)測的生物監(jiān)測手段問題。棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得及利用方法是將棉籽殼栽培料中的雜菌分散到處于封閉體系的細菌培養(yǎng)基中，按照常壓滅菌程序進行不同時長的滅菌處理，較低常溫下恢復(fù)培養(yǎng)，選擇雜菌全部殺死前最后殘留的菌，再經(jīng)過棉籽殼栽培料上生長能力檢驗和常壓滅菌效果指示能力檢驗后所獲得的菌即為指示菌。這種棉籽殼栽培料常壓滅菌效果指示菌的獲得及利用方法可廣泛地應(yīng)用于食用菌的生產(chǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK101591627SQ20091007459
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者王世清, 王朝江, 王立安, 高春燕 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所