專利名稱：植物耐逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmNAC20及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種 與植物耐逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmNAC20及其編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)背景環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對(duì)植物的生長(zhǎng) 發(fā)育有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主 要目標(biāo)之一。目前，基因工程育種已經(jīng)成為增強(qiáng)作物耐逆性的重要方法之一。高等 植物細(xì)胞有多種途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多類轉(zhuǎn)錄因子與植物耐逆性相關(guān)，例如EREBP/AP2中的DREB類，bZIP, MYB， WRKY等等。NAC (^W/^7^/^/ /^7(20家族是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，已經(jīng)研究的NAC 基因在不同的生命過(guò)程中起到非常重要的作用。例如對(duì)病原菌的防衛(wèi)、植物衰亡、 形態(tài)發(fā)生以及對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答等。大豆是世界上提供可食性植物油的主要來(lái)源，并且為畜牧業(yè)提供高蛋白飼料和 為人類提供高品質(zhì)蛋白，它們的生長(zhǎng)和產(chǎn)量時(shí)常受到非生物環(huán)境脅迫的影響。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因。 本發(fā)明所提供的耐逆性相關(guān)蛋白，名稱為^z/WC^，來(lái)源于大豆，是如下l) 或2)的蛋白質(zhì)1) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2) 將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由268個(gè)氨基酸殘基組成，是大豆中的NAC類轉(zhuǎn)錄因子。其 編碼基因的讀碼框包含807個(gè)核苷酸。上述(b)中的GmNAC20可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表 達(dá)得到。上述(b)中的GmNAC20的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1自5'端第1至807位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行 一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的 編碼序列得到。上述植物耐逆性相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 與植物耐逆性相關(guān)蛋白的編碼基因具體可為如下l) -3)中任一所述的基因1) 其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端的第1-807位脫氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3) 在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1的自5'末端的第1-807位脫氧核糖核苷酸 雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。序列表中的序列1由807個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5'末端的第1至807位 脫氧核糖核苷酸為fi/ 朋(2Y 的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，自5，端 的第l至3位脫氧核糖核苷酸為ftz 7W6^ 的起始密碼子ATG，自5'端的第805至807 位脫氧核糖核苷酸為ftaV^2W的終止密碼子TAG。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2X SSC, 0. 1% SDS和1 X SSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。含有上述與植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有fiaWC^基因的重組表達(dá)載體。所述植物表 達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還 可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA 加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體 的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因 (如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用fe2/^C^ 構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一 種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的 泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外， 使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需 與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始 密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn) 行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物 的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為在pBin438的多克隆位點(diǎn)(如5a/rfn和位點(diǎn)) 間插入自序列表中序列1的自5'末端的第1-807位脫氧核苷酸得到的本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述^^^^ 基因?qū)胫参锛?xì)胞中， 得到耐逆植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的大豆 NAC家族轉(zhuǎn)錄因子fta^C^ 的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)低溫和鹽等非生物 逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。所述植物耐逆性具體可為對(duì)非 生物脅迫的耐逆性，如對(duì)鹽和/或低溫脅迫的耐逆性。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直 接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織， 并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以 是雙子葉植物，如大豆、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪 草、苜宿等。將本發(fā)明的^/2/^C^基因?qū)胍吧透鐐惐葋喩鷳B(tài)型擬南芥的實(shí)驗(yàn)可以證明 L代的3個(gè)轉(zhuǎn)6iaWC^^基因植株(20-a， 20-b和20-c)，在鹽脅迫和耐低溫實(shí)驗(yàn)中， 存活率和生長(zhǎng)狀態(tài)都要明顯好于轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照植株。說(shuō)明本發(fā)明提供的ftz 7^C^ ^^與其編碼的蛋白能夠顯著提高植物的耐鹽性和耐低溫性。對(duì)培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽和/或耐低溫)的作物、林草等新品種具有重 要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育 和鑒定。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為Northern分析fts朋6^ 在干旱、鹽和低溫脅迫處理下的表達(dá)特征。 圖2為植物表達(dá)載體pBin438-fiH/WCi^的圖譜。圖3為Northern雜交檢測(cè)6"/zz/WC^基因在轉(zhuǎn)fia^6^ 基因植株中的表達(dá)量。 圖4為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(Col-0)和轉(zhuǎn)fta^C^基因植株在耐鹽性實(shí)驗(yàn)中的 生長(zhǎng)形態(tài)比較照片。圖5為耐鹽性實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)6iH/V^^0基因株系和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(Col-0)的 蓮座直徑和存活率比較。圖中的數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖6為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(Col-0)和轉(zhuǎn)6iffiWC^ 基因植株在耐低溫實(shí)驗(yàn)中的 生長(zhǎng)狀態(tài)和存活率對(duì)比。圖7為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(Col-0)和轉(zhuǎn)ft/z/^2^基因植株在適應(yīng)化處理抗凍 實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)狀態(tài)和存活率對(duì)比。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中，20-a與20a表示同一株系，20_b與20b表示同一株系，20-c 與20c表示同一株系。實(shí)施例1、大豆耐逆性相關(guān)蛋白fe/yWCi^編碼基因ft/z/W(^。的篩選及其cDNA 克隆。在大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，聚類到54個(gè)NAC類基因片段。根據(jù)54 個(gè)NAC基因片段的序列設(shè)計(jì)54對(duì)引物，用常規(guī)方法從分別以250mM NaCl、干旱、 -4°C處理及未處理的3珣大豆南農(nóng)1138-2幼苗中提取總RNA，經(jīng)RT-RCR方法分別 測(cè)定了 54個(gè)NAC基因在上述處理時(shí)的表達(dá)特征，其中有15個(gè)fizz/WC基因至少對(duì)低 溫、干旱和高鹽中的一種脅迫有應(yīng)答反應(yīng)。6izz/V^:^ 基因的表達(dá)明顯受干旱、低溫 或鹽脅迫誘導(dǎo)。因此對(duì)該基因作進(jìn)一步研究。首先確認(rèn)其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答。提取經(jīng)lOOmM NaCl處理的大豆南農(nóng)1138-2 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供)幼苗的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。根據(jù)上述檢索獲得的基H序列設(shè)計(jì)引物如下5， —TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC-3, 和5' -GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3'。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)，得到分子量約為800bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試6劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-T Easy (Promega)連接，參 照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆， 得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引 物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的ft7z/W6^ 基因由807個(gè)脫氧核 糖核苷酸組成，其開(kāi)放閱讀框(ORF)為序列表中序列1的自5'末端第1至807位脫 氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)。將含有序列表中序列 1的自5'末端第1-807位脫氧核糖核苷酸的6izz/WC^ 基因的重組載體命名為 pTE-6"滿d
實(shí)施例2、逆境脅迫處理下大豆^77^6^ 基因的表達(dá)特征
將大豆南農(nóng)1138-2種子種在盆中，生長(zhǎng)2個(gè)星期后取幼苗進(jìn)行如下脅迫處理
1) 鹽脅迫處理將大豆幼苗移入200raM NaCl溶液中；
2) 滲透脅迫處理將豆苗根部小心的吸去水分，置于濾紙上暴露于室溫空氣中；
3) 低溫脅迫處理將豆苗浸入預(yù)冷的水中，置于4t:冰箱；
4) 脫落酸(ABA)處理，將豆苗根浸入100uM ABA溶液中。 每種處理在0、 1、 3、 6、 12、 24小時(shí)分別收集新鮮葉片lg在液氮中研碎，懸
于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無(wú)水乙醇沉淀 得到總RNA。以上述擴(kuò)增的ftH/WC^片段(核苷酸序列是序列表中的序列1)為探 針，進(jìn)行Northern分析。
結(jié)果如圖l所示，ftaA^^V 基因的表達(dá)明顯受干旱、200mMNaCl和低溫(4°C) 脅迫的誘導(dǎo)。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)ftz 7^C^ 基因培育耐鹽和耐干旱脅迫植物
1) fiaWC^ 表達(dá)載體pBin438-6W^ ^ 的構(gòu)建 以經(jīng)lOOmMNaCl處理的大豆南農(nóng)U38=2 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供)
幼苗的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有ife/dH和tT/ M接頭序列的特異引
物5， -TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC-3，禾口
5， -GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3， PCR擴(kuò)增fiH/WCW (序列表中的序 列1);然后&/aHI和勤"I雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將ft^/^^正向插入植物雙元 表達(dá)載體pBin438(李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草的研究[J].中國(guó)科學(xué)(B輯)，1994， 24(3) :276-282.)的CaMV 35S啟動(dòng)子之后的"a/dH和f/wl酶切 位點(diǎn)之間，得到重組載體pBin438-fiffi^C^，如圖2所示。
2) 轉(zhuǎn)6^朋C^基因植株的獲得和鑒定
將pBin438-fia/WC加用電擊法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGLl。 PCR鑒定后，通過(guò)用抽真 空法將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入野生型哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0) (Clough-SJ， Bent-AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant-Journal. 1998， 16: 6， 735-743)，種子收獲 后，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS篩選培養(yǎng)基上。待Tl代植株長(zhǎng)至4-6葉時(shí)移 到蛭石上生長(zhǎng)。將T1代單株收獲后，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續(xù)篩選
以觀察T2代的分離情況，如此重復(fù)數(shù)代直至獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)6^ywc^ 株系。
按照上述方法制備轉(zhuǎn)pBin438的T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，獲得12個(gè)轉(zhuǎn)pBin438
的T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，
提取野生型植株、T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株、轉(zhuǎn)fizzA^6^ 基因T。代植株的總RNA
進(jìn)行RT-PCR鑒定分析，引物如下
5' -TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC—3'禾卩
5' -GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3，。
結(jié)果表明，在23株轉(zhuǎn)ftaA^C^ 基因的T。代植株中，有14株檢測(cè)出^朋C^基 因的表達(dá)，而12株野生型和12株轉(zhuǎn)空載體的對(duì)無(wú)植株均沒(méi)有檢測(cè)出目的基因的表 達(dá)。將分子鑒定陽(yáng)性的植株單株收種子，各單株種子分別揚(yáng)種，用卡那霉素繼續(xù)篩 選以觀察L代的分離情況，如此重復(fù)直至T3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。共獲得 14個(gè)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)6"/hA^7^ 株系。
T。代表示轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株，T,代表示T。代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株， T2代表示T代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子 及由它所長(zhǎng)成的植株。
選擇穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)fiz 朋C^株系中ft/zA^lC^表達(dá)高的3個(gè)株系，進(jìn)行Northern 雜交驗(yàn)證。Northern雜交所用的探針為^M^2V 基因(序列表中的序列l(wèi))，結(jié)果 表明，該3株轉(zhuǎn)fe，朋C^ 基因的L代植株20-a, 20-b和20-c中，C/aA^CiY 基因有 不同程度的表達(dá)，而空載體對(duì)照植株則未能檢出表達(dá)，如圖3所示。
3) 轉(zhuǎn)^/z/W6^ 基因株系的耐逆性鑒定
在正常條件下，從幼苗期開(kāi)始觀察轉(zhuǎn)fts^C^植株與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株之間的差別，地上部分不論葉片形狀、葉片大小、抽苔時(shí)期和抽苔高度方面，轉(zhuǎn)^7Ai4C^
植株與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株并沒(méi)有明顯差別。
a) 耐鹽性試驗(yàn)
L代的轉(zhuǎn)空載體Col-O和L代的轉(zhuǎn)ftzz/V^7^ 的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(20-a， 20_b 和20-c)同時(shí)播種在MS平板上，將萌發(fā)后5天的幼苗分別移栽到含有0、 50、 100、 150和175mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天，轉(zhuǎn)fizz/WCi^苗與轉(zhuǎn)空載體Col-O 差別不顯著。將150mMNaCl處理后的幼苗移栽到蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)3、 7、 12直至15 天進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)中，所測(cè)試的各株系植株分別為15 株。結(jié)果表明轉(zhuǎn)fta^6^ 基因植株苗的生長(zhǎng)狀態(tài)和蓮座直徑，均明顯好于轉(zhuǎn)空載體 對(duì)照植株(圖4)。并且轉(zhuǎn)fe順62^基因植株的存活率也明顯好于對(duì)照在150mMNaCl 處理時(shí)，移苗恢復(fù)生長(zhǎng)15天的情況有明顯差異，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的存活率為42 ±7%，而轉(zhuǎn)6^朋6^基因植株的存活率與6i/zA^^的表達(dá)水平相關(guān)，在3個(gè)轉(zhuǎn)基因 株系中，20-a中的表達(dá)量最低，20-b中次之，20-c中最高，20-c株系植株的存活 率為82±10%， 20-1)株系植株的存活率為73±10%，他們的存活率顯著高于轉(zhuǎn)空載 體對(duì)照，而20-3的存活率為59±13%，高于對(duì)照但不顯著。上述結(jié)果與圖3所示 Northern分析的結(jié)果相符，20--c中^/V/IC^ 的表達(dá)最高，20-b次之，而20-a最低， 說(shuō)明轉(zhuǎn)6"/HA^7^7基因植株的耐鹽性明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(圖5)，同時(shí)其耐 鹽性與GmNAC20的表達(dá)量相關(guān)。
b) 耐低溫脅迫實(shí)驗(yàn)
將3個(gè)轉(zhuǎn)6WW(2V 基因株系(20-a, 20-b和20-c)的1代植株和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照 植株的T3代植株種在蛭石中， 一周后均勻移載至花盆，再生長(zhǎng)兩周左右，分別以-2 °C、 -4°C、 -6°C、 -8'C處理12小時(shí)，恢復(fù)生長(zhǎng)后統(tǒng)計(jì)存活率(圖6)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三 次重復(fù)，每次重復(fù)中，所測(cè)試的各株系植株分別為15株。結(jié)果表明-2°C，所有 植株包括的轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株和轉(zhuǎn)^zA^^Y 植株的存活率基本相同，均為98%， -8 "C處理下，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與轉(zhuǎn)6iaA^IC^ 植物均死亡。-4'C和-6"C處理下，3個(gè) 轉(zhuǎn)6iH/WC^ 株系的存活率明顯高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株-4°。處理下轉(zhuǎn)fia^C^株系 中，20-a株系的存活率為78±13%、 20-b株系的存活率為78±8%、 20-c株系的存 活率為90±7%，而轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的存活率為42±5%; -6t:處理下轉(zhuǎn)&^^^ 株系中，20-&株系的存活率為45±12%、 20-b株系的存活率為53±10%、 20-c株系 的存活率為47±8%，而轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的存活率為24±5%。說(shuō)明轉(zhuǎn)6fe/W6^ 基 因植株的耐低溫性明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(圖6)。適應(yīng)化處理抗凍實(shí)驗(yàn)(圖7)，先將上述的三周齡苗置于4。C處理4-5天，再 置于-7t:處理12小時(shí)，恢復(fù)生長(zhǎng)后統(tǒng)計(jì)存活率(存活率中分母表示實(shí)驗(yàn)株數(shù)，分 子表示存活株數(shù))。3個(gè)轉(zhuǎn)6fe/W6^ 株系的存活率明顯高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，轉(zhuǎn) fe^C^株系中，20-a株系的存活率為18. 5%、 20-b株系的存活率為25. 9%和20-c 株系的存活率35. 2%，而轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的存活率為8%。說(shuō)明了轉(zhuǎn)fiH/V^:^ 基因 植株的抗凍性明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株。序列表
<110〉中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
〈120>植物耐逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmNAC20及其編碼基因與應(yīng)用
<160> 2
〈210> 1
〈211> 807
〈212> DNA
〈213> 大豆屬大豆(C7/ci'; e /7 a;sr ( L.))
<400> 1
atggccgc叫caacacaac"tccacttaccccctgg己ttccgattccacctcaccgatgaa60
g犯ctcgtcgttcactatctctgccgcaaatgcgcttcgc36iga肌tcgcagttccaMa120
atcgccgaaettcg已tctctaccatgggaccttCC￡Lgg￡L￡Ltggctttgtac180
gga犯ga鄉(xiāng)agtggtattttttcacgccgagggaccgcaagtacccgaacggttcgcgg240
ccgaaccggtccgcggggaccggatactggaaggcetaccgaccggttggc300
ctgttgggatttggtttttt3CgCCgg犯3agcgcccaag360
ct肌ctgg已tcatgcacgagtatcgtctcgccgacgtggatcgttcggtt420
cgcaa^aagaacagcttaaggctggatgactgggtgctgtgtcgaattta480
ggtgcaattgagetagcetgcaaccagcaccgccaccaccgagtggggtcca540
tgttacgaaatgga卿cgtgaagccggagt由cggcggcggattgcctgtacttcgag600
gcttccgactcggtgccgcggctgcacacg3CggagtCg3gctgttcggagceiggtggtg660
tcggcggagtttgcg鄉(xiāng)gaggtgc柳gcgagcgga鄉(xiāng)ggC3gggC33C3gCg3gttt720
tcgtata^ttacatggatgccactctcgggaataatcag已tgtcgccgctccaggatatc780
ttcatgtacctctccaggcccttctga807
<210> 2<211> 268〈212〉 PRT
〈213〉 大豆屬大豆(67/ci"e 鵬^r ( L ))<400〉 2
Met Ala Ala Ala Thr Gin Leu His Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His15 10 15
Leu Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala20 25 30
Ser Gin Glu lie Ala Val Pro lie lie Ala Glu lie Asp Leu Tyr Lys35 40 45
Tyr Asp Pro Trp Asp Leu Pro Gly Met Ala Leu Tyr Gly Lys Lys Glu50 55 60
Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg65 70 75 80
Pro Asn Arg Ser Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp85 90 95Lys Pro Val Gly Lys Pro Lys Pro Val Gly lie Lys Lys Ala Leu Val100 105 110
Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp lie Met115 120 125
His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Val Arg Lys Lys Asn130 135 140
Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg lie Tyr Asn Lys Lys145 150 155 160
Gly Ala lie Glu Lys Gin Gin Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ser Gly Val165 170 175
His Lys lie Glu Cys Tyr Glu Met Glu Asp Val Lys Pro Glu Tyr Thr180 185 190
Ala Ala Asp Cys Leu Tyr Phe Glu Ala Ser Asp Ser Val Pro Arg Leu195 200 205
His Thr Thr Glu Ser Ser Cys Ser Glu Gin Val Val Ser Ala Glu Phe210 215 220
13Ala Ser Glu Val Gin Ser Glu Arg Lys Arg Gin Gly Asn Ser Glu Phe225 230 235 240
Ser Tyr Asn Tyr Met Asp Ala Thr Leu Gly Asn Asn Gin Met Ser Pro245 250 255
Leu Gin Asp lie Phe Met Tyr Leu Ser Arg Pro Phe260 26權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1) 其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端的第1-807位脫氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1;3) 在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1的自5'末端的第卜807位脫氧核糖核苷酸雜 交且編碼所述蛋白的DNA分子。
4、 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組載體為 pBin438-6iffi^GSY ;所述pBin438-fta^Ci^是在pBin438的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要 求2或3所述基因得到的重組表達(dá)載體。
6、 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)。
7、 一種培育耐逆植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)胫参锛?xì) 胞中，得到耐逆轉(zhuǎn)基因植物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因 是通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物為大豆、擬南芥、 水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草或苜蓿。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述耐逆植物是耐鹽和 /或耐低溫植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐逆性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種與植物耐逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmNAC20及其編碼基因與應(yīng)用。所述植物耐逆性相關(guān)蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因能顯著提高植物的耐鹽性和耐低溫性。本發(fā)明的耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤湍嬷参锲贩N，特別是培育耐非生物脅迫如耐鹽和/或耐低溫植物品種，從而對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101503467SQ200910078628
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者張萬(wàn)科, 張勁松, 晴 林, 郝宇鈞, 陳受宜, 彪 馬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所