專利名稱：用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種組織工程皮膚研究中的生物試劑類，特別是一種用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，它由三部分即表皮層、真皮層和皮下層構(gòu)成。表皮層位于皮膚的最外層，厚度介于0.06 0.8mm之間，其微結(jié)構(gòu)由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì)層構(gòu)成。角質(zhì)層是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的最后產(chǎn)物，其組成中75% 80°/。為蛋白質(zhì)，5% 15%為脂類，由10 15層細(xì)胞構(gòu)成厚度大約10pm的結(jié)構(gòu)。角質(zhì)層有著許多重要的生理功能，能夠有效阻擋外界毒性化合物對(duì)皮膚活性細(xì)胞的損傷，特別是對(duì)化妝品成分中潛在可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性有著極為重要的屏障作用。
組織工程皮膚經(jīng)歷了從表皮替代物、真皮替代物到雙層結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚替代物的階段，其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究有了廣泛的進(jìn)步。應(yīng)用研究涉及體內(nèi)應(yīng)用和體外應(yīng)用，體內(nèi)應(yīng)用集中在各種皮膚創(chuàng)傷的治療，體外主要運(yùn)用于化合物的毒性檢測(cè)，如化合物的腐蝕性、刺激性、光毒性、生殖毒性等的檢測(cè)。體外毒性檢測(cè)方面，歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)主導(dǎo)的對(duì)各種動(dòng)物替代方法進(jìn)行的驗(yàn)證工作是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，引起了世界范圍的關(guān)注。以組織工程皮膚為例，進(jìn)行的化合物腐蝕性檢測(cè)目前有EpiDerm和EpiSkin兩種產(chǎn)品通過驗(yàn)證，刺激性檢測(cè)目前有EpiSkin、 SkinEthic RHE和EpiDerm SIT通過了驗(yàn)證。雖然在驗(yàn)證階段已經(jīng)通過了審查，有的甚至被法規(guī)接受，但是，基于組織工程皮膚^化合物檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室研究或者是企業(yè)產(chǎn)品上的運(yùn)用并沒有得到推廣。很大程度上是因?yàn)槠駷橹箾]有開發(fā)出適合運(yùn)輸且具備良好性能的組織工程皮膚運(yùn)輸培養(yǎng)液所致。 一方面，組織工程研究屬于高精技術(shù)領(lǐng)域，普通實(shí)驗(yàn)室或者公司根本沒有實(shí)力開發(fā)組織工程產(chǎn)品；另一方面，有能力開發(fā)的單位因?yàn)闆]有找到合適的運(yùn)輸培養(yǎng)液而限制了產(chǎn)品的推廣甚至是放棄了產(chǎn)品的研發(fā)和投入。
目前，市場(chǎng)上還沒有商業(yè)化的組織工程皮膚運(yùn)輸培養(yǎng)液。經(jīng)檢索，具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、組織培養(yǎng)效果好且能有效維持運(yùn)輸過程中組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)液，至今尚未見公開資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、組織培養(yǎng)效果好且能有效維持運(yùn)輸過程中組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)和功能，具有很高的商業(yè)產(chǎn)業(yè)化前景。
一種用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其組分及各組分的用量為
(1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成
DMEM培養(yǎng)液 60 70%
F12培養(yǎng)液 20 25%
胎牛血清 5 20%
(2) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)-
氫化可的松0.4 0.5 itig/mL
表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5 15 ng/mL
異丙基腎上腺素1 3xl(T6 mol/L
胰島素5 15pg/mL
轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10 )a_g/mL
三碘甲狀腺氨酸2 6xl(T9 mol/L
腺嘌呤1 3xl0"4 mol/L
維生素c50 100pg/mL
霍亂毒素0.1 ~1腿ol/L
L-絲氨酸l 3xl(T2mol/L
L-肉毒堿1 5x10-5 mol/L
軟脂酸15 35 nmol/L
亞油酸5 25 |_imol/L
花生四烯酸5 10 |_imol/L
牛腦垂體提取物10 50 pg/mL
牛血清白蛋白2 7xl(T5 mol/L
青霉素100U/mL
鏈霉素100 mg/mL
兩性霉素B1 4 mg/mL
(3)瓊脂 10 25g/LPH值調(diào)整為7.2 7.4。
本發(fā)明的用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其配制方法包括以下步驟(l)將購(gòu)買的商用DMEM和F12粉劑分別按照說明書的要求配制成溶液;
5(2) 取步驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清混合使其體積濃度分別占到總體積的60 70%、 20 25%和5 20%，充分混合，三者體積份數(shù)和為100%，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
(3) 將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、維生素C、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、霍亂毒素、L-絲氨酸、L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)PH值7.2 7.4;并將得到的溶液用0.2 nm濾器過濾除菌；
(4) 瓊脂以50 100 g/L濃度加熱攪拌溶于雙蒸水中，高壓滅菌，作為儲(chǔ)存品；
(5) 將步驟(3)得到的培養(yǎng)液無菌放入水浴鍋45 55'C加熱；
(6) 將步驟(4)得到的瓊脂儲(chǔ)存品無菌放入水浴鍋95'C加熱，直至完全熔化；
(7) 取步驟(6)得到的液態(tài)瓊脂加入步驟(5)的培養(yǎng)液中，使瓊脂的終濃度達(dá)到10 25 g/L,攪拌并充分混合，分裝冷卻后即得本發(fā)明的組織工程皮膚運(yùn)輸培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基，在配制好后趁熱加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，待冷卻后即將構(gòu)建好的組織
工程皮膚等放置其上后密閉即可。用此保存的組織工程皮膚可長(zhǎng)時(shí)間保存和運(yùn)輸。
本發(fā)明用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn) 一是本發(fā)明培養(yǎng)基的穩(wěn)定性強(qiáng)，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月左右，完全滿足組織工程皮膚產(chǎn)品跨大范圍地域的運(yùn)輸；二是本發(fā)明培養(yǎng)基能有效維持運(yùn)輸過程中組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)和功能；三是本發(fā)明培養(yǎng)基配制方法簡(jiǎn)便，添加物均溶于液體，便于產(chǎn)品的合成和規(guī)模生產(chǎn)；四是本發(fā)明培養(yǎng)基冷卻后為固態(tài)，便于運(yùn)輸途中挪動(dòng)。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體闡述一、本發(fā)明用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基的配制1、其組分及各組分的用量為
(1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成-
DMEM培養(yǎng)液 65%
F12培養(yǎng)液 25%
胎牛血清 10°/。
(2) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
氫化可的松 0.4 0.5 ng/mL
6表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5 15 ng/mL
異丙基腎上腺素l 3xl0—6mol/L
胰島素
轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10 (ig/mL
三碘甲狀腺氨酸2 6xlO-9mol/L
腺嘌呤1 3xl()4mol/L
維生素c50 100嗎/mL
霍亂毒素0.1 1 nmol/L
L-絲氨酸I 3xl0'2mol/L
L-肉毒堿1 5xl(T5 mol/L
軟脂酸15 35 pmol/L
亞油酸5 25 (_imol/L
花生四烯酸5 10 jimoI/L
牛腦垂體提取物10 50 (ag/mL
牛血清白蛋白2 7xl(T5 mol/L
青霉素100U/mL
鏈霉素100 mg/mL
兩性霉素B1 4 mg/mL
(3)瓊脂 10 25g/LPH值調(diào)整為7.2 7.4。
2、配制方法和應(yīng)用
(1) 將購(gòu)買的商用DMEM和F12粉劑分別按照說明書的要求配制成溶液；
(2) 取步驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清混合，三者體積份數(shù)和為100%，其中三者的體積百分比分別可在60 70%、 20 25%和5 20%范圍內(nèi)自由選擇,制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
(3)將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、維生素C、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、霍亂毒素、L-絲氨酸、L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)PH值7.2 7.4;并將得到的溶液用0.2 濾器過濾除菌；
7(4) 瓊脂以50 100g/L濃度加熱攪拌溶于雙蒸水中，高壓滅菌，作為儲(chǔ)存品；
(5) 將步驟(3)得到的培養(yǎng)液無菌放入水浴鍋45 55'C加熱；
(6) 將步驟(4)得到的瓊脂儲(chǔ)存品無菌放入水浴鍋95'C加熱，直至完全熔化；
(7) 取步驟(6)得到的液態(tài)瓊脂加入步驟(5)的培養(yǎng)液中，使瓊脂的終濃度達(dá)到10 25 g/L，攪拌并充分混合，趁熱分裝到細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，待冷卻后即將構(gòu)建好的組織工程皮膚等放置其上后密閉即可。用此保存的組織工程皮膚可長(zhǎng)時(shí)間保存和運(yùn)輸。
以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1. 一種用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其特征在于其組分及各組分的用量為(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成DMEM培養(yǎng)液 60～70％F12培養(yǎng)液20～25％胎牛血清 5～20％(2)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氫化可的松 0.4～0.5μg/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 5～15ng/mL異丙基腎上腺素 1～3×10-6mol/L胰島素 5～15μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白 5～10μg/mL三碘甲狀腺氨酸 2～6×10-9mol/L腺嘌呤 1～3×10-4mol/L維生素C 50～100μg/mL霍亂毒素 0.1～1nmol/LL-絲氨酸 1～3×10-2mol/LL-肉毒堿 1～5×10-5mol/L軟脂酸 15～35μmol/L亞油酸 5～25μmol/L花生四烯酸 5～10μmol/L牛腦垂體提取物 10～50μg/mL牛血清白蛋白 2～7×10-5mol/L青霉素 100U/mL鏈霉素 100mg/mL兩性霉素B1～4mg/mL(3)瓊脂 10～25g/LPH值調(diào)整為7. 2～7.4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其特征在于其配制方法包括以下步驟(1) 將購(gòu)買的商用DMEM和F12粉劑分別按照說明書的要求配制成溶液；(2) 取步驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清混合使其體積濃度分別占到 總體積的60 70%、 20 25%和5 20%，充分混合，三者體積份數(shù)和為100%,制成基 礎(chǔ)培養(yǎng)液；(3) 將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、 維生素C、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、霍亂毒素、L-絲氨酸、 L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、青霉素、 鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)PH值7.2 7.4;并將得 到的溶液用0.2 pm濾器過濾除菌；(4) 瓊脂以50 100g/L濃度加熱攪拌溶于雙蒸水中，高壓滅菌，作為儲(chǔ)存品；(5) 將步驟(3)得到的培養(yǎng)液無菌放入水浴鍋45 55'C加熱；(6) 將步驟(4)得到的瓊脂儲(chǔ)存品無菌放入水浴鍋95'C加熱，直至完全熔化；(7) 取步驟(6)得到的液態(tài)瓊脂加入步驟(5)的培養(yǎng)液中，使瓊脂的終濃度達(dá)到10 25 g/L， 攪拌并充分混合，分裝冷卻后即得本發(fā)明的組織工程皮膚運(yùn)輸培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基在組織工程皮膚運(yùn)輸中的應(yīng)用。
全文摘要
一種用于組織工程皮膚運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)基，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、維生素C、霍亂毒素、L-絲氨酸、L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B，得到的培養(yǎng)基，穩(wěn)定性強(qiáng)，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月左右，完全滿足組織工程皮膚產(chǎn)品跨大范圍地域的運(yùn)輸，能有效維持運(yùn)輸過程中組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)和功能，冷卻后為固態(tài)，便于運(yùn)輸途中挪動(dòng)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101486995SQ20091007830
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者王軍兵, 艷 程, 董益陽(yáng), 鄒運(yùn)動(dòng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院