專利名稱：降解黃曲霉毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解黃曲霉毒素的方法，特別是涉及一種利用Y射線輻照降解 黃曲霉毒素Bi的方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，簡稱為AF)，是對(duì)人類和動(dòng)物危害大的真菌毒素之一。 大量資料證實(shí)，黃曲霉毒素對(duì)人及動(dòng)物的肝臟組織有很強(qiáng)的毒害作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo) 致肝癌，甚至死亡。黃曲霉毒素污染食品比較嚴(yán)重，尤其是對(duì)花生、核桃、玉米及 其制品的污染最為嚴(yán)重和普遍。此外，在大豆、稻谷、通心粉、牛奶及其制品、食 用油等食品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。黃曲霉毒素不僅降低農(nóng)產(chǎn)品和飼料品質(zhì)，使 經(jīng)濟(jì)遭受巨大損失，還可通過污染或殘留黃曲霉毒素的肉、乳等動(dòng)物源性食品進(jìn)入 人體，對(duì)人類健康造成威脅。其中毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B, (C17H1206，分子量 312)，為氰化鉀的10倍，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示。(高橋治男；花生曲霉毒素 污染途徑與防除；花生科技，2000， 1: 37。)
(式I)
現(xiàn)有去除黃曲霉毒素的方法，主要分為物理化學(xué)法和生物化學(xué)法。其中，物理 化學(xué)去毒法對(duì)食品的色、香、味及營養(yǎng)成分如維生素或蛋白質(zhì)等均有不同程度的破 壞和不良影響。生物化學(xué)去毒法成本較高，很難在工業(yè)化水平制備高活性黃曲霉毒 素解毒活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種降解黃曲霉毒素的方法。
本發(fā)明提供的降解黃曲霉毒素的方法，是用Y射線輻照含有黃曲霉毒素的樣品。 該方法中，Y射線是由放射性物質(zhì)^Co產(chǎn)生的，輻照劑量為0-10kGy，但不包 括0;優(yōu)選2-10kGy，更優(yōu)選4-10kGy，尤其優(yōu)選6-10kGy，最優(yōu)選10kGy。上述含
有黃曲霉毒素的樣品為含有黃曲霉素的的農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制品，如食品或詞料等。該方法尤其適用于降解黃曲霉毒素Bp
本發(fā)明提供了一種利用輻照技術(shù)降解黃曲霉毒素的方法，該方法在去毒處理過 程中具有明顯的優(yōu)勢，既可殺死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不會(huì)產(chǎn) 生任何工業(yè)污染。


圖1為黃曲霉毒素BJ勺標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖2為黃曲霉毒素Bi的選擇離子色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
本發(fā)明各實(shí)施例中所用的儀器與試劑如下所示
Agilentll00液相系統(tǒng)(美國Agilent公司)；API3000三級(jí)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美 國應(yīng)用生物系統(tǒng))；FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；LD4-2 低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；Oasis HLB 固相萃取柱(3cc/60mg， Waters公司)；甲醇(色譜純Fisher);甲酸(分析純)； 正己垸(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氯化鈉；超純水。
黃曲霉毒素B!標(biāo)準(zhǔn)品10mg (購于美國Sigma-Aldrich公司，純度^97%);
黃曲霉菌Us/^^〃M/7avM)ATCC11498(購自美國菌種保藏中心ATCC， 11498 號(hào)菌株)。
本發(fā)明中所用分析檢測條件如下所示
1) 色譜條件
Agilentll00液相系統(tǒng)
G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動(dòng)進(jìn)樣器
色譜柱Agela Technologies Inc. VenusilASB-Cl8、柱內(nèi)徑x柱長2.1x150mm, 填料直徑5|im
流速200|il/min
流動(dòng)相甲醇水(甲酸的體積百分比濃度為0.1%) =7: 3 進(jìn)樣體積50^1;
2) 質(zhì)譜條件
API3000三級(jí)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)
掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，正離子分析模式 離子源Turbo Spray離子源 前級(jí)離子m/z二313.0， 二級(jí)離子m/z二241.1、 269.1參數(shù)設(shè)置
霧化氣(Nebulizer Gas， NEB):氮?dú)猓?0ml/min 窗簾氣(Curtain Gas, CUR):氮?dú)猓?2ml/min 電離電壓(Ionspray Voltage, IS) : 5500V 加熱溫度(Temperature, TEM) : 500°C 碰撞氣(Collision Gas, CAD):氮?dú)猓?ml/min 去集勞夷電壓(Declustering Potential, DP) : 70V 聚焦電壓(Focusing Potential, FP) : 300V 入口電壓(Entrance Potential, EP) 10V 碰撞能(CollisionEnergy, CE) : 45V
碰撞池出口電壓(Collision Cell Exit Potential, CXP) : 9V 。
第一部分、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
用甲醇將黃曲霉毒素B, (AFB。配制成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4"C避光保存。 用體積比為50: 50的甲醇與水的混合液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成O.l、 0.2、 0.5、 1、 2、 5、 10、 20、 50嗎/L的AFBi標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
2) 樣品的提取
稱取5g粉碎后的花生樣品于100ml離心管，加入50ml甲醇-水(6: 4) ， 5gNaCl， 20ml正己垸，搖勻，放入離心機(jī)中離心提取30min。提取后，用定量濾紙過濾，入 分液漏斗靜置分層，取5ml下層溶液待用。
3) 樣品的凈化
將OASIS HLB固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，加2ml甲醇活化，待甲醇 至OASIS小柱吸附劑上層時(shí)，再加2ml純水平衡小柱，然后加樣品過濾液5ml過柱， 流速為lml/min，加入3ml純水淋洗OASIS小柱兩次，后用2ml體積比為3: 7的甲 醇與水的混合液淋洗OASIS小柱以除去雜質(zhì)，用真空泵抽干。最后以lml甲醇洗脫， 洗脫液用純水定容至2ml，待分析。
4) 花生接種黃曲霉菌產(chǎn)毒培養(yǎng)
將黃曲霉菌ATCC11498接種于察氏培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基的具體配方為硝酸鈉 2g，磷酸氰二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂 15-20g，水1000ml) 12rC滅菌20min。斜面，溫度28。C，濕度50%，培養(yǎng)7天，待 斜面長滿黃綠色菌絲，菌絲上略生孢子時(shí)，用無菌水制成孢子懸浮液(107cfu/ml，其中cfu/ml為每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù))。將5g花生在紫外燈下照射 30min滅菌后，加入5ml無菌水(121°C， 20min)，然后加入孢子懸浮液lml。溫度 28°C，濕度50%，培養(yǎng)7天。 5)標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限
準(zhǔn)確吸取0.1 、0.2、 0.5、 1、2、 5、 10、20、50ng/LAFB!標(biāo)準(zhǔn)溶液50^1， HPLC-MS/MS
分析，得到黃曲霉毒素Bi峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖l所示。 該標(biāo)準(zhǔn)曲線為線性方程為y=10494x+3041.9。
按3倍信噪比計(jì)算，當(dāng)樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時(shí)，該樣品的濃 度即可作為最低檢測限。當(dāng)樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的IO倍時(shí)，該樣品的濃 度即可作為最低定量限。
由圖1可知，當(dāng)黃曲霉毒素Bi濃度為0.03嗎/kg時(shí)，S/N=3.2，故方法的最低檢 測限約為0.03pg/kg。當(dāng)黃曲霉毒素B!濃度為0.1pg/kg時(shí)，S/N=10.2，故方法的最低 定量限約為0.1嗎/kg 。
第二部分、Y射線輻照降解花生中的黃曲霉毒素及測定結(jié)果 本實(shí)施例提供的對(duì)花生中的黃曲霉毒素進(jìn)行降解的具體方法是 稱取5g染菌花生樣品，置于100ml聚丙烯離心管(材質(zhì)為99.9%生物級(jí)聚丙烯， 耐輻射)中密封，放入6QCoY射線輻射場(中國農(nóng)業(yè)輻照中心)內(nèi)進(jìn)行輻照處理，輻 照劑量分別設(shè)定為OkGy、 2kGy、 4 kGy、 6 kGy、 8kGy或10kGy。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。 之后按照下述步驟對(duì)上述輻照后的花生樣品進(jìn)行測定；
1) 提取
取輻照后的花生樣品離心管，加入50ml體積比為6: 4的甲醇與水的混合液， 5gNaCl， 20ml正己烷，搖勻，放入離心機(jī)中離心提取30min。提取后，用定量濾紙 過濾，入分液漏斗靜置分層，取5ml下層溶液待用。平行樣品2個(gè)。
2) 凈化
將OASIS HLB固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，加2ml甲醇活化，待甲醇 至OASIS小柱吸附劑上層時(shí)，再加2ml純水平衡小柱，然后加步驟l)得到的樣品 過濾液5ml過柱，流速為lml/min，加入3ml純水淋洗OASIS小柱兩次，后用2ml 體積比為3: 7的甲醇與水的混合液淋洗OASIS小柱以除去雜質(zhì)，用真空泵抽干。 最后以lml甲醇洗脫，洗脫液用純水定容至2ml，待分析。
3) 測定
分別注入50pL適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素Bj示準(zhǔn)溶液及樣品提取物溶液于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按照前述分析檢測條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。圖2為黃曲 霉毒素Bi的選擇離子色譜圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，利用外標(biāo)法 進(jìn)行定量分析。
將上述染菌花生樣品經(jīng)提取、凈化、進(jìn)LC-MS分析后，樣品中黃曲霉毒素B, 的峰面積，結(jié)合圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成樣品溶液的濃度，計(jì)算溶質(zhì)的質(zhì)量，再 除以稱取的花生的質(zhì)量，得到輻照降解后的折合濃度。降解率由不同Y射線吸收劑 量下的折合濃度與未輻照時(shí)的折合濃度相比得出。上述結(jié)果均列于表1中。另外， 已計(jì)算得到未輻照的染菌花生中黃曲霉毒素Bi的污染濃度為64pg/kg。上述計(jì)算數(shù) 據(jù)均為三次重復(fù)的平均值。
由表1可知，經(jīng)Y射線輻照后，黃曲霉毒素B,可達(dá)59.61%。我國GB2761-2005 《食品中真菌毒素限量》規(guī)定黃曲霉毒素B,的限量為〈20^ig/kg;而國際上關(guān)于總黃 曲霉毒素的含量一般都小于15pg/kg，對(duì)黃曲霉毒素Bi的限量要求更低?；ㄉ悬S曲 霉毒素B!的污染水平為6-400pg/kg，禾,本發(fā)明提供的Y射線輻照降解方法，在輻照 劑量為10kGy時(shí)，降解率可達(dá)59.61%，對(duì)出口貿(mào)易具有現(xiàn)實(shí)的利用價(jià)值。
表l、染菌花生中黃曲霉毒素B,的輻照降解
吸收劑量折合濃度 /)xg/kg降解率/0/。
0640
258.788.15
450.4421.18
639.9237.63
833.1848.15
1025.8559.61
權(quán)利要求
1、一種降解黃曲霉毒素的方法，是用γ射線輻照含有黃曲霉毒素的樣品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述Y射線是由放射性物質(zhì)6130) 產(chǎn)生的。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為0-10 kGy， 但不包括0。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為2-10kGy。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為4-10kGy。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為6-10kGy。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為10kGy。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l-7任一所述的方法，其特征在于所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒 素B!。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l-8任一所述的方法，其特征在于所述含有黃曲霉毒素的樣品為含有黃曲霉素的的農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制品。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述含有黃曲霉素的的農(nóng)產(chǎn)品或 農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制品為花生或花生制品。
全文摘要
本發(fā)明公開一種降解黃曲霉毒素的方法。該方法是用γ射線對(duì)含有黃曲霉毒素的樣品進(jìn)行輻照。其中，γ射線是由放射性物質(zhì)⁶⁰Co產(chǎn)生的，輻照劑量為0-10kGy，但不包括0；優(yōu)選2-10kGy，更優(yōu)選4-10kGy，尤其優(yōu)選6-10kGy，最優(yōu)選10kGy。上述含有黃曲霉毒素的樣品為含有黃曲霉素的農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制品，如食品或飼料等。該方法尤其適用于降解黃曲霉毒素B₁。該方法既可殺死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不會(huì)產(chǎn)生任何工業(yè)污染。
文檔編號(hào)A23L1/015GK101491310SQ200910078708
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者周洪杰, 哈益明, 李彥杰, 靜 楊, 鋒 王, 蓓 范 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所