專利名稱：：一種聯(lián)合檢測病原菌的通用型基因液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種聯(lián)合檢測病原菌的通用型基因液相芯片，尤其是針對可能當(dāng)做生物恐怖因子的烈性病原菌，例如炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌的快速聯(lián)合檢測的通用型液相芯片，本發(fā)明還涉及對上述基因液相芯片應(yīng)用中所用特異性探針、PCR反應(yīng)條件、聚合酶的改進。
背景技術(shù)：
：病原菌種類繁多。針對病原菌的檢測方法多種多樣，主要有傳統(tǒng)的細菌學(xué)分離培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法。經(jīng)典檢測技術(shù)分離培養(yǎng)、血清學(xué)凝集方法等，鑒定結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但耗時長，每次只能確定或排除一種病原細菌，難以滿足傳染病和生物恐怖事件防控快速反應(yīng)的技術(shù)需求。分子生物學(xué)方法包括PCR、核酸雜交等方法，可進行微量的核酸分析，但也存在一定的局限性，如很難實現(xiàn)微生物的高通量分析。片基式的基因芯片，可實現(xiàn)多病原檢測，但芯片制作需要規(guī)模化，若增加或調(diào)整病原檢測種類，需重新研制和制作芯片，受限于高成本和非通用性。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片、液態(tài)芯片(liquidarray,liquidchip),利用編碼孩"求作為反應(yīng)載體，同實現(xiàn)一個反應(yīng)體系中進行100種病原的同時檢測，時間短，通量大，可實現(xiàn)對生物恐怖樣本或傳染病病料多靶標(biāo)的同時'歸查。炭疽芽孢桿菌(5aci'〃usa/^/jracis)是急性傳染病炭疽的病原體，為粗大的革蘭陽性桿菌，具有強烈的致病性、傳染性和生存能力。鼠疫耶爾森菌(rers&iape^is)是嚴(yán)重危害人類健康的烈性傳染病鼠疫的病原體，革蘭氏陰性卵圓形桿菌。土拉弗朗西斯菌(尸r犯ciseDa"hrensis)是急性傳染病土拉菌病(土拉熱，兔熱病)的病原體，革蘭氏陰性球桿菌，致病力強，少數(shù)(10-50菌體)即可能致病。布魯菌(Srucei7a)是布魯菌病(brucellosic)的病原體，一組微小的球桿狀的革蘭氏陰性菌，自然界中抵抗力較強。類鼻疽博克霍爾德菌(Bi;rJ^oideriapseudo鵬iiei)是人獸共患病類鼻疽病的病原體，革蘭陰性桿菌，自然界中抵抗力較強。本發(fā)明以檢測炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌為例，提供一種廣譜聯(lián)合檢測病原菌的基因液相芯片，實現(xiàn)病原菌的多元化、高通量篩查，對于預(yù)防和控制跨境傳播傳染病的傳播、應(yīng)對生物恐怖、維護國家和人民生命健康安全具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于為人們提供一種開放性的能靈活增刪檢測病原細菌的懸浮芯片通用引物檢測體系，以期實現(xiàn)快速準(zhǔn)確的檢測。因此，除使用以上所述的16SrRNA基因通用引物對341a、519b夕卜，其他16SrRNA、23SrRNA或16S-23SrRNA的能對所有真細菌DNA進行擴增的通用引物對均可以用于建立通用型的檢測體系。1.根據(jù)上述目的，在進行PCR擴增時，采用16SrRNA、23SrRM或16S~23SrRNA通用引物進行擴增，且在下游引物標(biāo)記生物素。2.針對特定待檢細菌PCR擴增區(qū)域內(nèi)的可變區(qū)設(shè)計種或?qū)偬禺愋蕴结槪B接于具有唯一光諳地址的編碼微球。3.捕獲探針捕獲PCR產(chǎn)物以及檢測。本發(fā)明選擇炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌以及類鼻疽伯克霍爾德菌為病原菌或生物恐怖菌模型，以16SrRNA基因的V3可變區(qū)為靶標(biāo)設(shè)計炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌以及類鼻疽博克霍爾德菌種/屬特異性探針。特異性探針可參見表l。這些探針可以分別與不同編號的編碼^f鼓球偶聯(lián)，制備出可對上述多種細菌同時進行^r測的懸浮芯片；選"t奪細菌通用引物341a,519b(參見表l)，其中下游引物519b5，端生物素修飾，該對通用引物作為該體系的檢測引物；在應(yīng)用時，使用上述引物對待檢樣本提取的DNA進行擴增，使擴增的PCR產(chǎn)物帶上生物素標(biāo)記，然后再將此PCR產(chǎn)物與上述的微球體系混合，使擴增的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與微球上的相應(yīng)探針進行雜交從而被微球捕獲，然后再與鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)反應(yīng)，5通過Bio-Plex才全測系統(tǒng)或者美國luminex/>司的Luminex200，Lurainex100ISSystem進行檢測，實現(xiàn)對上述一至五種/屬細菌的一次性檢測；增加針對其他菌的探針偶聯(lián)的微球，可實現(xiàn)更多種/屬細菌的檢測。表1、檢測通用引物以及探針序列細菌通用引物以及針對炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌以及類鼻疽伯克霍爾德菌的屬特異或種特異性探針<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>因此，本發(fā)明所述的聯(lián)合檢測基因液相芯片包括通用引物、PCR反應(yīng)體系，編碼微球，捕獲探針，鏈親和素—藻紅蛋白(即SA-PE)。本發(fā)明所述的改進了的PCR反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、上下游引物、dNTP、鎂離子。其中，本發(fā)明人對PCR反應(yīng)體系中的聚合酶進行了篩選，本領(lǐng)域中普遍使用的聚合酶是由工程菌大腸桿菌進行表達然后進行提取的，在提取的時候可混有少量的大腸桿菌DNA,而本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系采用細菌通用引物，因此大腸桿菌DNA也可以被擴增，從而使陰性對照也出現(xiàn)擴增條帶。我們篩選的結(jié)果是高保真酶，例如寶生物的premixTaq酶，，它可以滿足擴增需要且陰性對照不出J見擴增條帶。本發(fā)明的基因液相芯片中，所用的微球是Luminex的熒光編碼微球，這些直徑約5.6Mm乳膠微球是由聚苯乙烯制成的大小均一的圓形微球，在其制作過程中按照嚴(yán)格比例摻入2種熒光染料，每種染料又有10個濃度梯度，因而根據(jù)其搭配比例不同可以將微球按照其顏色分為100種，使得每個球形基質(zhì)都有獨特的光譜地址。本發(fā)明基因懸浮芯片中，所用的捕獲探針為本發(fā)明人根據(jù)上述五種/屬細菌的基因序列設(shè)計的探針(見表l),并在5，端連接上15-M個T,作為與微球偶聯(lián)的臂。本發(fā)明的基因懸浮芯片中，所述的鏈親和素藻紅蛋白即為一種熒光蛋白，上面的親和素可以和微球上捕獲的PCR產(chǎn)物的生物素進行結(jié)合。本發(fā)明還提供上述通用型基因懸浮芯片的制備方法，該方法包括1、通用體系PCR擴增，2、捕獲探針與微球偶聯(lián)。通用型PCR擴增體系本發(fā)明的PCR反應(yīng)總體系為Taq酶15-30|al,引物341a與引物519b(lOpmol/L)各O.1-5jliL,DNA才莫4反1—5juL，ddH20補足50juL。本發(fā)明優(yōu)選的PCR反應(yīng)總體系為Taq酶25jal，引物341a與引物519b(1Ojumol/L)各2juL,DNA才莫板2iaL,ddH20補足50iuL。本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)條件如下94°C10分鐘(即min);94°C30秒(即s),58°C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72。C延伸7min。在確定以上的反應(yīng)體系時，本發(fā)明人進行了反應(yīng)溫度的優(yōu)化，上述反應(yīng)溫度可以例如是50°C、52°C、54°C、56°C、58°C、60°C。經(jīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)1°/的瓊脂糖凝膠電泳檢查，本發(fā)明的反應(yīng)溫度優(yōu)選在50-58。C的范圍內(nèi)，均可以得到較亮的擴增條帶；更優(yōu)選的溫度是54-60°C,最優(yōu)選為58°C。捕獲探針與微球的偶聯(lián)分別選取不同編號的編碼;微球，例如044，031,028，046,033號的編碼微球，洗滌；活化；分別加入芽孢桿菌屬的探針、耶爾森菌屬的探針、布魯菌的探針、弗朗西斯菌屬的探針、伯克霍爾德菌屬的探針，混勻，室溫下，用漩渦振蕩器以200-400rpm的轉(zhuǎn)速孵育30-90min;用PBST洗滌1-2次；用0.1%的SDS洗滌1-2次；得到檢測芽孢桿菌屬的偶聯(lián)微球、檢測耶爾森菌屬的偶聯(lián)微球、檢測布魯菌的偶聯(lián)微球、檢測弗朗西斯菌屬的偶聯(lián)微球、檢測伯克霍爾德菌屬的偶聯(lián)微球；計數(shù)每種微球的單位體積數(shù)，確定濃度，分別于4'C下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合的微球。7捕獲探針的設(shè)計本發(fā)明為了達到同時檢測多種病原菌，對所用探針的設(shè)計進行了大量的研究和摸索，其中采用本領(lǐng)域常規(guī)定分子生物學(xué)軟件DNAStar。在探針設(shè)計的方法中，包括下列具體步驟從NCBI網(wǎng)站下載相關(guān)的基因序列并保存。使用DNASTAR的EditSeq子程序，將下載基因序列格式轉(zhuǎn)換成*.seq文件，然后^f吏用MegAlign子程序，將所有氣seq文件調(diào)入MegAlign。使用"Align"中的"ByClustalMethod"命令將待比較分析的序列對齊，隨后進一步選取其差異序列，設(shè)計出種屬特異性的探針。將得到的探針提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，最終針對每種靶標(biāo)細菌確定位于V3可變區(qū)內(nèi)的特異性最好的探針。本發(fā)明的基因懸浮芯片也適用于炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌五種檢測因子以外的細菌的檢測，下載待檢測因子的16SrRNA基因序列，保存到本地磁盤中。具體步驟例如下面所述步驟1.下載其同屬以及其他環(huán)境常見以及臨床常見菌的16SrRNA基因序列，保存到本地^磁盤中。2.使用DNASTAR的EditSeq子程序，將下載基因序列格式轉(zhuǎn)換成*.seq文件。3.使用MegAlign子程序，將所有、seq文件調(diào)入MegAlign。使用"A1ign"中的"ByClustalMethod"命令將待比較分析的序列對齊，選取其差異序列設(shè)計種屬特異性的探針。4.將設(shè)計好的探針提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。5.最終針對待檢測的靶標(biāo)細菌確定位于V3可變區(qū)內(nèi)的特異性最好的探針。6.同上面檢測探針與微球的偶聯(lián)，選擇某一編號微球與探針偶聯(lián)。7.同上進行偶聯(lián)微球的質(zhì)控。8.才艮據(jù)檢測目的，混合不同編號的偶聯(lián)孩l球。9.樣品提取核酸，同上面進行PCR反應(yīng)。10.PCR產(chǎn)物的捕獲并^r測。圖1為土拉弗朗西斯菌的DNA濃度-熒光強度曲線；圖2為布魯菌(M5林)的DNA濃度-熒光強度曲線；圖3為炭疽芽孢桿菌的DNA濃度-熒光強度曲線；圖4為類鼻疽伯克霍爾德菌的DNA濃度-熒光強度曲線；圖5為鼠疫耶爾森菌(EV76株)的DM濃度-熒光強度曲線；圖6為對耙因子任意四種組合以及五種組合的復(fù)合才企測結(jié)果示意圖。圖1-圖5中的X軸表示被檢測菌的DNA濃度，Y軸表示檢測熒光信號MFI。圖6中的X軸表示檢測樣品，Y軸表示檢測微球，Z軸表示檢測熒光信號MFI。圖6中B(b1ank):PCR的空白對照估文為才企測樣本進行凈企測；XI:炭疽芽孢桿菌+鼠疫耶爾森菌+布魯菌+土拉弗朗西斯菌；X2:炭疽芽孢桿菌+鼠疫耶爾森菌+布魯菌+類鼻疽伯克霍爾德菌；X3:炭疽芽孢桿菌+鼠疫耶爾森菌+土拉弗朗西斯菌+類鼻疽伯克霍爾德菌；X4:炭疽芽孢桿菌+布魯菌+土拉弗朗西斯菌+類鼻疽伯克霍爾德菌；X5:鼠疫耶爾森菌+布魯菌+土拉弗朗西斯菌+類鼻疽伯克霍爾德菌；X6:炭疽芽孢桿菌+鼠疫耶爾森菌+布魯氏菌+土拉弗朗西斯菌+類鼻疽伯克霍爾德菌。具體實施例方式實施例l:通用引物體系的一般性PCR擴增方法1.利用常規(guī)方法提取待測樣品或細菌的DNA作為模板；2.按照PCR反應(yīng)總體系為50juL量分別加入引物341a與引物519b(10jumol/L)各2iiL,Taq酶25jul，DNA才莫4反2iaL,ddH20補足50iaL;3.按照如下PCR反應(yīng)條件進行擴增94°ClOmin;94°C30s，58°C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72。C延伸7min;4.得到PCR產(chǎn)物，待檢。實施例2:捕獲探針與微球偶聯(lián)1.分別選取不同編號編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻。2.分別取上述微球大約1.25xl(T個，分別轉(zhuǎn)移至離心管，14000g離心3-5Min,小心吸出上清。3.加入50ul0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20-30S，超聲20-30s，使微球重懸。4.用蒸餾水將合成的寡核苷S吏探針稀釋到0.lmmol/L。5.將lul稀釋的待偶聯(lián)的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻。6.加入2.5ul新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至孩U求與4笨針混和液中，4展蕩混勻。7.用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫孵育30min。8.再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC。9.再次在漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫避光孵育30min。10.用0.02%PBSTlml洗滌l次，離心14000g3-5min.11.移棄上清，微球重懸于lml0.ly。SDS中，洗滌，離心。12.移棄上清，微球重懸于100ulpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。13.用血球計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的單位濃度。14.把偶聯(lián)好的待檢微球放在4。C避光保存，一般將每種探針偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇要混合的微球種類。實施例3:捕獲探針捕獲待檢測的PCR產(chǎn)物1.取已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，使其總量為33H1(根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應(yīng)加入量)2.向各管中加5~17ul五種細菌混合模板的PCR產(chǎn)物4吏其終體積為50ul，吹打混勻。3.95。C變性10min。4.雜交溫度下雜交一定時間。5.轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。6.再向各孔加75ul4ng八i1SA-PE的1xTMAC液，室溫避光孵育10min，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。7.再向各孔加入75ullxTMAC溶液，振蕩佳J效球重懸。8.反應(yīng)結(jié)束后上纟幾檢測。實施例4:對炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌三種病原菌的檢測1.利用通用引物體系對待測炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌三種病原菌的DM模板進行PCR擴增，具體方法如實施例l;得到PCR產(chǎn)物待檢。2.分別選取044，031,046號編碼樣"求，洗滌；活化；分別加入芽孢桿菌屬的探針、耶爾森菌屬的探針、弗朗西斯菌屬的探針與微球偶聯(lián)，具體方法如實施例2。3.取044，031，046號編碼微球已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，總量為33jal，加17ul五種細菌混合模板的PCR產(chǎn)物，其終體積為50ul，吹打混勻，變性，雜交，使捕獲探針捕獲待檢測的PCR產(chǎn)物，清洗，加入SA-PE，反應(yīng)后上枳4企測，具體方法如實施例3。4.利用同一檢測體系，樣品中同時含有炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌能夠同時檢出。并且針對單一檢測對象如炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌的檢測靈壽丈度分別為2.6pg、2.6pg、(U7pgDNA。實施例5:對炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌五種病原菌的檢測1.利用通用引物體系對待測樣品或細菌的DNA模板進行PCR擴增，具體方法如實施例1;得到PCR產(chǎn)物待檢。2.分別選取044,031，028，046，033號編碼《敬J求，洗滌；活化；分別加入芽孢桿菌屬的探針、耶爾森菌屬的探針、布魯菌的探針、弗朗西斯菌屬的探針、伯克霍爾德菌屬的探針，與微球偶聯(lián)，具體方法如實施例2。3.取044，031，028，046,033號編碼微球已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，總量為33ul，加17ul五種細菌混合才莫^1的PCR產(chǎn)物，其終體積為50ul，吹打混勻，變性，雜交，使捕獲探針捕獲待枱r測的PCR產(chǎn)物，清洗，加入SA-PE，反應(yīng)后上機檢測，具體方法如實施例ii3。4.以復(fù)合體系對7抹炭疽芽孢桿菌，4抹鼠疫菌，5林布魯菌，2抹土拉弗朗西斯菌，2抹類鼻疽伯克霍爾德菌進行檢測，結(jié)果均為陽性。以復(fù)合體系對29林非目的菌進行檢測，近緣的蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌與炭疽菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)；近緣的假結(jié)核耶爾森菌與鼠疫菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)；鼻疽博客霍爾德爾菌與類鼻疽伯克霍爾德菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)；其余環(huán)境常見菌抹或腸道細菌如大腸菌、沙門菌、志賀菌、變形桿菌、弧菌、氣單胞菌、葡萄球菌等檢測均為陰性。利用通用引物體系，樣品中含有炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌五種病原菌中的一種、兩種、三種、四種或五種，均能4全出，可以實現(xiàn)多種細菌的聯(lián)合檢測。該復(fù)合體系對炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌、布魯菌和類鼻疽菌的檢測限分別為14pg、2.2pg、0.2pg、40pg、0.8pgDNA。實施例6:檢測上述五種檢測生物恐怖菌以外的細菌的通用檢測方法1.下載待檢測因子的16SrRNA基因序列，保存到本地磁盤中。2.下載其同屬以及其他環(huán)境常見以及臨床常見菌的16SrRNA基因序列，保存到本地磁盤中。3.使用DNASTAR的EditSeq子程序，將下載基因序列格式轉(zhuǎn)換成*.seq文件。4.使用MegAlign子程序，將所有沐.seq文件調(diào)入MegAlign。4吏用"A1ign"中的"ByClustalMethod"命令將待比較分析的序列對齊，選取其差異序列設(shè)計種屬特異性的探針。5.將設(shè)計好的探針提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。6.最終針對待檢測的靶標(biāo)細菌確定位于V3可變區(qū)內(nèi)的特異性最好的探針。7.同上面檢測探針與微球的偶聯(lián)，選擇某一編號微球(注體系內(nèi)探針不能使用同一編號的微球進行偶聯(lián)，一個檢測因子必須使用一個編號的微球)與探針偶聯(lián)。8.同上進行偶聯(lián)^f敫球的質(zhì)控。9.根據(jù)檢測目的，混合不同編號的偶4關(guān)微球。10.樣品^是取核酸，同上面進行PCR反應(yīng)。11.PCR產(chǎn)物的捕獲>^測同上。實施例7:對生物恐怖菌的一般性定量檢測待檢目的菌核酸系列稀釋，一般設(shè)6個以上稀釋度，同上面的PCR程序和反應(yīng)條件進行PCR反應(yīng)，同上面的反應(yīng)進行PCR產(chǎn)物的檢測，根據(jù)沖企測結(jié)果，運用Bio-PlexVersion4.0分析系統(tǒng)提供的方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各個待測樣品的MFI值，即可實現(xiàn)待4全樣品核酸的定量分析。如鼠疫耶爾森菌DNA,系列稀釋至濃度范圍O.03pg-30ng,同上進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物同上進行方法檢測，Bio-plex4.O分析結(jié)果得出擬合曲線，曲線方程為FI=5.04464+(9953,98-5.04464)/((l+(Cone/1.29718)A-0.511995))A10，L0D值為2,6pg/反應(yīng)體系，相當(dāng)于490cfu/test。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明的優(yōu)點1，開放性，靈活性本發(fā)明的檢測體系是由一系列偶聯(lián)上探針的微球組成，使用時候可根據(jù)檢測需要，自由的選擇微球進行組合，從而實現(xiàn)個體化的檢測；另外，用戶還可根據(jù)自身的檢測需求，設(shè)計探針，偶聯(lián)微球后進行檢測。2，靈敏較之于普通的PCR反應(yīng)，本發(fā)明具有較高的檢測靈敏度，隨不同的細菌，靈敏度從0.17-18.5pg。本發(fā)明靈敏度的提高從以下兩個方面體現(xiàn)1)檢測儀器存在信號的放大系統(tǒng)；2)PCR產(chǎn)物帶上的生物素與親和素化的熒光染料藻紅蛋白中的親和素結(jié)合的放大作用。3，檢測通量大，適用于微量樣品的多靶標(biāo)檢測本發(fā)明通過一管PCR反應(yīng)，一個孔就可同時對多耙標(biāo)進行檢測，根據(jù)編碼微球的種類，理論上可以實現(xiàn)100種不同革巴標(biāo)的^r測。4,可定量結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，可實現(xiàn)對不同靶標(biāo)的定量4企測。5，穩(wěn)定性各探針檢測變異系數(shù)值在5.18%—17.88%,檢測性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠，具有可重復(fù)性。權(quán)利要求1、一種聯(lián)合檢測病原菌的通用型基因液相芯片，其中所述檢測芯片包括PCR反應(yīng)體系，微球，捕獲探針，鏈親和素-藻紅蛋白。2、權(quán)利要求l所述的基因液相芯片，其中所述PCR反應(yīng)體系中使用的聚合酶為高保真酶。3、權(quán)利要求l所述的基因液相芯片，其中所述病原菌可以包括炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯氏菌和類鼻疽博克霍爾德菌中的一種或多種，也可以包括其它致病菌。4、權(quán)利要求1所述的基因液相芯片，其中所涉及的通用引物包括16SrRNA基因通用引物對341a、519b,以及其他16SrRNA、23SrRNA或16S-23SrRNA基因能對所有細菌DNA進行擴增的通用引物對。5、權(quán)利要求4所述的基因液相芯片，其中所述細菌通用引物以及針對炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌以及類鼻疽伯克霍爾德菌的屬特異或種特異性探針如下名稱序列(5，-3，)長度(nt)GC(%)341aCCTACGGGAGGCAGCAGT1866.7519bATTACCGCGGC(T/G)GCTG1665.6B.aAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCAC2544BruGGAGAAGATAATGACGGTAACCCGA2548B.pAATCATTCTGGCTAATACCCGGAGT2544F.tGCCTCAAGGTTAATAGCCTTGGGGA2552Y.pAAGGGGTTGAGTTTAATACGCTCAA25406、權(quán)利要求1-5任一項所述的基因液相芯片，其中所述PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)溫度為50-60°C。7、權(quán)利要求6所述的基因液相芯片，其中所述DNA雜交溫度為45-65°C。8、權(quán)利要求l所述的基因懸浮芯片，其中，捕獲探針的獲得包括以下步驟從NCBI網(wǎng)站下載相關(guān)的基因序列并保存，使用DNASTAR的EditSeq子程序，將下載基因序列格式轉(zhuǎn)換成*.seq文件，然后使用MegAlign子程序，將所有*.seq文件調(diào)入MegAlign，使用"Align"中的"ByClustalMethod"命令將待比較分析的序列對齊，隨后進一步選取其差異序列，設(shè)計出種屬特異性的探針，將得到的探針提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，最終針對每種靶標(biāo)細菌確定位于V3可變區(qū)內(nèi)的特異性最好的探針。9、權(quán)利要求l所述的基因懸浮芯片，其中通用引物體系的一般性PCR擴增方法包括(1)提取待測樣品或細菌的DNA作為模板；(2)按照PCR反應(yīng)體系為按比例分別加入引物341a與引物519b(10|amol/L),Taq酶，DNA模板，ddH20補足；(3)按照PCR反應(yīng)條件進行擴增。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測生物恐怖細菌的通用檢測懸浮芯片，其中還涉及對優(yōu)化改進的懸浮芯片PCR反應(yīng)體系，特異性探針的設(shè)計。本發(fā)明具有開放性、靈活性、靈敏度高、檢測通量大、適用于微量樣品的多靶標(biāo)檢測等優(yōu)點。文檔編號C12R1/01GK101560559SQ20091007881公開日2009年10月21日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者劉衡川,孫肖紅,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院