專利名稱：人工合成豬生長激素基因及其表達純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術，具體涉及編碼動物蛋白質的基因，更具體地說是一種人工 合成豬生長激素基因及其表達純化方法。
背景技術：
我國是一個以食用豬肉為主的養(yǎng)豬大國，存欄數(shù)達到約5億頭之多，豬肉產量占世界產量 的55%以上。生豬"瘦肉精"的殘留在我國己經(jīng)造成多起中毒事件，引起我國政府的關注。在 豬肉產量、品質和人類健康之間產生了生產者和消費者的矛盾。解決這一矛盾的有效途徑是 找到一種更為安全的生長調節(jié)劑，同時提高肉產品的品質和產量，使生產者和消費者能同時接 受。
豬生長激素(porcine growth hormone, PGH)是由豬腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一 肽鏈的蛋白質激素(190-191aa)。給豬注射外源PGH，能顯著提高豬的生長速率，降低單位飼 料的消耗量，促進肌肉的生長和減少組織的脂肪合成。最主要的是，PGH為蛋白質類激素制 品，不同于固醇類激素和人工合成的生長調節(jié)物質(如瘦肉精)，不在動物體內殘留，使生肉 產品更為安全，是一種生產者和消費者都能接受的生長調節(jié)劑。
PGH最早是從豬的機體組織中提取的，但從腦垂體提取PGH成本太高既花費時間和精力， 而且產量很有限，無法應用于大規(guī)模的生產。隨著科技的發(fā)展，人們開始通過微生物生產該 激素，Evock(Evocketal., 1991)等人首次用DNA重組技術在大腸桿菌(Eco//)中表達了重組 豬生長激素(rPGH)，其生物活性與由腦垂體提取的生長激素相同。目前為止，用大腸桿菌 表達系統(tǒng)得到的PGH多以包涵體形式存在，需包涵體的體外溶解并且蛋白質得到重新正確折 疊后才有活性；其次是PGH表達的表達量不夠高，經(jīng)過變復性后，最后得到的純化的可溶性 PGH的產量偏低，不能用于工業(yè)大規(guī)模制備，因此，PGH的高成本限制了其在生產中的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能在大腸桿菌中高效表達的人工合成豬生長激素基因及其表 達純化方法，該方法適合于豬生長激素的大規(guī)模制備。
本發(fā)明根據(jù)已報道0 ://^^11(^.111111.11化《(^/)的豬生長激素的氨基酸序列和大腸桿菌 偏愛密碼子的使用原則，設計編碼與豬體內氨基酸序列一致的豬生長激素的核苷酸序列，進 行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達，并利用酸堿度進行包涵體變復性，得到純化的可 溶性PGH。
3本發(fā)明提供的一種人工合成豬生長激素基因，是序列表中SEQ ID N01的核苷酸序列。 該人工合成豬生長激素基因長度為576bp的PGH基因序列，編碼191個氨基酸。 人工合成豬生長激素基因在大腸桿菌中的表達純化方法，包括如下步驟-
(1) 構建含有人工合成的PGH基因的重組質粒pET-28a+-PGH;
(2) 將重組質粒pET-28a+-PGH轉化至宿主細胞BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的工程 菌株；
(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)，當工程菌培養(yǎng)液濃度OD6oo達到0.6-0.8時， 加入0.5mmol/LIPTG， 37。C誘導表達6小時，得到高效表達的PGH包涵體；離心，棄上清， 清洗包涵體；
(4) 逐滴加入pH為12的含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris緩沖液，溶解PGH包涵體；
(5) 按0.1mL/min逐滴緩慢加入pH為8.5，含有50mmol/LTris、 sucrose 5%、 2mol/LUrea 的復性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清，得到可溶性的PGH;
(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH純度鑒定，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單峰。10% SZM-iMGE分析經(jīng)變復性實 驗及純化的目的蛋白質，結果顯示，本發(fā)明得到了電泳純的目的蛋白質；Western blotting鑒 定結果進一步證實目的蛋白質及其純度。
與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明的優(yōu)點和效果
本發(fā)明使用了大腸桿菌偏愛密碼子設計了 PGH的基因序列，在大腸桿菌中得到了高效 表達，比之前的方法在表達量上有很大提高，占到菌體總蛋白表達量的70%左右。
用園二色譜技術分析變性過程中二級結構含量，結果顯示，本發(fā)明的變復性過程中，由 于使用了低濃度的尿素，其二級結構受到較小的破壞，結構基本保持穩(wěn)定(見圖1)。該方法有 利于復性過程中變性蛋白質的復性速率和正確結構的恢復，是一種理想的變復性方法。
重組PGH的細胞活性分析。用MTT比色法分析本發(fā)明得到的可溶性PGH對細胞生長 的影響(見圖2)，結果顯示，本發(fā)明得到的目的PGH對細胞的生長具有明顯的促生長作用。8 小時內隨著PGH濃度的提高，對HEK293T細胞的生長具有明顯的劑效關系(見圖3)。


圖1園二色譜技術分析其二級結構受到較小的破壞，結構基本保持穩(wěn)定 圖2用MTT比色法分析本發(fā)明得到的可溶性PGH對細胞生長的影響 圖3對HEK293T細胞的生長具有明顯的劑效關系
圖4人工合成PGH基因與豬體內表達的野生型基因核苷酸序列比對，圖中黑色陰影的 堿基為密碼子優(yōu)化后改變的堿基圖5 pET-28a+-PGH重組質粒構建流程
圖6 pET-28a+-PGH重組質粒構建的PCR和酶切鑒定電泳分析泳道1為PCR鑒定結 果；泳道2為A^el和^oI酶切鑒定結果。
圖7 10% SDS-PAGE分析IPTG誘導含有重組質粒pET-28a-PGH的大腸桿菌￡.co// BL21在37'C，表達16小時目的蛋白質的表達情況泳道1:誘導前五.co//BL21/pET-28a-PGH 的細胞裂解液；泳道2: 37°C, IPTG誘導后Aco// BL21裂解液；泳道3: 37°C， IPTG誘 導后￡.co// BL21/pET-28a-PGH裂解液；泳道4:中分子量蛋白Marker;泳道5/7:誘導后五.co// BL21/pET-28a-PGH表達產物以包涵體形式存在；泳道6: 37°C, IPTG誘導后￡. co// BL21/pET-28a-PGH離心上清液。
圖8工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGH的誘導表達及包涵體洗滌技術路線
圖9 Western blotting鑒定表達的蛋白質為目的蛋白質PGH
圖10用變性緩沖液溶解包涵體的技術路線
圖ll通過pH的改變進行包涵體復性的技術路線
圖12用superdex-75凝膠層析的方法進行去除尿素，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單 峰，表明目的蛋白質得以純化
圖13 10% S2W-iMGE分析經(jīng)變復性實驗及純化的目的蛋白質泳道l: 37°C, IPTG 誘導后Eco// BL21裂解液；泳道2: 37°C， IPTG誘導后Eco/Z BL21/pET-28a-PGH上清液； 泳道3: 37°C, IPTG誘導后五.co"BL21/pET-28a-PGH沉淀(包涵體)；泳道4: 溶解于2M urea的包涵體；泳道5:中分子量蛋白Marker;泳道6:變復性后的可溶性PGH蛋白質； 泳道7:凝膠過濾層析后的PGH蛋白質
圖14 Western blotting鑒定結果進一步證實目的蛋白質及其純度
具體實施例方式
實施例1、本發(fā)明人工合成的PGH基因
本發(fā)明根據(jù)已報道(http://wwW.ncbi.nlm.nih.goV/)的豬生長激素的氨基酸序列和大腸桿菌 偏愛密碼子的使用原則，設計編碼與豬體內氨基酸序列一致的豬生長激素的核苷酸序列，見 序列表中SEQ ID N01的核苷酸序列，其核苷酸序列與豬體內的野生型基因序列比較(見圖4)。 該人工合成豬生長激素基因長度為576bp的PGH基因序列，編碼191個氨基酸。
實施例2、人工合成PGH基因在大腸桿菌中的高效表達
(1)設計帶有I和JW20 I酶切位點的引物5'-gtggtg"咖gaa gaa ttc ccg gcca-3，和 5'-gtggt"cg"g cta gaa ggc gca ggag-3'，擴增人工合成的PGH基因，將人其克隆至含有T7
強啟動子的原核生物表達載體pET-28a+中，構建成含有人工合成的PGH基因的重組質粒口￡丁-28&+- 011(見圖5,6);
(2) 制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用熱休克法(42t:熱激45秒)將重組質粒 pET-28a+-PGH轉化至宿主細胞BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的工程菌株；
(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中，當工程菌培養(yǎng)液濃度OD6冊達到0.6-0.8時，加 入0.5mmol/L IPTG， 37'C誘導表達6小時，得到高效表達的PGH包涵體，占到菌體總蛋白 表達量的70°/。左右(見圖7);離心，棄上清，清洗包涵體(技術路線見附圖8); Western blotting 鑒定表達的蛋白質為目的蛋白質PGH (見圖9);
(4) 在高pH值(pH42)的條件下，逐滴加入含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris緩沖液， 溶解PGH包涵體(技術路線見圖10);
(5) 按0. lmL/min逐滴緩慢加入pH8.5 ，含有50mmol/L Tris、 sucrose 5 % 、 2mol/L Urea的 復性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清,得到可溶性的PGH，其 復性效率在30%左右(具體的技術路線見圖11);
(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH純度鑒定，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單峰(附圖12)。 10%S2Xy-ZMG^:分析經(jīng) 變復性實驗及純化的目的蛋白質，結果顯示，本發(fā)明得到了電泳純的目的蛋白質，純度達98% 以上(見圖13); Western blotting鑒定結果進一步證實目的蛋白質及其純度(見圖14)。山西大學
人工合成豬生長激素基因及其表達純化方法 <7卯> 無案巻參考號
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權利要求
1、一種人工合成的豬生長激素PGH基因，其特征在于，它是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2、 如權利要求1所述的人工合成的豬生長激素基因的表達純化方法，其特征在于，包 括如下步驟(1) 構建含有人工合成的PGH基因的重組質粒pET-28a+-PGH;(2) 將重組質粒pET-28a+-PGH轉化至宿主細胞BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的工程 菌株；(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)，當工程菌培養(yǎng)液濃度OD6oo達到0.6-0.8時， 加入0.5mmol/LIPTG， 37"C誘導表達6小時，得到高效表達的PGH包涵體；離心，棄上清， 清洗包涵體；(4) 逐滴加入pH為12的含有2mol/L尿素的100mmol/LTris緩沖液，溶解PGH包涵體；(5) 按0.1mL/min逐滴緩慢加入pH8.5，含有50mmol/L Tris、 sucrose 5 % 、 2mol/L Urea的 復性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清，得到可溶性的PGH;(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。
全文摘要
本發(fā)明涉及人工合成豬生長激素基因及其表達純化方法，本發(fā)明依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子使用原則，設計了適合在大腸桿菌中高效表達的豬生長激素PGH的DNA序列，其表達的PGH蛋白與豬體內表達的PGH編碼區(qū)氨基酸序列一致。將該基因克隆到pET-28a⁺表達系統(tǒng)中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。0.5mmol/L IPTG，37℃誘導表達6小時的條件下，電泳檢測到該基因的表達產物占全菌蛋白的70％以上，產物以包涵體的形式存在，適合規(guī)?；I(yè)生產的需要。包涵體用低濃度尿素(2M)和高pH(12)緩沖液溶解，通過降低pH值至8.5，進行復性，復性率達到30％以上。進一步凝膠層析進行純化，得到純度達98％以上的PGH蛋白。
文檔編號C12N15/18GK101665788SQ200910075520
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權日2009年9月21日
發(fā)明者付月君, 張志云, 張振興, 柴寶峰, 梁愛華, 偉 王, 泉 申 申請人:山西大學