專利名稱：一種假單胞菌的篩選方法及其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表面活性劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假單胞菌及應(yīng)用該菌種以原油為主要碳源生產(chǎn)表面活性 劑的方法。
背景技術(shù)：
生物表面活性劑(Biosurfactaiit，簡(jiǎn)稱BS)是指嚴(yán)格具有親水基團(tuán)和疏 水基團(tuán)、由微生物產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)；以其水溶性好、界面活性高、潤(rùn)濕性良 好、吸附量小、引入人工無(wú)法合成的基團(tuán)、無(wú)毒安全、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)用于 工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域。 一些研究已經(jīng)證明生物表面活性劑的作用也是微生 物提高采收率的重要機(jī)理之一，其作用機(jī)理是乳化烴類，形成水包油的乳化 液，降低油水界面張力，提高巖石的親水性能以及原油的可流動(dòng)性。以往對(duì) 生物表面活性劑的研究采用的碳源主要為食品類，其缺點(diǎn)是成本高，特別是 目前人類糧食緊缺的情況下，采用原油為主要碳源，不僅降低了成本而且容 易適應(yīng)地層環(huán)境。本研究采用以原油為主要碳源，篩選并馴化出高效產(chǎn)表面 活性劑的菌株，以期適應(yīng)油田的環(huán)境，產(chǎn)生更好的驅(qū)油效果。
美國(guó)人貝克曼(Beckman)于1926年提出微生物提高原油采收率 (microbiologically enhanced oil recovery ，簡(jiǎn)稱MEOR)，并且得到大量研究以 后，1991年，美國(guó)把MEOR列為傳統(tǒng)采油后的第四類提高采收率方法，現(xiàn)已 應(yīng)用于許多油田。當(dāng)前，隨著原油價(jià)格的高漲，MEOR得到了越來(lái)越多的關(guān) 注與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是公開細(xì)菌的篩選與培養(yǎng)方法。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是公開一種以細(xì)菌生產(chǎn)表面活性劑的方 法，使其在48小時(shí)可將發(fā)酵液表面張力降低至30mN/m以下。
本發(fā)明用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表面活性劑的微生物是一種假單胞菌(Ae^omo"w "en^/朋ra)，并按照菌種篩選分離的順序命名為ZK1。
該菌種具有如下的性質(zhì)
1. 形態(tài)生理生化特征
形態(tài)特征桿菌，菌落呈深綠色，濕潤(rùn)，粘稠，圓形，邊緣整齊，
不透明。
生理生化特征革蘭氏陰性細(xì)菌，產(chǎn)表面活性劑。
2. 采用的培養(yǎng)基-斜面保存及平板分離培養(yǎng)基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉 膏5; NaC15;瓊脂15-20;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水， 用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，使用YXQ-SG46-280S型壓力蒸汽滅菌器112°C 滅菌30分鐘。
搖瓶培養(yǎng)基NaC15; NH4N031; (NH2)2CO0.5; MgSO40.05; NaH2P04 1; K2HP04OH20 2; FeSO4'7H2O0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原油20;
甘油10;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水；使用YXQ-SG46-280S 型壓力蒸汽滅菌器12rC滅菌20分鐘。
3.培養(yǎng)條件及利用菌種以原油為主要碳源生產(chǎn)表面活性劑的方法 培養(yǎng)溫度27-47°C，更適宜溫度37°C。
培養(yǎng)方式有氧條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。 (1)菌種篩選從油田含油污水取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密封瓶 口，在27-47。C， 160rpm培養(yǎng)7天，通過上述方法培養(yǎng)，并選擇能使表面張 力明顯下降最多的菌株，挑取單菌落在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30h并保存 于4'C的冰箱中；
其中搖瓶培養(yǎng)基NaC15; (NH4)2S041; (NH2)2CO0.5; MgSO40.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原 油20，甘油10;其余為去離子水，以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L， 121。C滅
菌20分鐘；
斜面保存培養(yǎng)基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5; NaCl 5;
瓊脂15-20;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，其余為去離子水，用NaOH溶液 調(diào)節(jié)pH至6-8; 112"C滅菌30分鐘。
該菌株經(jīng)基因鑒定為假單胞菌Pseudomonas aeruginosa,按照篩選分離的 順序命名為ZK1該細(xì)菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫(kù)中均有保存。
一種利用假單胞菌Pseudomonas aeruginosa生產(chǎn)其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表面活性劑的 方法，其特征包括
(1)斜面培養(yǎng)將假單胞菌i^ew^ wowayaerwg/"o幼菌種接種于斜面保 存培養(yǎng)基上，27-47。C培養(yǎng)24-30小時(shí)；
其中斜面保存培養(yǎng)基蛋白蹄10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;
NaC15;瓊脂15-20;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，其余為去離子水，用 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6-8， 112。C滅菌30分鐘；(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)斜面培養(yǎng)后的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán)
接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，27-47。C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24-30小時(shí)，制得種 子液；
其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;
NaC15;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水，以堿性物質(zhì)調(diào)pH值 為7.0， 12rC滅菌30min;
(3) 搖瓶培養(yǎng)以種子液與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為4%的接種量，接 種子液于搖瓶培養(yǎng)基中，27-47'C有氧條件下，搖床振蕩培養(yǎng)3-7天，制得發(fā) 酵液；
其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基NaC15; NH4N031; (NH2)2CO0.5; MgSO4 0.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;
原油20;甘油10;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水；121。C滅 菌20分鐘；
(4) 發(fā)酵液預(yù)處理取步驟(3)的發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min 去除菌體，并去除上層浮油得到上清液；
(5) 分離樣品將步驟(4)中離心后的上清液用鹽酸調(diào)pH值為2.0， 用和上清液等體積的乙酸乙脂萃取，合并有機(jī)相，4(TC減壓蒸餾，所得到的 黃色油狀物為糖脂粗產(chǎn)物。
本發(fā)明公開細(xì)菌的篩選與培養(yǎng)方法，并公開一種以細(xì)菌生產(chǎn)表面活性劑 的方法，使其在48小時(shí)可將發(fā)酵液表面張力降低至30mN/m以下。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:利用假單胞菌產(chǎn)表面活性劑的方法
(1)菌種篩選從油田含油污水中取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密 封瓶口，在THZ-C恒溫振蕩器中27'C， 160rpm培養(yǎng)7天，發(fā)酵液中原油乳， 以涂平板方法分離得到單一菌株，再通過上述方法培養(yǎng)，得到能使表面張力 明顯下降最多的菌株。挑單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)30小時(shí)并保存 于4'C冰箱；
將保存菌株無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液體斜面及平板分離保存培養(yǎng)基 中，在THZ-C恒溫振蕩器中27'C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，將培養(yǎng)的 菌液以占培養(yǎng)基體積4%的量加入到搖瓶培養(yǎng)基中24小時(shí)可完全乳化發(fā)酵液 中原油；該菌株經(jīng)基因鑒定為假單胞菌尸"w^附o"maen^'"a^，按照篩選分 離的順序命名為ZK1該細(xì)菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫(kù)中均有保存；(2) 斜面培養(yǎng)將篩選得到的假單胞菌接種于斜面保存培養(yǎng)基上，在
THZ-C恒溫振蕩器中27。C培養(yǎng)30小時(shí)；
(3) 種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在THZ-C恒溫振蕩器中27'C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)30小 時(shí)，制得種子；
(4) 搖瓶培養(yǎng)以4%體積/體積百分比接種量，接種子于液體產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在THZ-C恒溫振蕩器中27'C有氧條件下，搖床振蕩培養(yǎng)7天，制得 發(fā)酵液；
(5) 發(fā)酵液預(yù)處理取步驟(4)的發(fā)酵液使用ALCPK121R型冷凍離 心機(jī)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min去除菌體，并去除上層浮油；
(6) 分離樣品(5)中上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH值為2.0，用和 上清液等體積的乙酸乙脂萃取2次，合并有機(jī)相，4(TC減壓蒸餾，所得到的 黃色油狀物為糖脂粗產(chǎn)物；
(7) 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TLC及FT-IR分析，發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物是鼠李糖酯；
(8) 該產(chǎn)物可在24小時(shí)內(nèi)完全乳化發(fā)酵液中原油且48小時(shí)可將發(fā)酵液 表面張力降低至26mN/m。 '
實(shí)施例2:利用假單胞菌產(chǎn)表面活性劑的方法
(1) 菌種篩選從油田含油污水中取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密封 瓶口，在THZ-C恒溫振蕩器中37", 160rpm培養(yǎng)7天，發(fā)酵液中原油乳， 以涂平板方法分離得到單一菌株，再通過上述方法培養(yǎng)，得到能使表面張力 明顯下降最多的菌株。挑單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)27小時(shí)并保存
于4t:冰箱；
將保存菌株無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液體斜面及平板分離保存培養(yǎng)基 中，在THZ-C恒溫振蕩器中37t:條件下，搖床振蕩培養(yǎng)27小時(shí)，將培養(yǎng)的 菌液以占培養(yǎng)基體積4%的量加入到搖瓶培養(yǎng)基中24小時(shí)可完全乳化發(fā)酵液 中原油;該菌株經(jīng)基因鑒定為假單胞菌戶"i^omo"^ aen^/"w"，按照篩選分離 的順序命名為ZK1該細(xì)菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫(kù)中均有保存；
(2) 斜面培養(yǎng)將篩選得到的假單胞菌接種于斜面保存培養(yǎng)基上，在 THZ-C恒溫振蕩器中37'C培養(yǎng)27小時(shí)；
(3) 種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在THZ-C恒溫振蕩器中37X:條件下，搖床振蕩培養(yǎng)27小 時(shí)，制得種子；(4) 搖瓶培養(yǎng)以4%體積/體積百分比接種量，接種子于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)
基中，在THZ-C恒溫振蕩器中37。C有氧條件下，搖床振蕩培養(yǎng)5天，制得 發(fā)酵液；
(5) 發(fā)酵液預(yù)處理取步驟(4)的發(fā)酵液使用ALCPK121R型冷凍離 心機(jī)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min去除菌體，并去除上層浮油；
(6) 分離樣品(5)中上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH值為2.0，用和 上清液等體積的乙酸乙脂萃取2次，合并有機(jī)相，4(TC減壓蒸餾，所得到的 黃色油狀物為糖脂粗產(chǎn)物。
(7) 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TLC及FT-IR分析，發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物是鼠李糖酯；
(8) 該產(chǎn)物可在24小時(shí)內(nèi)完全乳化發(fā)酵液中原油且48小時(shí)可將發(fā)酵液 表面張力降低至29mN/m。
實(shí)施例3:利用假單胞菌產(chǎn)表面活性劑的方法
(1) 菌種篩選從油田含油污水中取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密封 瓶口，在THZ-C恒溫振蕩器中47'C， 160rpm培養(yǎng)7天，發(fā)酵液中原油乳， 以涂平板方法分離得到單一菌株，再通過上述方法培養(yǎng)，得到能使表面張力 明顯下降最多的菌株。挑單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)并保存 于4。C冰箱；
將保存菌株無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液體斜面及平板分離保存培養(yǎng)基 中，47'C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將培養(yǎng)的菌液以占培養(yǎng)基體積4% 的量加入到搖瓶培養(yǎng)基中24小時(shí)可完全乳化發(fā)酵液中；該菌株進(jìn)行保藏，經(jīng) 基因鑒定為假單胞菌Aw^fomo"osaen^/mwa，按照篩選分離的順序命名為 ZK1該細(xì)菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫(kù)中均有保存；
(2) 斜面培養(yǎng)將篩選得到的假單胞菌接種于斜面保存培養(yǎng)基上，在 THZ-C恒溫振蕩器中47'C培養(yǎng)24小時(shí)；
(3) 種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán)接于液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在THZ-C恒溫振蕩器中47-C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)，制得種子；
(4) 搖瓶培養(yǎng)以4%體積/體積百分比接種量，接種子于液體產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在THZ-C恒溫振蕩器中WC有氧條件下，搖床振蕩培養(yǎng)3天，制得 發(fā)酵液；
(5) 發(fā)酵液預(yù)處理取步驟(4)的發(fā)酵液使用ALCPK121R型冷凍離 心機(jī)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min去除菌體，并去除上層浮油；(6) 分離樣品(5)中上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH值為2.0，用和 上清液等體積的乙酸乙脂萃取2次，合并有機(jī)相，4(TC減壓蒸餾，所得到的 黃色油狀物為糖脂粗產(chǎn)物。
(7) 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TLC及FT-IR分析，發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物是鼠李糖酯；
(8) 該產(chǎn)物可在24小時(shí)內(nèi)完全乳化發(fā)酵液中原油且48小時(shí)可將發(fā)酵液 表面張力降低至27mN/tn。
權(quán)利要求
1. 一種假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟從油田含油污水取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密封瓶口，在27-47℃，160rpm培養(yǎng)7天，通過上述方法培養(yǎng)，并選擇能使表面張力明顯下降最多的菌株，挑取單菌落在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30h并保存于4℃的冰箱中；其中搖瓶培養(yǎng)基NaCl 5；(NH4)2SO4 1；(NH2)2CO 0.5；MgSO4 0.05；NaH2PO4 1；K2HPO4·3H2O 2；FeSO4·7H2O 0.01；CaCl2 0.01；MnSO4 0.01；原油20，甘油10；其余為去離子水，以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，121℃滅菌20分鐘；斜面保存培養(yǎng)基蛋白胨10；葡萄糖10；酵母粉5；牛肉膏5；NaCl 5；瓊脂15-20；以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，其余為去離子水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6-8；112℃滅菌30分鐘。
2. —種利用假單胞菌Pseudomonas aeruginosa生產(chǎn)其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表面活性 劑的方法，其特征包括(1) 斜面培養(yǎng)將假單胞菌/^ew^W20"os "en^^ora菌種接種于斜面保 存培養(yǎng)基上，27-47'C培養(yǎng)24-30小時(shí)；其中斜面保存培養(yǎng)基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;NaCl 5;瓊脂15-20;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，其余為去離子水，用 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6-8， 112。C滅菌30分鐘；(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)斜面培養(yǎng)后的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán) 接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，27-47'C條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24-30小時(shí)，制得種 子液；其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;NaC15;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水，以堿性物質(zhì)調(diào)pH值 為7.0， 12rC滅菌30min;(3) 搖瓶培養(yǎng)以種子液與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為4%的接種量，接種子液于搖瓶培養(yǎng)基中，27-47i:有氧條件下，搖床振蕩培養(yǎng)3-7天，制得發(fā) 酵液；其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl 5; NH4N03 1; (NH2;)2CO 0.5; MgS04 0.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原油20;甘油10;以上單位均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于去離子水；12廣C滅 菌20分鐘；(4) 發(fā)酵液預(yù)處理取步驟(3)的發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min去除菌體，并去除上層浮油得到上清液；(5) 分離樣品將步驟(4)中離心后的上清液用鹽酸調(diào)pH值為2.0， 用和上清液等體積的乙酸乙脂萃取，合并有機(jī)相，4(TC減壓蒸餾，所得到的 黃色油狀物為糖脂粗產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的氮源為NH4N03和 (NH2)2CO。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假單胞菌的篩選方法及其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表面活性劑的方法。菌種篩選從油田含油污水取樣加入到搖瓶培養(yǎng)基中，棉塞密封瓶口，在27-47℃，160rpm培養(yǎng)7天，通過上述方法培養(yǎng)，并選擇能使表面張力明顯下降最多的菌株，挑取單菌落在斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30h并保存于4℃的冰箱中。本發(fā)明還公開一種以細(xì)菌生產(chǎn)表面活性劑的方法，使其在48小時(shí)可將發(fā)酵液表面張力降低至30mN/m以下。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101457214SQ20091007629
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者理 俞, 靖 王, 章厚名, 董漢平, 云 陳, 黃立信 申請(qǐng)人:中國(guó)石油大學(xué)(北京)