專利名稱：一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于功能性食品的穩(wěn)定技術(shù)，具體涉及一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法。
背景技術(shù)：
鐵蛋白通常為由24個(gè)亞基組成的中空球狀分子，內(nèi)外直徑分別約為8以及12.5 nm。鐵蛋白包括8個(gè)3倍軸通道與6個(gè)4倍軸通道，負(fù)責(zé)鐵蛋白與外部環(huán)境的物質(zhì)交換，其中，3倍軸通道是鐵的主要通道和Fe(II)氧化作用位點(diǎn)，鐵離子通過此通道進(jìn)入核中。鐵蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物的細(xì)胞中，主要調(diào)節(jié)鐵的代謝平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)F^+濃度高時(shí)，鐵蛋白催化F^+被氧氣分子氧化的反應(yīng)，并把生成的F^+儲(chǔ)藏于其內(nèi)部空腔中，1分子鐵蛋白可最多儲(chǔ)存4500個(gè)Fe3+;當(dāng)細(xì)胞需要鐵時(shí)(F^+濃度低時(shí))，鐵蛋白在還原劑的幫助下將F^+還原為Fe2+，使鐵從其內(nèi)部釋放出來供其它蛋白質(zhì)合成利用，所以鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有去除F^+的毒性以及調(diào)節(jié)鐵代謝平衡的雙重作用。
目前，缺鐵導(dǎo)致的疾病是一類嚴(yán)重影響人類健康的疾病。世界衛(wèi)生組織2002年發(fā)表的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球有20億人患有鐵缺乏癥，缺鐵成為第九類健康風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，改善鐵營(yíng)養(yǎng)狀況，是世界也是我國(guó)迫切需要解決的問題。目前使用的補(bǔ)血鐵劑主要是二價(jià)的非血紅素鐵，如硫酸亞鐵以及有機(jī)酸亞鐵鹽類。由于這些補(bǔ)鐵劑具有副作用，易發(fā)生鐵中毒，鐵吸收率不高，且生產(chǎn)或儲(chǔ)存都很困難，導(dǎo)致補(bǔ)鐵效果不理想，所以開發(fā)更好的補(bǔ)鐵產(chǎn)品勢(shì)在必行。
近十幾年來，鐵蛋白(特別是植物鐵蛋白)的生物學(xué)功能得到了人們極大關(guān)注，目前報(bào)道(P. Davila Hicks, E.C. Theil and B. Lo皿erdal, Am J Clin Nut,
32004)，人體對(duì)大豆中鐵(主要以鐵蛋白形式存在)的吸收率約為24.5%;人 體對(duì)大豆鐵蛋白的吸收與對(duì)硫酸亞鐵的吸收沒有顯著性差異，并表明大豆鐵蛋 白是一種天然的新型補(bǔ)血鐵劑。由于植物鐵蛋白具有良好的補(bǔ)鐵生物活性，它 被看作是21世紀(jì)新型的補(bǔ)鐵劑，其應(yīng)用前景非常光明。
植物鐵蛋白的貯存方法主要是以在-20 。C或-70 'C冰箱中存放為主，當(dāng)?shù)鞍?質(zhì)解凍后，發(fā)現(xiàn)鐵蛋白有降解現(xiàn)象。此外，放置在4'C冰箱中10天或37'C保 溫20天，也可明顯觀察到植物鐵蛋白的降解。降解后的鐵蛋白含鐵量明顯下降， 從而鐵蛋白的補(bǔ)鐵活性也將下降；另外，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵蛋白的降解 越來越明顯，分子量越來越小，溶液中鐵蛋白的含量越來越低。因此，植物鐵 蛋白的不穩(wěn)定、易降解性質(zhì)極大地限制了植物鐵蛋白的廣泛應(yīng)用。
功能蛋白質(zhì)的穩(wěn)定技術(shù)是功能食品生產(chǎn)過程中的一項(xiàng)重要技術(shù)，它具有增 加蛋白質(zhì)的得率，延長(zhǎng)蛋白質(zhì)的貯存時(shí)間，保持蛋白質(zhì)的有效功能等作用。目 前，穩(wěn)定技術(shù)在食品工業(yè)中主要應(yīng)用于大豆分離蛋白、乳清蛋白、酶制劑等保 持其穩(wěn)定性。但有關(guān)通過添加苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的方法抑制植物鐵蛋白的自身降解在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法。 一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法，將苯甲基磺酰氟加入到植物鐵蛋白溶液中。
所述苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為0.1 9mmol/L，優(yōu)選濃度為0.5、 0.8、 1、 2、 5、 6、 7、 8或9mmol/L。
在植物鐵蛋白溶液中加入一定量的PMSF可以抑制鐵蛋白的降解。加入的 比例是非常重要，如果PMSF加的太多，它自身會(huì)產(chǎn)生沉淀，如果太少的話，植物鐵蛋白的降解得不到抑制。
本發(fā)明的有益效果:采用添加PMSF可以使植物鐵蛋白的穩(wěn)定性保持良好， 從而有效地發(fā)揮其補(bǔ)鐵活性功能；該方法也增加了蛋白質(zhì)的得率，延長(zhǎng)蛋白質(zhì) 的貯存時(shí)間，從而有利于植物鐵蛋白的廣泛應(yīng)用。


圖1為黃大豆鐵蛋白放置在4'C冰箱中60天的降解情況； M: Marker; 1:PMSF濃度為9mmol/L的樣品；2: PMSF濃度為7mmol/L的樣 品；3:PMSF濃度為0.8mmol/L的樣品；4:對(duì)照樣品(不加PMSF) 圖2為黃大豆鐵蛋白放置在37 。C溫箱中20天的降解情況； M: Marker; 1: PMSF濃度為8mmol/L的樣品；2: PMSF濃度為6mmol/L的樣品； 3:PMSF濃度為0.5mmol/L的樣品；4:對(duì)照樣品(不加PMSF) 圖3為不同濃度的PMSF對(duì)黃大豆鐵蛋白降解的抑制效果柱狀圖。 從左到右PMSF的濃度依次為O.l、 1、 2、 5、 9mmol/L
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中使用的植物鐵蛋白是以黃大豆為原料，其分離、純化的具體 操作步驟如下
1) 粗蛋白提取
將lkg去雜的黃大豆種子浸泡于1倍體積的蒸餾水中，置于4'C冷庫中約 12 h。然后，加入2倍體積提取液(0.05 mol/LKH2P04-Na2HP04， pH 7.0， 1% PVP) 并用內(nèi)切式勻漿機(jī)(九陽料理機(jī)JYL-610，山東)勻漿2min，用紗布過濾，除 去豆渣。將收集的勻漿在50 。C的恒溫水浴鍋內(nèi)加熱10 min,待溶液冷卻至室 溫后，于4800 xg離心10min，棄沉淀，取上清液，即為粗提液。
2) 鹽析在上清液中加入終濃度為0.5 mol/L MgCl2晶體，靜置20 min后加入終濃 度為0.7 mol/L檸檬酸三鈉晶體靜置過夜。然后于12000 x g，4 。C下離心30 min， 將得到的褐色沉淀溶于50 mL的0.05 mol/L PBS (pH 8.0)中，以待進(jìn)一步純 化。
3) 柱層析
離子交換層析用0.05 mol/L PBS (pH 8.0)平衡DEAE-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)陰離子交換柱后，將鹽析后透析所得 溶液上樣，依次用含0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1 mol/L NaCl的PBS (0.05 mol/L，pH 8.0)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min， 5 mL/ 管分管收集。把具有鐵蛋白活性的收集液用100 kDa超濾膜(Millipore Corporation,美國(guó))進(jìn)行超濾濃縮以待進(jìn)一步純化。
凝膠過濾層析用含有0.15 mol/LNaCl的PBS (0.05 mol/L， pH 8.0)平衡 Sephacryl S-300 (GE Healthcare Bio-Sciences AB,瑞典)聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠 柱后，將上述超濾濃縮液上樣后，再用含有0.15 mol/L NaCl的PBS(0.05 mol/L， pH8.0)洗脫，流速為0.5 mL/min， 5 mL/管分管收集。得到蛋白質(zhì)30mg,溶 解在30mL的0.05mol/LPBS溶液(pH8.0，含0.15 mol/LNaCl)中。
4) 鐵蛋白純度鑒定
將上述步驟所得的黃大豆鐵蛋白通過非變性電泳(Native-PAGE)檢測(cè)分 子量約為560kDa，變性電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)表明黃大豆鐵蛋白是由28.0 kDa 和26.5 kDa兩種亞基組成。
PMSF的加入量與溶液中鐵蛋白的濃度有關(guān)，鐵蛋白濃度越高加入PMSF 的量越多。但由于植物鐵蛋白的溶解度是有一定范圍的， 一般在5mg/mL以下， 所以PMSF的加入量不是越多越好。實(shí)施例1
取上述黃大豆鐵蛋白溶液1.5 ml (鐵蛋白含量約為1.5mg)，平均分成六 份，在其中三份中分別加入2.25、 1.75和0.2 jomol的PMSF (Sigma-Aldrich Co. 北京)，而另三份對(duì)照樣品中分別加入對(duì)應(yīng)量的超純水，將樣品放置在4。C冰箱 中60天，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析，觀察黃大豆鐵蛋白 溶液的穩(wěn)定情況。結(jié)果如圖l所示，對(duì)照樣品中黃大豆鐵蛋白發(fā)生了明顯的降 解，而實(shí)驗(yàn)樣品中，黃大豆鐵蛋白的穩(wěn)定性保持良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMSF 能夠保持黃大豆鐵蛋白的穩(wěn)定。 實(shí)施例2
取上述黃大豆鐵蛋白溶液1.5 ml (鐵蛋白含量約為1.5mg)，平均分成六 份，在其中三份中分別加入2、 1.5和0.125pmol的PMSF (Sigma-Aldrich Co.北 京)，而另三份對(duì)照樣品中分別加入對(duì)應(yīng)量的超純水，將樣品放置在37。C溫箱 中保溫20天，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析，觀察大豆鐵蛋白溶 液的穩(wěn)定情況。結(jié)果如圖2所示。 實(shí)施例3
取上述黃大豆鐵蛋白溶液2.5 ml (鐵蛋白含量約為2.5mg)，平均分成十 份，在其中五份中分別加入0.025、 0.25、 0.5、 1.25和2.25pmol的PMSF
(Sigma-Aldrich Co.北京)，而另五份對(duì)照樣品中分別加入對(duì)應(yīng)量的超純水， 將樣品放置在37 "C溫箱中保溫20天，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析， 觀察大豆鐵蛋白溶液的穩(wěn)定情況。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照樣品中大豆鐵蛋白發(fā)生了明顯的降解，而實(shí)驗(yàn)樣品中，加入的PMSF終濃度越大，大豆鐵蛋白的穩(wěn) 定性保持越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMSF能夠保持大豆鐵蛋白的穩(wěn)定。 參考文獻(xiàn)
1 P. Davila Hicks, E.C. Theil and B. Lonnerdal. Iron in ferritin or in salts (ferrous sulfate) is equally bioavailable in nonanemic women. Am J Clin Nut, 2004.
權(quán)利要求
1、一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法，其特征在于，將苯甲基磺酰氟加入到植物鐵蛋白溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～9mmol/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法，其特征在于，所述苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為0.5、 0.8、 1、 2、 5、 6、 7、 8或9mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保持植物鐵蛋白穩(wěn)定的方法，屬于功能性食品穩(wěn)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過向植物鐵蛋白溶液中加入苯甲基磺酰氟，并使其濃度為0.1～9mmol/L，來抑制植物鐵蛋白的降解。添加苯甲基磺酰氟可以使植物鐵蛋白的穩(wěn)定性保持良好，從而有效地發(fā)揮其補(bǔ)鐵活性功能；該方法還增加了蛋白質(zhì)的得率，延長(zhǎng)蛋白質(zhì)的貯存時(shí)間，有利于植物鐵蛋白的廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23L1/29GK101485453SQ20091007778
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者付曉蘋, 胡小松, 趙廣華, 芳 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)