專利名稱：組織特異性真核表達載體pIE的構(gòu)建及其在HLA-DR轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織特異性真核表達載體pIE的構(gòu)建及其作為基因載體在人類白細胞抗原 (HLA) -DR轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類白細胞抗原(HLA)主要分為三類，其中II類分子主要分布于B細胞、單核巨噬細胞、 樹突狀細胞和某些激活的T細胞表面，主要參與外源性抗原的提呈、胸腺內(nèi)CD4+T細胞的 分化與發(fā)育和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等功能。HLA-II類分子根據(jù)其編碼基因區(qū)的不同，少〕為HLA-DR、 DQ、 DP三種。HLA-DR分子由a和卩兩條鏈構(gòu)成，通過非共價鍵組成異二聚體。當外源性 抗原進入細胞內(nèi)并被加工后，可與HLA-DR分子的抗原結(jié)合槽結(jié)合形成抗原肽-HLA-DR復合 體，表達于細胞表面。因此，HLA-DR分子在對外源性抗原的提呈和免疫應(yīng)答中起著重要的 作用。
眾所周知，許多自身免疫性疾病，如類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病與HLA-DRB1表型有 著密切的關(guān)系[l]。編碼HLA-DRa鏈的基因缺乏多態(tài)性，而編碼P鏈的基因則存在著許多亞 型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中某些亞型(如HLA-DRB1*0101， 0102， 0401， 0404， 0405， 0410， 1001和1402等)與RA的發(fā)病和疾病嚴重性有關(guān)[2]。而HLA-DRB 1*0405亞型主要與我國 RA發(fā)病密切相關(guān)[3,4]。但迄今為止，尚不清楚HLA-DR參與RA發(fā)病的具體分子機制。因 此，為了在細胞和分子水平研究HLA-DR與RA及其他自身免疫性疾病的關(guān)系，迫切需要一 種高效的載體將HLA-DR基因轉(zhuǎn)入到細胞或動物體內(nèi)，并使其在組織或細胞上得到表達，從 而模擬人體內(nèi)的免疫遺傳條件。
若要盡可能使轉(zhuǎn)入的HLA-DR基因在細胞或動物體內(nèi)的表達和分布與人體內(nèi)一致，并且 便于后續(xù)操作和鑒定，所用的基因載體應(yīng)具備以下幾個條件l)具有通用引物序列，便于對 插入的目的基因的測序；2)具有較高的表達能力；3)具有與HLA-DR分子相一致的組織特 異性表達能力；4)具有方便、有效的篩選功能；5)具有便于外源基因插入的多克隆位點。 基于以上要求，本發(fā)明人經(jīng)過多年探索發(fā)明了一種新型的能夠有效將HLA-DR基因轉(zhuǎn)入細胞 或動物體內(nèi)的真核表達載體p正，研究證實，該載體不僅可使插入的HLA-DRA或HLA-DRB1 基因在細胞或動物體內(nèi)表達，并可通過共轉(zhuǎn)染方式使細胞內(nèi)表達的HLA-DRa和卩兩條鏈進 行組裝，形成完整的HLA-DR分子，而且具有與HLA-DR分子相類似的組織特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一個高效且具有組織特異性的真核表達載體，用于在,胞或動物體 內(nèi)表達HLA-DR分子。
目前，已商品化的真核表達載體pcDNA3.1(+)具有應(yīng)用廣泛，測序方便(T7測序引物)， 限制性內(nèi)切酶位點豐富(MCS中含有17個限制性內(nèi)切酶位點)，且具有高效轉(zhuǎn)錄終止序列 BGH。另外，該載體還具備兩種抗生素篩選系統(tǒng)，即氨芐青霉素抗性和新霉素抗性(見圖1)。 因此，本發(fā)明在pcDNA3.1(+)基礎(chǔ)上對載體進行改造，在保留原有載體的某些特點之外，引 入新的元件，使其更加適合于HLA-DR轉(zhuǎn)基因的要求。
雖然pcDNA3.1(+)載體具有一個CMV啟動子和增強子，能夠指導插入的目的基因在真核 細胞中高效表達，但CMV啟動子作為一種泛表達啟動子，缺乏組織特異性。而HLA-DR分 子在人體內(nèi)主要表達于抗原提呈細胞和活化的T細胞上，因此，對于HLA-DR表達來說，組 織特異性表達啟動子是至關(guān)重要的。國外研究表明，小鼠MHC II類抗原基因I-E(x啟動子能 夠有效指導插入的人HLA-DRB1基因在抗原提呈細胞上進行表達[5]，因此，本發(fā)明中采用小 鼠MHC n類抗原基因I-Eot啟動子部分片段對pcDNA3.1(+)CMV啟動子進行了替換。另夕卜， 己證實兔|3球蛋白內(nèi)含子基因插入到啟動子后能夠增強目的基因的表達[6]，本發(fā)明在替換啟 動子的基礎(chǔ)上將兔(3球蛋白內(nèi)含子基因片段引入到載體中。
本發(fā)明中建立的新型組織特異性真核表達載體命名為pIE,該載體含有一個小鼠MHC II 類抗原基因I-Ect啟動子， 一段兔p球蛋白內(nèi)含子，9個限制性內(nèi)切酶組成的多克隆位點，一 個BGH PolyA，新霉素抗性基因和氨節(jié)青霉素抗性基因，以及SV40 ori和SV40 PolyA。采用 限制性內(nèi)切酶，將HLA-DRA和HLA-DRB1*0405 cDNA分別插入到p正載體中，通過轉(zhuǎn)染 或顯微注射方法將其分別轉(zhuǎn)入到小鼠B細胞系或小鼠受精卵中，均可使HLA-DRA和 HLA-DRB1*0405在細胞上或小鼠體內(nèi)得到表達，并具有與HLA II類相似的組織特異性。
本發(fā)明中的p正表達載體不僅可用于HLA-DR基因在細胞或組織內(nèi)特異表達，還適用于 其他基因在小鼠抗原提呈細胞上或轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)的表達和研宄。


圖l. pCDNA3.1(+/-)載體圖譜。該載體為真核表達載體，具有一個CMV啟動子/增強子， 一個 含有17個限制性內(nèi)切酶的多克隆位點， 一個轉(zhuǎn)錄終止子BGH PA。同時，該載體具有兩 個篩選系統(tǒng)，即新霉素抗性和氨芐青霉素抗性。根據(jù)多克隆位點限制性內(nèi)切酶的順序不 同分為(+)或(-)兩種載體。pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒全長5428bp。
圖2.真核表達載體pIE構(gòu)建示意圖。通過限制性內(nèi)切酶技術(shù)，用小鼠MHC II類抗原基因I-Ea啟動子序列替換pcDNA3.1 ( + )的CMV啟動子(BglII和HindIII)，然后將克隆到的兔 (3球蛋白內(nèi)含子基因插入到小鼠MHC II類抗原基因I-Ea啟動子之后(HindIII和 EcoRl)，保留pcDNA3.1 ( + )載體的其他元件，從而構(gòu)建出載體pIE。
圖3.載體p正酶切鑒定結(jié)果。A)質(zhì)粒pcDNA/IE的酶切電泳結(jié)果。1道為BglII禾B HindIII雙 酶切，得到1.9kb和4.5kb大小的兩條片段；2道為lkb DNAmarker; 3道為Bgl II單酶 切，得到6.5kb大小片段。說明小鼠MHC II類抗原基因I-Eot啟動子替換CMV啟動子 成功。B)質(zhì)粒pIE酶切電泳結(jié)果。1道為lkbDNAmarker; 2道為HindIII申-酶切，得到 7.06kb大小片段。3道為HindIII和EcoR I雙酶切，得到610bp和6.5kb大小的兩條片段。 說明兔|3球蛋白內(nèi)含子基因插入成功，綜合兩結(jié)果可見pIE載體構(gòu)建完成。
圖4. p正-DRA構(gòu)建示意圖。采集HLA-DRB1*0405陽性人外周抗凝向-提取總RNA，通過 RT-PCR技術(shù)分別擴增HLA-DRA cDNA，將其連入測序載體pMD19-T中，經(jīng)測序證實 序列正確。然后通過PCR技術(shù)擴增HLA-DRA開放讀碼框，并序列兩端引入Not I和 Apa I酶切位點。采用Not I和Apa I對PCR產(chǎn)物和載體pIE進行雙酶切，回收目的片 段后，通過T4連接酶將二者連接，獲得含有HLA-DRA基因片段的質(zhì)粒p正-DRA，質(zhì) 粒大小7.9kb。
圖5. p正-DRB構(gòu)建示意圖。采集HLA-DRB1*0405陽性人外周抗凝血提取總RNA,通過 RT-PCR技術(shù)分別擴增HLA-DRB 1*0405 cDNA,將其連入測序載體pMD19-T中，經(jīng)測 序證實序列正確。然后通過PCR技術(shù)擴增HLA-DRB1開放讀碼框，并，列兩端引入 EcoR I和Xho I酶切位點。采用EcoR I和Xho I對PCR產(chǎn)物和載體pIE進行雙酶切， 回收目的片段后，通過T4連接酶將二者連接，獲得含有HLA-DRB1*0405基因片段的 質(zhì)粒pIE-DRB，質(zhì)粒大小8.1kb。
圖6.流式檢測HLA-DR在小鼠細胞系中的表達。采用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒pIE-DRA和 pIE-DRB分別轉(zhuǎn)入小鼠B細胞系M12C3和小鼠成纖維細胞系L細胞中，通過新霉素和 氨卡青霉素雙抗篩選陽性克隆，并擴增培養(yǎng)。采用抗人HLA-DR單克隆抗體LN3通過: 流式細胞術(shù)進行檢測，結(jié)果顯示HLA-DR分子在M12C3細胞上的表達率為31%,而L 細胞則未檢測到HLA-DR分子的表達。說明pIE載體成功地使插入的HLA-DRA和 HLA-DRB1*0405基因在小鼠B細胞中得到表達并組裝成完整的HLA-DR4分子，而且 具有組織特異性。
圖7. HLA-DRA和HLA-DRBP0405轉(zhuǎn)基因鼠鼠尾PCR鑒定結(jié)果。取轉(zhuǎn)基因鼠仔鼠鼠尾，提 取基因組DNA，通過PCR方法分別檢測HLA-DRA(A)和HLA-DRB 1*0405 (B)基因在 小鼠基因組DNA中的整合情況。"M"為DL2000 Marker, "+"為PCR擴增,出陽性目的片段的仔鼠DNA，說明目的基因己整合入該鼠基因組中。通過此方法篩選出轉(zhuǎn)基因陽性 鼠。
圖8.轉(zhuǎn)基因鼠外周血中HLA-DRA和HLA-DRB1*0405 mRNA的表達。采集外周血總RNA， 通過RT-PCR方法對轉(zhuǎn)入的基因的表達情況進行檢測。A)對HLA-DRA mRNA的表達 情況進行檢測，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因陽性鼠中可見HLA-DRA mRNA的表達，而轉(zhuǎn)基因陰性鼠 中無表達；B)對HLA-DRB"0405 mRNA的表達情況進行檢測，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因陽性鼠 中可見HLA-DRBP0405 mRNA的表達，而轉(zhuǎn)基因陰性鼠中無表達。"P"為轉(zhuǎn)基因陽性 鼠，"N"為轉(zhuǎn)基因陰性鼠。阿拉伯數(shù)字代表鼠號。采用小鼠(3-actin基因作為內(nèi)參對照。
具體實施例方式
實施例1:真核表達載體pIE的構(gòu)建和鑒定。
含有小鼠MHC II類抗原基因I-Ea啟動子序列的質(zhì)粒(pET/正-pro)由澳大利亞墨爾本 大學惠贈。采用PCR技術(shù)擴增I-Ea啟動子部分片段，并在片段兩端引入BglII和HindIII酶切 位點。pcDNA3.1(+)載體為Invitrogen公司產(chǎn)品，本實驗室保存。采用BglII和HindIII限制性 內(nèi)切酶分別對擴增的I-Ea啟動子PCR產(chǎn)物(約1.9kb)和pcDNA3.1(+)載體進行酶切，回收 目的片段后，通過T4連接酶將二者連接，從而用I-Ea啟動子替換了 pcDNA3.1(+)載體中的 CMV啟動子。將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并擴增、提取質(zhì)粒，經(jīng)BglII和Hindin 酶切電泳鑒定，證實I-Ea啟動子替換成功(見圖2)。所得質(zhì)粒命名為pcDNA/IE。
為獲得兔P球蛋白內(nèi)含子(RGI)基因，我們采集兔靜脈抗凝血2ml，采用Invi加gen公 司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA。而后通過PCR技術(shù)擴增RBG基因片段，并將其插 入到測序載體pMD19-T中，經(jīng)測序證實序列正確，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并擴增、提取質(zhì)粒， 獲得含RGI基因片段的質(zhì)粒pMD/RGI。采用HindIII和EcoR I分別對質(zhì)粒pcDNA7IE和 pMD/RBG進行雙酶切，回收目的片段后，通過T4連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5a并擴增、提取質(zhì)粒，從而獲得真核表達載體pIE。該載體經(jīng)Hindlll和EcoR I雙酶 切電泳鑒定證實RGI成功插入(見圖3)。將質(zhì)粒pIE進行測序，結(jié)果證實含有小鼠MHC II 類抗原基因I-Ea啟動子和兔卩球蛋白內(nèi)含子基因片段的真核表達載體p正序列正確(詳見序 列表)。
實施例2:以pIE作為載體將HLA-DRA和HLA-DRB1*0405基因成功轉(zhuǎn)入小鼠B細胞系 M12C3中，并使其表達人HLA-DR4分子。
采集HLA-DRB 1*0405陽性人外周抗凝血2ml，提取總RNA,通過RT-PCR技術(shù)分別擴 增HLA-DRA和HLA-DRB1*0405 cDNA，將其連入測序載體pMD19-T中，經(jīng)測序證實序列正確。然后通過PCR技術(shù)擴增HLA-DRA開放讀碼框，并序列兩端引入Not I和Apa I酶切 位點。采用Not I和Apa I對PCR產(chǎn)物和載體pIE進行雙酶切，回收目的片段后，通過T4 連接酶將二者連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并擴增、提取質(zhì)粒，從而獲得含有 HLA-DRA基因片段的質(zhì)粒p正-DRA (見圖4)。同理，利用EcoR I和Xho I雙酶切，獲得含 有HLA-DRBP0405基因片段的質(zhì)粒p正-DRB (見圖5)。上述兩質(zhì)粒經(jīng)測序證實HLA-DRA 和HLA-DRB 1*0405序列正確。
體外無菌培養(yǎng)小鼠B細胞系M12C3和小鼠成纖維細胞系L細胞，采用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染方 法將質(zhì)粒p正-DRA和pIE-DRB分別轉(zhuǎn)入兩細胞系中，通過新霉素和氨芐青霉素雙抗篩選陽 性克隆，并擴增培養(yǎng)。采用針對人HLA-DR分子的單克隆抗體LN3 (eBioscience公司產(chǎn)品) 通過流式細胞術(shù)進行檢測，結(jié)果證實HLA-DR分子在M12C3細胞上得到表達，而L細胞則 未檢測到HLA-DR分子的表達(見圖6)。
這說明作為基因載體，p正載體成功地使插入的HLA-DRA和HLA-DRB"0405基因在 轉(zhuǎn)入的小鼠B細胞中得到表達并組裝成完整的HLA-DR4分子，而在小鼠成纖維細胞系則不 能使其表達，顯示出具有組織特異性。
實施例3:以pIE作為載體構(gòu)建HLA-DRA和HLA-DRB1*0405轉(zhuǎn)基因鼠。
HLA-DR4轉(zhuǎn)基因鼠是研宄類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制和篩選治療藥物的理想平臺。在本研究 中，我們以p正作為基因載體，成功將HLA-DRA和HLA-DRB1*0405基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)， 將證實轉(zhuǎn)入的基因在小鼠體內(nèi)得到表達，為構(gòu)建HLA-DR4 (*0405)轉(zhuǎn)基因鼠奠定了基礎(chǔ)。 具體方法如下
采用Pvu I對質(zhì)粒p正-DRA和pIE-DRB進行酶切，使其線性化，通過Promega A9281試 劑盒回收純化酶切片段。通過顯微注射技術(shù)，分別將兩條線性化基因片段注射入DBA/1小鼠 受精卵雄原核內(nèi)，然后將卵接種于C57BL/6小鼠子宮內(nèi)，使其產(chǎn)仔。采用鼠尾DNA PCR方 法對各個仔鼠進行鑒定，篩選出轉(zhuǎn)基因陽性鼠。而后通過采集外周血總RNA，通過RT-PCR 方法對轉(zhuǎn)入的基因的表達情況進行檢測。
結(jié)果顯示，鼠性DNA PCR鑒定證實轉(zhuǎn)入的HLA-DRA和HLA-DRB1*0405基因成功整 合入小鼠的基因組DNA中(見圖7),而RT-PCR檢測證實HLA-DRA和HLA-DRB1*0405 基因在轉(zhuǎn)基因鼠陽性鼠外周血中均有表達(見圖8)。
這說明pIE作為基因載體，能夠使攜帶的目的基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)并得到表達。參考文獻
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11<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1. 一種環(huán)形閉合雙鏈DNA，包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1中核苷酸序列包含小鼠MHC II類抗原I-Ea啟動子序列、兔p球 蛋白內(nèi)含子序列、限制性內(nèi)切酶構(gòu)成的多克隆位點序列、BGHpolyA序列、 新霉素抗性基因序列和氨芐青霉素抗性基因序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的DNA作為載體，用于外源性DNA (如HLA-DR)在細胞 或組織中的表達。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的DNA作為載體，用于構(gòu)建外源性DNA (如HLA-DR)的 轉(zhuǎn)基因動物用途。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了一種新型的組織特異性真核表達載體pIE，其作為基因載體可用于將人類白細胞抗原(HLA)-DR或其他基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的細胞系或?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)并進行組織特異性表達。
文檔編號C12N15/85GK101481707SQ20091007792
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者張連峰, 栗占國, 義 趙 申請人:北京大學人民醫(yī)院