專利名稱：：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖呼吸綜合征病毒引起的，是以懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙及仔豬和育肥豬的呼吸道疾病為主要癥狀的傳染病。該病1987年首次在美國(guó)報(bào)道，此后在加拿大、德國(guó)、西班牙、英國(guó)也相繼報(bào)道了該病的發(fā)生。1995年，我國(guó)大陸發(fā)現(xiàn)了此病，且在多個(gè)省份開始流行。隨后在19%年和1997年相繼從疑似的病例中分離到了該病病源。2006年我國(guó)東南部省區(qū)相繼爆發(fā)了嚴(yán)重高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，數(shù)以萬計(jì)的豬迅速死亡。通過病源分離與鑒定，確定是由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染造成的。高致病性病毒感染的特點(diǎn)是豬只發(fā)病快、疾病傳播迅速、對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒與經(jīng)典的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在基因組0RF1的Nsp2區(qū)出現(xiàn)了變異。豬繁殖呼吸綜合征病毒的現(xiàn)有檢測(cè)方法很多，但是能直接檢測(cè)高致病性豬繁殖呼吸綜合征病毒的方法卻很少?，F(xiàn)在報(bào)道的方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。但是這些方法有耗時(shí)、操作復(fù)雜、所需儀器試劑較昂貴等缺點(diǎn)，不適合于進(jìn)行田間快速診斷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)的快速檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑本發(fā)明提供了檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物組成一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla區(qū)域的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla區(qū)域的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla區(qū)域的環(huán)形引物對(duì)。4具體來說，所述專用引物中，一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域(Nsp2區(qū)部分序列)的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域(Nsp2區(qū)部分序列)的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域(Nsp2區(qū)部分序列)的環(huán)形引物對(duì)。更具體來說，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。本發(fā)明提供的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒是含有所述專用引物的試劑盒。本發(fā)明中三對(duì)引物針對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionN咖berEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域(Nsp2區(qū)部分序列)，為國(guó)內(nèi)分離的高致病性豬繁殖呼吸綜合征病毒的變異區(qū)域。該高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒在使用過程中，所述的內(nèi)側(cè)引物對(duì)、外側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)作為一個(gè)整體組使用，使用時(shí)應(yīng)該盡量避免引物二聚體的形成。所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)包拮上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核昔酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對(duì)包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。所述試劑盒還可包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑和檢樣管。所述檢樣管為含F(xiàn)TA卡片的離心管。所述試劑盒和可包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。所述陽性對(duì)照可為FTA卡片上黏附了如下核酸序列或粘附了含有如下核酸序列的質(zhì)粒的檢樣管高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2區(qū)部分序列)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑具體可為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HCl、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、鈣黃綠素、MnCl2、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)、所述外側(cè)引物對(duì)及所述環(huán)形引物對(duì)，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；每23nL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HCl0.5umo1、KC10.25nmol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2-20urao1、甜菜堿20umo1、藥黃綠素0.00125"mol、MnCl20.015nmol、4種脫氧核苷酸各0.035ymol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04-0.06umol，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004-0.008ymol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23pL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量?jī)?yōu)選如下Tris-HC10.5ymol、KC10.25umol、(NH4)2S040.25nmol、Tween200.025iiL、MgS040.2umo1、甜菜堿20umol、f丐黃綠素0.00125pmol、MnCl20.015umol、4種脫氧核苷酸各0.035umo1、BstDNA聚合酶16U、細(xì)V反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04umo1，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004umol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02umol。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，包括如下步驟用所述的專用引物或所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒對(duì)來自死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。所述檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與力乎吸綜合征病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒。直接檢視方法為裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。如果裝有待檢測(cè)樣品的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體，則說明待檢樣品中高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測(cè)樣品的檢樣管有亮綠色可見熒光，則說明樣品中高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性。所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒具體可為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HUB1株。所述專用引物在制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用與屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理如下根據(jù)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(N印2區(qū)部分序列)(序列表的序列1)設(shè)計(jì)了一組用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(duì)(內(nèi)側(cè)上游引物FIP和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(duì)(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對(duì)(環(huán)形上游引物L(fēng)F和環(huán)形下游引物L(fēng)B)。三對(duì)引物和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(2701-3150)部分序列變異區(qū)域的八個(gè)特定區(qū)域的序列完全配對(duì)，確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)方法的特異性。F3:SEQIDN02:CCTTTGAGTGGGTCAGCAC(序列表的序列2);B3:SEQIDNO3:GTGCAGGGTTGGTGTCATT(序列表的序列3);FIP:SEQIDNO4:GCAGACAAATCCAGAGGCTC竹TTAGTTCCTGGACCGCGTAGA(序列表的序列4);BIP:SEQIDNO5:CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC(序列表的序列5);LF:SEQIDN06:CTGGTGCGTCAGCGTTG(序列表的序列6);LB:SEQIDN07:ATGGGCATCCTG(M恥eG(序列表的序列7)。所述的引物組與所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2區(qū)部分序列)上8個(gè)特定區(qū)域結(jié)合，見表l表l引物組與N印2區(qū)部分序列的結(jié)合區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述引物組在AMV反轉(zhuǎn)錄酶和具有高度鏈置換催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成對(duì)模板RNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增過程分為三個(gè)階段，具體如下(1)反轉(zhuǎn)錄階段在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，樣本RNA被反轉(zhuǎn)錄為cDNA。(2)循環(huán)起始階段一端內(nèi)側(cè)引物先與模板結(jié)合并啟動(dòng)DNA合成。相同一端的外側(cè)引物隨后與模板結(jié)合啟動(dòng)DNA合成，并發(fā)生鏈置換釋放出含有內(nèi)側(cè)引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成并發(fā)生鏈置換，最后形成一個(gè)初始的莖環(huán)DNA。(3)反應(yīng)循環(huán)階段內(nèi)側(cè)引物與初始莖環(huán)DNA結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換DNA合成，可產(chǎn)生另一個(gè)初始莖環(huán)DNA和一個(gè)新的兩倍長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA。這些莖環(huán)DNA可作為模板繼續(xù)與內(nèi)側(cè)引物結(jié)合啟動(dòng)鏈置換DNA合成，并且每次合成均可使莖壞DNA的盞長(zhǎng)度成倍增長(zhǎng)。進(jìn)入循環(huán)階段后，會(huì)產(chǎn)生許多分子大小不同的莖環(huán)DNA，這些莖環(huán)DNA還可作為模版與環(huán)形引物結(jié)合，啟動(dòng)更多的DNA合成并發(fā)生鏈置換。最后經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的等溫?cái)U(kuò)增，目的DNA可累積109拷貞。應(yīng)用本發(fā)明提供的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，特異性高且靈敏度高，可檢測(cè)出IO個(gè)拷貝的目的脂A。與PCR檢測(cè)方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬或水浴鍋即可，并且檢測(cè)結(jié)果通過觀察可見熒光即可，操作簡(jiǎn)單方便。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)及食品中可能污染的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)，特別適于基層臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)工作及現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒可包括如下步驟(1)樣本的處理①待測(cè)樣本—取待測(cè)血液樣本lOy1滴加于檢樣管內(nèi)的FTA卡(Whatman,CatNo.WB120205)上，室溫放置10min后，用移液管將血液吸出，留下紙片。加入200ixlddH20，在室溫下放置5分鐘(如需要，可在管內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜斯せ旌?。用移液管將管內(nèi)用過的ddH20全部吸出，即得。②陰性對(duì)照用10u1雙蒸水代替待測(cè)血液樣本，滴加于檢樣管內(nèi)FTA卡上，室溫放置10min后，用移液管將液體吸出，留下紙片。加入200ulddH20，在室溫下放置5分鐘。用移液管將管內(nèi)用過的ddH20全部吸出，即得。(2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增①向檢樣管中加入23u1的LAMP反應(yīng)液(2mm的FTA卡在反應(yīng)體系中視為2ti1);②于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上60-65'C放置20-90分鐘，取出。在步驟②完成后，取出前，還可以再調(diào)水浴鍋溫度到80-9(TC反應(yīng)g-IO分鐘，目的是能夠終止反應(yīng)，以便長(zhǎng)期保存反應(yīng)結(jié)果。(3)結(jié)果判定可以通過直接檢視判斷樣本是杏含有高致病性豬繁殖與呼咴綜合征病毒。裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。如果裝有待檢測(cè)樣品的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體，則說明待檢樣品中高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果裝有待檢測(cè)樣品的檢樣管有亮綠色可見熒光，則說明樣品中高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性。實(shí)施例l、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成人工合成以下3對(duì)引物F3:CCTTTGAGTGGGTCAGCAC;B3:GTGCAGGGTTGGTGTCATT;FIP:GCAGACAAATCCAGAGGCTCTTTTAGTTCCTGCACCGCGTAGA;BIP:CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC;LF:CTGGTGCGTCAGCGTTG;LB:ATGGGCATCCTGGAGGCG。二、檢樣管的制備用2.0mm打孔取樣器從空白的FTA卡(Whatman,CatNo.WB120205)上取下直徑2.0mm的小圓片，置一0.25ml離心管底部。三、陽性對(duì)照的制備生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)長(zhǎng)成單層后，用Hank's液(pH7.4)洗滌2次，接種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒即B1株(農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心)，37。C吸附1h，加含1%犢牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待CPE達(dá)70%左右時(shí)收獲病毒液，取10微升病毒液，參照Invitrogen公司TRIZOL試劑盒提取RNA，加至檢樣管內(nèi)的FTA卡上。室溫放置10min后，用移液管將血液吸出；留下紙片。加入200ylddH20，在室溫下放置5分鐘(如需要，可在管內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜斯せ旌?。用移液管將管內(nèi)用過的ddH20全部吸出。病毒RNA即黏附在處理過的FTA圓片上。得到陽性對(duì)照，-20~-4"保存?zhèn)溆?。四、配制LAMP反應(yīng)液每23yLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HC1、0.25umo1KC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025uLTween20、0.2umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、0.00125umol鈣黃綠素、0.015nraolMnCl2、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.04umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.004umol上游外側(cè)引物(F3)、0.004umol下游外側(cè)引物(B3)、0.02nmol上游環(huán)形引物(LF)、0.02umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。五、試劑盒的組裝該試劑盒由以下物質(zhì)組成步驟四配制的LAMP反應(yīng)液、步驟三制備的陽性對(duì)照和步驟二制備的檢樣管若干支。實(shí)施例2、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、檢樣管的制備同實(shí)施例1的步驟二。三、陽性對(duì)照的制備同實(shí)施例1的步驟三。四、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5urao1Tris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025uLTween20、20umolMgS04、20umol甜菜石咸(Betaine)、0.00125uraol,丐黃綠素、0.015umolMnCl2、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035圃1、0.06wmo1上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.06wmo1下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.008umo1上游外側(cè)引物(F3)、0.008ytnol下游外側(cè)引物(B3)、0.04nmol上游環(huán)形引物(LF)、0.04umo1下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。五、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟五。實(shí)施例3、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、檢樣管的制備同實(shí)施例1的步驟二。三、陽性對(duì)照的制備同實(shí)施例1的步驟三。四、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HC1、0.25nmolKC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025yLTween20、10umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、0.00125umol鈣黃綠素、0.015ymolMnCl2、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.05nmol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.006umol上游外側(cè)引物(F3)、0.006umol下游外側(cè)引物(B3)、0.03ymol上游環(huán)形引物(LF)、0.03umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。五、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟五。實(shí)施例4、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對(duì)兩只豬采血，采用實(shí)施例l制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、樣本的處理'1、待測(cè)樣本取待測(cè)血液樣本10ul滴加于檢樣管內(nèi)的FTA卡上，室溫放置10min后，用移液管將血液吸出，留下紙片。加入200ulddH20，在室溫下放置5分鐘(如需要，可在管內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜斯せ旌?。用移液管將管內(nèi)用過的ddH20全部吸出，即得。采用病豬血樣進(jìn)行上述處理，得到三支含有病豬血樣的檢樣管。采用健康豬血樣進(jìn)行上述處理，得到三支含有健康豬血樣的檢樣管。2、陰性對(duì)照用10ia雙蒸水代替待測(cè)血液樣本，滴加于檢樣管內(nèi)FTA卡上，室溫放置10min后，用移液管將液體吸出，留下紙片。加入200ulddH20，在室溫下放置5分鐘。用移液管將管內(nèi)用過的ddH20全部吸出，即得。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在每支含有病豬血樣的檢樣管中加入23u丄的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組l;在每支含有健康豬血樣的檢樣管中加入23nL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組2;取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各3支，分別加入23yL的LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置90分鐘，取出。三、檢視裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。健康豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例5、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對(duì)兩只豬采血，采用實(shí)施例3制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、樣本的處理同實(shí)施例4的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在每支含有病豬血樣的檢樣管中加入23uL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組l;在每支含有健康豬血樣的檢樣管中加入23uL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組2;取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各3支，分別加入23yL的LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在金屬浴鍋上65r放置70分鐘，取出。三、檢視裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。健康豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例6、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，l只健康豬。分別對(duì)兩只豬采血，采用實(shí)施例2制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、樣本的處理同實(shí)施例4的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在每支含有病豬血樣的檢樣管中加入23yL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組l;在每支含有健康豬血樣的檢樣管中加入23uL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組2;取陽性對(duì)上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置50分鐘，取出。三、檢視裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。健康豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例7、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的死豬，l只健康豬。分別對(duì)兩只豬采血，采用實(shí)施例l制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、樣本的處理同實(shí)施例4的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在每支含有病豬血樣的檢樣管中加入23yL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組1;在每支含有健康豬血樣的檢樣管中加入23uL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組2;取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各3支，分別加入23uL的LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上65"放置30分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到80。C反應(yīng)10min,取出。三、檢視裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光,液體。健康豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，死豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例8、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，l只確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的死豬，l只健康豬。分別對(duì)兩只豬采血，采用實(shí)施例2制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、樣本的處理同實(shí)施例4的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在每支含有病豬血樣的檢樣管中加入23uL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組1;在每支含有健康豬血樣的檢樣管中加入23nL的LAMP反應(yīng)液，作為檢測(cè)組2;取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各3支，分別加入23pL的LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置20分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到9(TC反應(yīng)2min，取出。三、檢視裝有陽性對(duì)照的檢樣管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的檢樣管仍為棕黃色無熒光液體。健康豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，死豬檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例9、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒靈敏度的檢測(cè)制備O.5Xl(T拷貝/uL、0.5X103拷貝/uL、0.5X102拷貝/uL、5拷貝/uL和0.5拷貝/uL攜帶GenBankAccessionNumberEF075945中ORFla區(qū)域的Nsp2區(qū)部分序列的質(zhì)粒樣本。采用實(shí)施例3制備的試劑盒對(duì)質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)?！銮f企AiVi止ilA7、w線口、j巾!j貨提取高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HUB1株(農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心)的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到DNA，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增得到病毒基因組GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla區(qū)域0RF1的Nsp2區(qū)部分序列(見序列表的序列1)。再與T載體連接后即形成所需要的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒分子對(duì)應(yīng)一個(gè)拷貝的Nsp2區(qū)部分序列。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)?？呻S著感受態(tài)細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。最后從感受態(tài)細(xì)胞中提取純化質(zhì)粒。得到的質(zhì)?？赏ㄟ^分光光度計(jì)法測(cè)定并計(jì)算拷貝數(shù)濃度。用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到所需要的濃度，即0.5乂104拷貝/yL、0.5Xl(f拷貝/iiL、0.5Xl()2拷貝/iiL、5拷貝/uL禾卩0.5拷貝/uL。檢測(cè)時(shí)加入各濃度質(zhì)粒2uL，每個(gè)反應(yīng)中對(duì)應(yīng)含有104拷貝/iiL、103拷貝/uL、102拷貝/pL、10拷貝/uL、l拷貝/yL的質(zhì)粒樣本。(可參考《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，所需要的試劑和儀器均為巿面可購(gòu)買的。)二、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述各濃度的質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增取步驟一得到O.5X104、0.5X103、0.5Xl()2拷貝/iiL、5拷貝/uL禾口0.5拷貝/pL拷貝/iiL的質(zhì)粒樣本各2uL，分別加至3支檢樣管中，每管再加入23nL的L細(xì)P反應(yīng)液，分別作為檢測(cè)組l、2、3、4和5;用相同體積的滅菌雙蒸水代替15質(zhì)粒樣本同法制備陰性對(duì)照；另取3支陽性對(duì)照，加入23uL的LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上65'C放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對(duì)照組的三個(gè)檢樣管均有亮綠色可見熒光，陰性對(duì)照組的三個(gè)檢樣管均為棕黃色無熒光液體。檢測(cè)組1的三個(gè)檢樣管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組2的三個(gè)檢樣管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組3的三個(gè)檢樣管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組4的三個(gè)檢樣管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組5的三個(gè)檢樣管均為棕黃色無熒光液體。<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用<130〉CGGNARY92072〈160>7<210〉1<211〉450<212〉薩<213>高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HUB1株(PorcinerespiratoryandreproductivesyndromevirusstrainHUBl)<210〉2<211〉19<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2cctttgagtgggtcagcac19〈210〉3〈211〉19〈212〉DNA〈400〉gctccgcgcacctaacggttatgacacctaacacctttgaacgcaccaggcccctagcacgtcctgagtgagctccctgtggaaggtcagatccgattgccgga卿aactgtcggtggttgagtgagcccgtacttgtggtgggtcagcaccagttcctatgagcctctggatttgtctcgtcgcagaacatgggcatcaaatctcggatatactaaatcaagtgttaagatcacacgcggcagcccggttttgatgggcgacaatgtccccctcaattttccgacaccatccgagccgcccgcgtcgcgacgtgtccccaagctgatggcaccgcgtagaactgtgaicaacaacgctggcgtcctcacagacggaatatgaggctttcctgg鄧gcgggggggca卿agctgagg肌gacaccaaccctgcacctgtgtcatcaagc60120180240300360420450〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉3gtgcagggttggtgtcatt<210>4<211〉43<212>醒〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉4gcagacaaatccagaggctcttttagttcctgcaccgcgtaga43<210〉5<211>44〈212〉廳<213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉5cctagcaccgtcgcagaacatttttcactcaggacttcctcage<210〉<211><212><213〉617DNA人工序列<220〉〈223〉〈400>6ctggtgcgtcagcgttg〈210>7<211>18<212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉7atgggcatcctggaggcg說明書第16/16頁171819權(quán)利要求1、檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物組成一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a區(qū)域的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a區(qū)域的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a區(qū)域的環(huán)形引物對(duì)。2、如權(quán)利要求l所述的專用引物，其特征在于所述專用引物中，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸區(qū)域的環(huán)形引物對(duì)。3、如權(quán)利要求2所述的專用引物，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。4、含有權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑和檢樣管；所述檢樣管為含F(xiàn)TA卡片的離心管。6、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HC1、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、鈣黃綠素、MnCl2、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)、所述外側(cè)引物對(duì)及所述環(huán)形引物對(duì)，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，含有如下溶質(zhì)Tris-HCl0.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2-20umo1、甜菜堿20umo1、,丐黃綠素0.00125umol、MnCl20.015timo1、4種脫氧核苷酸各0.035umo1、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04-0.06umo1，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004-0.008ymol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23!iL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，優(yōu)選含有如下溶質(zhì)Tris-HCl0.5nmol、KC10.25mol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2umol、甜菜堿20wraol、鈣黃綠素0.00125umol、MnCl20.015umol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDM聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04師l，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004ymol,所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02umol。8、一種檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1至3中任一所述的專用引物或權(quán)利要求4至7中任一所述的試劑盒對(duì)來fi死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。10、權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物在制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物組成一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中0RF1a區(qū)域的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a區(qū)域的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是能結(jié)合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a區(qū)域的環(huán)形引物對(duì)。本發(fā)明提供的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)試劑盒是包括所述專用引物的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒，檢測(cè)靈敏度高，10個(gè)拷貝即可檢測(cè)出目的RNA，操作簡(jiǎn)單方便，特別適于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)及食品中可能污染的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101525671SQ20091007805公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年2月11日優(yōu)先權(quán)日2009年2月11日發(fā)明者萍付,吳文學(xué),張躍偉申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)