專利名稱：：一種改進(jìn)的檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
：液相芯片檢測(cè)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生IOO種不同比例顏色，作為IOO種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5.5jum,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。炭疽芽孢桿菌(5acil〗usanthracis)是急性傳染病炭疽的病原體，為粗大的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有強(qiáng)烈的致病性、傳染性和生存能力。人類可以通過(guò)直接或間接接觸炭疽桿菌引起皮膚、肺和腸道感染，導(dǎo)致皮膚炭疽、肺炭疽和腸道炭疽病。炭疽桿菌有兩個(gè)毒素相關(guān)質(zhì)粒，即編碼炭疽毒素的pXOl質(zhì)粒(181kb)和編碼莢膜合成酶的pX02質(zhì)粒(96kb)。pXOl和pX02對(duì)毒性是必須的，失去任何一個(gè)質(zhì)粒都將減弱毒性或使其變?yōu)闊o(wú)毒抹。炭疽桿菌的致病力主要取決于產(chǎn)生莢膜和毒素的能力。目前，炭疽芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要是靠涂片顯微鏡檢查、培養(yǎng)性狀、噬菌體試驗(yàn)等，這些方法用于檢出非臨床樣品耗時(shí)長(zhǎng)，而且要具備相應(yīng)的技術(shù)素質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯片可以用于病原體炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行4企測(cè)的方法。經(jīng)過(guò)深入和大量的研究和實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明以pX02和染色體上的特異基因?yàn)榘行蛄?，建立了炭疽芽孢桿菌液相芯片和檢測(cè)方法，為炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)提供一條可行的途徑。本發(fā)明所述的基因液相芯片包括微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素一藻紅蛋白，該基因液相芯片可檢測(cè)炭疽芽孢桿菌。本發(fā)明還涉及上述可檢測(cè)檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素一藻紅蛋白，其中(1)PCR反應(yīng)體系包括:10xPCR緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶。(2)引物包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中，下游引物是5'生物素標(biāo)記的BA-l-R,BA-2-R，具體是，BA-1-R:5，-生物素-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGGBA-2-R:5，-生物素-TTACCCAACATCATCTTCGCA(3)捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上面所述探針在合成時(shí)在5，端進(jìn)行氨基修飾，并且連接15-2G個(gè)T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進(jìn)行偶聯(lián)。(4)微球，一般選擇熒光編碼的微球，例如來(lái)源于Luminex或其他代理公司的任何編號(hào)的微球，特異性探針與熒光編碼微球偶聯(lián)形成檢測(cè)微球，由此構(gòu)成檢測(cè)芯片。(5)鏈親和素-藻紅蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，SA-PE)為一種熒光蛋白，能被液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)中的綠色激光激發(fā)發(fā)光，由此可以進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。本發(fā)明涉及上述基因液相芯片的制備方法，該方法包括1.選取編碼微球，取適量如約1.25xl()6個(gè)于離心管內(nèi)，離心棄上清后，加入0.ltnol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液使之重懸；2.用蒸餾水將合成的寡核苦酸探針(即捕獲探針1和2)稀釋，分別加至兩種微球懸浮液中，振蕩混勻；3.力口入10mg/mL的EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylami卿ropyl]carbodiimidehydrochloride)溶液至孩O求與才笨針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育30分鐘；4.用0.02%PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述微球重懸于lml0.1%SDS(即十二烷基磺酸鈉)中，洗滌，離心；5.移棄上清液，微球重懸于100npH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯(lián)好的檢測(cè)微球，即本發(fā)明的基因液相芯片。4。C避光保存。另一方面，本發(fā)明還涉及上述炭疽芽孢桿菌檢測(cè)基因液相芯片的檢測(cè)方法，該方法包括樣本核酸的提取，PCR擴(kuò)增，4全測(cè)病原體。本發(fā)明對(duì)上述三個(gè)步驟的操作和條件進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化。樣本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。具體如下1)向每管樣本中加入6mol/LNal，振蕩混勻，煮沸；2)離心，轉(zhuǎn)上清液至另一含20°/。玻璃粉液的離心管中；3)充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分鐘離心，小心傾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75%乙醇1m1，充分混勻，離心，小心傾去上清液；5)重復(fù)步驟(4),然后置于37。C恒溫箱內(nèi)干燥；6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加2(VlTE,充分混勻，65°C加熱，離心，回收上清液備用。PCR擴(kuò)增以上述核酸提取步驟中制備的上清液作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件PCR體系10xPCR緩沖液3EHTaqDNA聚合酶0.3EEdNTPs:0.311上游引物0.311下游引物0.311模板DNA:2m雙蒸水ddH20:補(bǔ)足30n反應(yīng)條件預(yù)變性94-96°C10分鐘35個(gè)循環(huán)94-96°C30-40秒55-58°C30-40秒72。C30-40秒延伸72°C4-7分鐘同時(shí)，PCR空白對(duì)照品為如下10xPCR緩沖液3raTaq酶0.3ndNTPs:0.311上游引物0.311下游引物0.311雙蒸水(1朋20:4卜足30ni反應(yīng)結(jié)束后以w的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增情況。4企測(cè)方法1)取上述兩種偶聯(lián)微球混合，裝于PCR管中，根據(jù)微球計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)加入量，使每種微球的量相同，每次反應(yīng)每種3000-5000個(gè);2)向各管中加5-17n上面的PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，混勻；3)95。C變性10分鐘；隨后456(TC反應(yīng)10-30分鐘；4)離心或抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物；5)再向各孔加SA-PE,室溫避光孵育，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE;6)再向各孔加入75I1TE懸浮液，振蕩使微球重懸；7)反應(yīng)結(jié)束后上L麗INEX檢測(cè)儀器進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)。例如使用Bio-plex檢測(cè)設(shè)備，通過(guò)紅、綠兩束激光檢測(cè)，紅色激光激發(fā)微球基質(zhì)的染料從而對(duì)微球編號(hào)進(jìn)行識(shí)別，綠色激光對(duì)結(jié)合體的焚光蛋白進(jìn)行識(shí)別，實(shí)現(xiàn)捕獲探針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。圖1:用探針1檢測(cè)炭疽芽孢桿菌核酸的劑量-反應(yīng)曲線，即模板面A的量與發(fā)生反應(yīng)的熒光信號(hào)值MFI之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系；橫軸代表PCR反應(yīng)體系中模板DNA的濃度(fg/test),縱軸代表熒光信號(hào)值MFI。圖2:用探針2檢測(cè)炭疽芽孢桿菌核酸的劑量-反應(yīng)曲線；橫軸代表PCR反應(yīng)體系中模板DNA的濃度(fg/test),縱軸代表焚光信號(hào)值MFI。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l、基因液相芯片的制備1.選取編碼微球，如044，042號(hào)，取約1.25xl()6個(gè)置于離心管，14000g下離心，例如離心3-5分鐘，小心吸出上清液；2.加入50EH0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩混勻。3.用蒸餾水將合成的寡核苷S臾探針稀釋到0.lmmol/L;將in稀釋的探針1和2分別加于044,042號(hào)微球懸浮液中，振蕩混勻。4.加入2.5D1新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至孩O求與揮:針混和液中，振蕩，室溫孵育30分鐘。5.用0.02%PBSTlml洗滌1次，離心14000g3-5分鐘。6.移棄上清液，微球重懸于lml0.ly。SDS中，洗滌，離心。7.移棄上清液，微球重懸于100npH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測(cè)微球。8.用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的單位濃度。9.把偶聯(lián)好的檢測(cè)微球放在4'C避光保存，一般每種探針偶聯(lián)的微球單獨(dú)保存，使用時(shí)，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目選擇要混合的微球種類。實(shí)施例2、樣本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。具體如下1)向每管樣本中加入6mol/LNallOOjal,4展蕩混勻，煮沸30分鐘。2)將上述煮沸處理的樣本于10000r/分鐘離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)至另一含20%玻璃粉液的離心管中。3)充分混勻，置室溫10分鐘，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。4)向玻璃粉DNA沉淀中加入75y。乙醇lml,充分混勻，洗滌玻璃4分，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。5)重復(fù)清洗一次后，放置于37'C恒溫箱使徹底干燥。6)向上述晾干的玻璃4分-DNA沉淀中加20plTE,充分混勻，65。C加熱15分鐘。8000r/分鐘離心2分鐘，回收上清液備用。實(shí)施例3、PCR擴(kuò)增以回收的上清液作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件PCR體系10xPCR緩沖液Taq酶o.3rndNTPs:o.3ra上游引物o.3ra下游引物o.3ra模板腿2n雙蒸水(1犯20:補(bǔ)足3ora反應(yīng)條件預(yù)變性94°C35個(gè)循環(huán)94°C58°C72°C延伸72°C10分鐘30秒30秒40秒7分鐘同時(shí)設(shè)置PCR空白對(duì)照，如下:10xPCR緩沖液Taq酶dNTPs:上游引物下游引物雙蒸水(1朋20:3no.3n0.3EH0.3D1o.3rn補(bǔ)足3oni反應(yīng)結(jié)束后以i%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增情況(實(shí)施例4、檢測(cè)1.取偶聯(lián)微球042,044號(hào)各5000個(gè)混合，分裝于PCR管中(根據(jù)微球計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)加入量)2.向各管中加5~1711上面的PCR產(chǎn)物-使其終體積為50n。3.95。C變性10分鐘。4.4560。C反應(yīng)10-30分鐘。5.轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。6.再向各孔加75ni4ng/mSA-PE，室溫避光孵育10分鐘，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。7.再向各孔加入75EE懸浮液，振蕩使微球重懸。8.反應(yīng)結(jié)束后上枳^險(xiǎn)測(cè)。9.Bio-plex檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)紅、綠兩束激光檢測(cè)，紅色激光激發(fā)微球基質(zhì)的染料從而對(duì)微球編號(hào)進(jìn)行識(shí)別，綠色微球?qū)Ρ砻娼Y(jié)合的熒光染料進(jìn)行識(shí)別，實(shí)現(xiàn)捕獲探針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。在檢測(cè)時(shí)，同時(shí)以PCR陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)做為檢測(cè)本底。對(duì)于每個(gè)檢測(cè)體系和檢測(cè)本底，儀器輸出的數(shù)據(jù)是相應(yīng)反應(yīng)體系內(nèi)一種編號(hào)微球群的熒光強(qiáng)度中位值(MedianFluorescenceIntensity,MFI),亦即讀取的這種編號(hào)的微球群(100個(gè)或以上)的每個(gè)微球信號(hào)強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)平均值。結(jié)果判斷當(dāng)待檢測(cè)樣本孔的MFI值為本次檢測(cè)背景信號(hào)強(qiáng)度三倍以上時(shí)即判為陽(yáng)性。實(shí)施例5、定量檢測(cè)提取炭疽芽孢桿菌的基因組DNA,利用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度，進(jìn)行系列稀釋，PCR擴(kuò)增后，同上面檢測(cè)步驟進(jìn)行檢觀'J，Bio-PlexVersion4.0分析，擬合出劑量-反應(yīng)曲線和曲線方程。樣本4全測(cè)值代入方程實(shí)現(xiàn)定量4全測(cè)。結(jié)果針對(duì)炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)，本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了位于染色體和質(zhì)粒的兩條探針進(jìn)行檢測(cè)，即探針1和探針2。炭疽芽孢桿菌強(qiáng)毒株17003-10基因組DNA測(cè)定濃度后進(jìn)行10倍系列稀釋，16fg160ng,按上述確定的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，擬合曲線，得出曲線方程探針l的曲線方程FI=-9.77647+(1527.96+9,77647)/[(1+(Conc/1.23743E+006)—'.關(guān)T'"45";探針2的曲線方程FI=-5.51506+(3841.16+5.51506)/[(1+(Conc/280994)-"腦)]1，2。從標(biāo)準(zhǔn)曲線推算檢出限，PCR反應(yīng)管中模板濃度為30pg/test時(shí)，探針1信號(hào)陽(yáng)性；PCR反應(yīng)管中模板濃度為17pg/test時(shí)，探針2信號(hào)陽(yáng)性。因此，對(duì)質(zhì)粒pX02陽(yáng)性的炭疽芽孢桿菌強(qiáng)毒林，本體系的檢出限為30pg/test;而對(duì)于質(zhì)粒pX02陰性才朱,檢出限為17pg/test。從上述結(jié)果可以得出，本發(fā)明的懸浮芯片和檢測(cè)方法具有以下優(yōu)越性1.靈敏較之于普通的多重PCR反應(yīng)，本發(fā)明的靈敏度提高從以下兩個(gè)方面體現(xiàn)1)檢測(cè)儀器存在信號(hào)的放大系統(tǒng)；2)PCR產(chǎn)物帶上的生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結(jié)合的放大作用。2.特異采用核酸探針技術(shù)對(duì)標(biāo)記上生物素的PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性的識(shí)別，而非傳統(tǒng)的電泳方法通過(guò)PCR產(chǎn)物片段大小進(jìn)行識(shí)別。3.準(zhǔn)確高效整合核酸體外擴(kuò)增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素標(biāo)記、熒光檢測(cè)和流式細(xì)胞技術(shù)于一體，同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸樣品的纟企測(cè)、鑒定，使結(jié)果準(zhǔn)確，工作高效。4.芯片制作方便只用設(shè)計(jì)好待檢目標(biāo)菌的引物，優(yōu)化PCR條件，標(biāo)記對(duì)應(yīng)的探針于編碼微球，即可組裝成檢測(cè)體系。6、可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，待檢目標(biāo)靈活可調(diào)可根據(jù)不同檢測(cè)目標(biāo)，選擇對(duì)應(yīng)的引物和孩i球，組成不同目標(biāo)組合的才全測(cè)體系。序列表<110>中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院<120>—種改進(jìn)的檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片及其制備方法和應(yīng)用<130>五種生物恐怖細(xì)菌基因懸浮芯片多重檢測(cè)方法的建立<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>上游引物-1<400>1tggacgcatacgagacataat21<210>2<211>22<212>DNA<213>上游引物-2<400>2tttcataatcatggatttcccg22<210>3<211>20<212>DNA<213>下游引物-1<400>3tgctttagcggtagcagagg20<210>4<211>21<212>DNA<213>下游引物-2<400>4ttaCCC33C3tC3tCttCgC3<210>5<211>23<212>DNA<213>探針-1<400>5gaagaacgcaggcttagattggt<210>6<211>23<212>DNA<213>探針-2<400>6ctcgctttcatcgcatttctccc權(quán)利要求1.一種檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白。2.權(quán)利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括BA+FTGGACGCATACGAGACATAATBA-1-RTGCTTTAGCGGTAGCAGAGGBA-2-FTTTCATAATCATGGATTTCCCGBA-2-RTTACCCAACATCATCTTCGCA下游引物5，端經(jīng)生物素標(biāo)記BA-1-R:5，-生物素-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG;BA-2-R:5，-生物素-TTACCCAACATCATCTTCGCA。3.權(quán)利要求1所述的基因液相芯片，其中所述捕獲探針選自探針探針序列(5'-3')名稱BA-1GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGTBA-2CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC上面所述探針在合成時(shí)在5，端進(jìn)行氨基修飾，并且連接15-20個(gè)T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進(jìn)行偶聯(lián)。4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的基因液相芯片的方法，該方法包括1)選取編碼微球，取適量如約1.25xl()6個(gè)于離心管內(nèi)，離心棄上清后，加入0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙石黃酸溶液4吏之重懸；2)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針，即捕獲探針1和2稀釋，分別加至兩種微球懸浮液中，振蕩混勻；3)加入10mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育30分鐘；4)用0.02%PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述微球重懸于1ml0.1°/。SDS中，洗滌，離心；5)移棄上清液，微球重懸于100npH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯(lián)好的檢測(cè)微球，即本發(fā)明的基因液相芯片。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的炭疽芽孢桿菌檢測(cè)基因液相芯片的檢測(cè)方法，該方法包括樣本核酸的提取，PCR擴(kuò)增，；險(xiǎn)測(cè)病原體核酸。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述樣本核酸的提取包括以下步驟1)向每管樣本中加入6mol/LNal,振蕩混勻，煮沸；2)離心，轉(zhuǎn)上清液至另一含20%玻璃粉液的離心管中；3)充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分鐘離心，小心傾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇1ml,充分混勻，離心，小心傾去上清液；5)重復(fù)步驟4),然后置于37。C恒溫箱內(nèi)干燥；6)向上述干燥的玻璃4分-DNA沉淀中加20plTE,充分混勻，65。C加熱，離心，回收上清液備用。7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括1)取上述兩種偶聯(lián)微球混合，裝于PCR管中，根據(jù)微球計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)力口入量；2)向各管中加517D1上面的PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，混勻；3)95。C變性10分鐘；隨后45~6(TC反應(yīng)10-30分鐘；4)離心或抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物；5)再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE;6)再向各孔加入75niTE懸浮液，振蕩使微球重懸；上檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的基因液相芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明以pXO2和染色體上的特異基因?yàn)榘行蛄?，建立了炭疽芽孢桿菌液相芯片和檢測(cè)方法，為炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)提供一條可行的途徑。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101629211SQ20091007882公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者劉衡川,孫肖紅,張曉龍,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院