專利名稱：：鈴鐺刺ERF轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種與植物抗逆性相關的cDNA序列及其編碼的轉錄因子，尤其涉及從沙生植物鈴鐺刺(他h'ffloc/朋dronhaJode/Kyron7.)中所分離、克隆的編碼ERF轉錄因子的cDNA序列，本發(fā)明還涉及含有該cDNA序列的植物高效表達載體以及它們在提高植物抗逆性中的應用，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
：植物的逆境包括非生物逆境(如干旱、鹽堿和低溫等)和生物逆境(如真菌、細菌、病毒和線蟲等引起的病、蟲害以及雜草危害)。干旱、鹽堿和低溫是影響陸生植物生長和限制作物產(chǎn)量的三種主要的非生物脅迫因子。據(jù)統(tǒng)計，世界干旱半干旱地區(qū)涉及50多個國家和地區(qū)，約占全球陸地面積的34.9%。目前全世界用于農(nóng)業(yè)的57億公頃可耕旱地中，約70%的耕地由于干旱等因素導致土質(zhì)退化，亞洲受此影響的土地面積最廣，近14億公頃。而我國的干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的一半以上，年受旱面積達200-270萬公頃。其危害相當于其它自然災害之和。此外，世界鹽堿地占全球陸地面積的7.6%，隨著工業(yè)化進程加快，我國的土壤鹽漬化面積不斷擴大，目前鹽漬化土壤面積約有2600萬公頃，其中鹽堿耕地約有670萬公頃，嚴重制約了農(nóng)業(yè)對土地的利用。低溫作為經(jīng)常發(fā)生且危害嚴重的逆境因素之一，它不僅影響著植物的季節(jié)性生長，也影響著植物的地理性分布。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因凍害造成的農(nóng)業(yè)損失高達數(shù)十億元。干旱、鹽堿和低溫等非生物逆境都會構成對植物的滲透脅迫，致使環(huán)境滲透勢低于植物細胞滲透勢而導致植物細胞失水，嚴重的可造成細胞膨壓完全喪失，甚至導致植物死亡。當然，植物為了適應環(huán)境，在長期演化過程中也形成了復雜而精細的調(diào)節(jié)機制，提高了自身對不良環(huán)境脅迫的抵抗或忍耐能力，以適應不良環(huán)境。病蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)、森林危害的重要生物脅迫因子，如我國每年森林病蟲害發(fā)生面積約在1.2億畝左右。2008年的水稻重大病蟲害發(fā)生面積14.8億畝次，其中，病害以紋枯病、稻瘟病為主，發(fā)生面積4.0億畝次；蟲害以稻縱巻葉螟、稻飛虱和螟蟲為主，發(fā)生面積10.8億畝次，基本與2007年持平，此外玉米、棉花等重要經(jīng)濟作物均存在嚴重的病蟲危害，造成巨大的經(jīng)濟損失。而植物在適應病原物侵染的過程中獲得了復雜的植物防衛(wèi)反應(plantdefenseresponses)機制。植物識別病原物后，通過一系列信號傳遞過程，最終誘導相關植物防衛(wèi)反應基因的表達。植物防衛(wèi)反應基因的轉錄調(diào)控(transcriptionregulation)已成為植物防衛(wèi)反應研究中最具活力的領域之一。然而，單個植物防衛(wèi)反應基因的超表達能夠提高植物對某個病原物的抵抗能力，而一個轉錄因子的超表達能夠激活多個下游抗病基因的表達。因此，利用轉錄因子來改良植物的綜合抗病性，是一種很有潛力的方法。鈴擋刺(/feh'fflode/idronJodencfronV.)系豆科鈴鐺刺屬中抗旱、抗病性、抗鹽極強的灌木。集中分布于新疆塔克拉瑪干沙漠和內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠和甘肅民勤等地，國外原蘇聯(lián)，蒙古也有。降雨量在130mm以下的干熱荒漠區(qū)及地下水淺的地方均可生長。鈴擋刺系含高蛋白質(zhì)放牧用豆科植物，是荒漠牲畜駱駝和羊的喜食牧草?？勺龈牧见}堿土和固沙植物，并可栽培做綠籬。鈴鐺剌具有極強的抗旱耐鹽堿、抗病、防風、固沙、改良土壤等能力，能夠在極度干旱缺水的環(huán)境中生長除了其形態(tài)學上部分的特點外，更主要的是由于沙生植物在長期生長進化過程中形成了其特有的基因構成及精密的表達調(diào)控方式，能夠合成并保持較多的抗旱抗?jié)B透脅迫保護物質(zhì)，體內(nèi)存在著豐富的高抗性基因資源。因此，從沙生植物鈴鐺刺中克隆與抗逆性緊密相關的基因，不僅能為基因工程育種提供優(yōu)良基因源，而且對于作物抗逆育種顯得尤為重要和迫切。AP2/EREBP類轉錄因子是植物中所特有的一個龐大的轉錄因子家族，它主要參與干旱、高鹽和低溫脅迫應答以及病原、激素反應和植物發(fā)育。這個基因家族的成員都含有由60個左右氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結合區(qū)(g卩AP2/EREBP結合域)，這類蛋白根據(jù)DNA結合區(qū)的同源性又可以分為5類ERF(ethyleneresponsivefactor,乙烯反應因子)類、DREB類、AP2類、RAV類以及其它類型。很多研究已經(jīng)證明，ERF類和DREB類轉錄因子在逆境抗性中起重要作用。ERF轉錄因子分別與細胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關。從最初擬南芥中ERF轉錄因子的克隆距今，只短短10年，但卻從多種植物中克隆分離到上百種ERF轉錄因子。ERF轉錄因子特異識別結合CRT/DRE、GCC-box盒等元件，調(diào)控一系列干旱、低溫、病程應答基因的表達，這些基因所編碼的產(chǎn)物使植物適應或抵御逆境。另外，超表達ERF的擬南芥耐旱耐寒及抗病性增強，其中耐性的提高，不僅與CRT/DRE基因的表達增強有關，還與脯氨酸和糖含量的升高有關，而抗病性的增強是由于其一系列與病程相關基因的表達有關。因此，ERF轉錄因子的功能，可能不簡單局限于對含有CRT/DRE、GCC-box等順式元件基因的調(diào)控，可能還以某種方式、通過某種途徑調(diào)控其它與耐逆相關的基因表達。目前對ERF轉錄因子的認識還十分膚淺，對其功能和所參與調(diào)控的信號傳導途徑的準確理解和把握，還需要不懈的努力。到目前為止，已經(jīng)從多種植物中克隆分離到上百種ERF轉錄因子，包括單子葉植物和雙子葉植物，并且ERF順式作用元件與反式作用因子相互作用的調(diào)控模式已經(jīng)在草本植物種發(fā)現(xiàn)并被證明，如擬南芥、小麥、黑麥草、番茄、玉米、大麥、水稻等。但是目前尚未見到從沙生植物、尤其是野生灌木類沙生植物鈴鐺刺中克隆到相關基因的報道。目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定進展，但是其重點均在導入個別功能基因來提高某種抗性，從而達不到使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由單個或少數(shù)幾個基因的表達來體現(xiàn)的，而是由多基因控制的數(shù)量性狀。雖然目前已陸續(xù)從各種植物中克隆出大量的抗逆相關基因，但這些基因大多數(shù)只能增加植物的某種單一抗性，并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉錄因子作為功能基因表達的調(diào)節(jié)開關，可以對不同的基因進行精確的調(diào)節(jié)，在植物逆境信號傳遞過程中發(fā)揮著關鍵的作用，所以通過增強某個轉錄因子的作用，可促使多個與抗逆有關的功能基因表達，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。ERF正是這一類的轉錄因子，在脅迫信號'傳遞過程中起重要作用，它可以調(diào)控多個與植物抵抗干旱、高鹽、低溫及病原菌等有關的功能基因的表達，從整體上增強植物的抗逆性，提高其穩(wěn)定性，對于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在應用價值，并將有巨大的應用前景。因此，克隆新的具有自主知識產(chǎn)權的ERF類轉錄因子基因，研究其基本的生物學特性和功能，將為整個植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡及脅迫應答反應機理提供理論基礎，為改良作物抗逆性、創(chuàng)造新的抗逆材料提供物質(zhì)基礎。綜上所述，對于一個水資源緊缺、鹽漬化土壤面積不斷擴大、耕地面積有限、病蟲害曰益增多、人口眾多的農(nóng)業(yè)大國來說，克隆在植物抗逆過程中起重要作用的調(diào)控基因，對于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一類從沙生植物鈴鐺刺(/feh'ffloctendronteJodendronV.)中所分離、克隆的與植物抗逆性緊密相關的ERF轉錄因子cDNA序列。本發(fā)明目的之一是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一類從沙生植物鈴鐺刺中所分離、克隆的與其抗逆性緊密相關的ERF轉錄因子cDNA序列，該cDNA序列為以下(a)或(b)所示的堿基序列(a)SEQIDNO:1所示的堿基序列；或(b)將SEQIDNO:1所示的堿基序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有ERF轉錄因子的功能。本發(fā)明根據(jù)植物中SF基因DNA結合域保守區(qū)設計簡并引物，利用RT-PCR方法從沙生植物鈴鐺刺中分離到fiF2基因的同源片段，然后通過RACE-PCR技術克隆得到新的ERF2轉錄因子基因他SF2(SEQIDNO:1)，并對其進行了序列分析和蛋白的三維結構預測，結果顯示該基因具有ERF轉錄因子所特有的三個功能結構域，即核定位信號、DNA結合域和轉錄激活域。序列比對表明該基因和其它已知的ERF基因除了在保守的AP2/EREBP結構域處具有很高的同源性外，在其它區(qū)域的序列同源性不高。通過構建植物ERF轉錄因子的系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該HhERF2蛋白主要與ERF2類轉錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的ERF2類轉錄因子的親緣關系更近；分別以基因組DNA和cDNA為模板對HhERF2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，該基因含有1137bp的內(nèi)含子；通過半定量RT-PCR對其組織^P異性表達進行檢測，結果顯示該基因在鈴鐺刺的根、莖、葉中均有表達；通過半定量RT-PCR對其在不同的脅迫條件下進行脅迫反應檢測，結果顯示該基因的表達受干旱、高鹽和低溫環(huán)境逆境的誘導，此外，該基因的表達還受茉莉酸甲酯的誘導，并且其表達不依賴于ABA的調(diào)控。本發(fā)明目的之二是提供一類由上述cDNA序列所編碼的鈴鐺刺ERF轉錄因子。本發(fā)明目的之二是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一類由上述cDNA序列所編碼的鈴鐺刺ERF轉錄因子，為以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有ERF轉錄因子功能或活性的氨基酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的鈴鐺刺ERF轉錄因子為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明上文中所述的"多個"通常意味著28個，優(yōu)選為24個，這些取決于ERF轉錄因子三維結構中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的堿基或氨基酸殘基取代一個或多個堿基或氨基酸殘基；所述的"缺失"是指堿基序列或氨基酸數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個或多個堿基或氨基酸殘基；所述的"插入"是指堿基序列或氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個堿基或氨基酸殘基。本發(fā)明還涉及可以在植物中高效表達所述ERF轉錄因子cDNA序列(SEQIDNO:1)的植物表達載體。將本發(fā)明ERF轉錄因子cDNA序列插入到植物表達載體合適的限制性酶切位點之間，可操作的與表達調(diào)控序列相連接，得到可以在植物中表達該cDNA序列的植物表達載體。例如，該植物表達載體可以由5'非編碼區(qū)，SEQIDNO:l所示的cDNA序列和3'非編碼區(qū)所組成，其中，所述的5'非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子序列可以是組成型、誘導型、組織或器官特異性誘導子。所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等；SEQIDNO:1所示的cDNA序列可以是將其一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列所替換，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有ERF轉錄因子的功能。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，所述的高效植物表達載體是pC1302-HhERF2。本發(fā)明還涉及包含上述植物表達載體的植物細胞。轉錄因子通過與下游基因啟動子區(qū)域的順式元件結合可以調(diào)控一系列相關功能基因的表達，因此，在植物抗性分子育種中，導入轉錄因子基因能有效地提高轉基因植物的抗逆性。所以，可以將本發(fā)明cDNA序列應用于提高植物的抗逆性。例如，可以將含有本發(fā)明cDNA序列的植物表達載體導入到植物細胞中，培育篩選得到對環(huán)境脅迫的抗性提高了的轉基因植株，其中，所述的環(huán)境脅迫可以是干旱、高鹽、低溫或病害等逆境。為了進一步分析克隆到的他朋F2轉錄因子基因的功能,本發(fā)明首先構建了含有他朋F2基因的植物高效表達載體pC1302-HhERF2，利用農(nóng)桿菌介導將其轉化到擬南芥中；通過Hyg抗性、基因組PCR及RT-PCR篩選鑒定陽性苗，對轉基因擬南芥苗進行干旱、高鹽、低溫及病害等抗逆性分析并且對其相關生理生化指標進行測定，通過測定生理生化指標得出，轉基因植株的植株含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量高于對照，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累有助于減少滲透脅迫和干旱脅迫對植物的傷害，成為轉基因植物抗?jié)B透能力和抗旱能力提高的重要生化證據(jù)，也進一步說明過表達iftSF2基因能調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量從而提高轉基因擬南芥的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。同時轉基因植株的抗病相關基因的轉錄水平也高于對照，相應的轉基因植株較野生型植株的抗病性增強，這說明了ERF轉錄因子也能增強植株的抗病性。ERF轉錄因子對一系列抗逆功能基因的轉錄以及對脯氨酸和糖含量的促進作用說明ERF轉錄因子在植物抗逆反應中起著重要作用。圖1簡并PCR擴增結果。圖23'RACE-PCR擴增結果。圖35'RACE-PCR擴增結果。圖4HhERF2cDNA全長序列得擴增結果。圖5HhERF2蛋白的三維空間結構預測。圖6HhERF2氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析結果圖7HhERF2基因的基因組DNA結構分析。圖8HhERF2基因的組織特異性表達分析結果圖9不同脅迫處理下HhERF2基因的表達模式分析。圖10表達載體pC1302-HhERF2的構建流程圖。圖11重組質(zhì)粒pC1302-HhERF2菌落PCR擴增結果。圖12重組質(zhì)粒pC1302-HhERF2的酶切結果；1，質(zhì)粒pC1302-HhERF2，2.BgiII單酶切；2，BgiII和SstElI雙酶切。圖13含有表達載體pC1302-HhERF2的農(nóng)桿菌C58C1的菌落PCR;CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:農(nóng)桿菌C58C1(陰性對照)。圖14轉基因擬南芥的Hyg抗性篩選圖15轉基因擬南芥的DNA水平的PCR檢測；CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:野生型擬南芥基因組DNA(陰性對照)。圖16轉基因擬南芥的半定量RT-PCR檢領ij;CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:野生型擬南芥cDNA(陰性對照)。圖17轉基因擬南芥的抗旱性分析結果。圖18轉基因擬南芥的耐鹽性分析結果。圖19轉基因擬南芥的耐低溫分析結果。圖20轉基因擬南芥的抗病性分析結果。圖21脅迫處理對擬南芥相關抗性基因表達量影響圖22干旱對植株含水量的影響。圖23高鹽對植株含水量的影響。圖24干旱對丙二醛含量的影響。圖25高鹽對丙二醛含量的影響。圖26干早對葉片可溶性糖含量的影響。圖27高鹽對葉片可溶性糖含量的影響。圖28干旱對葉片脯氨酸含量的影響。圖29高鹽對葉片脯氨酸含量的影響。具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒產(chǎn)品說明書進行操作。實施例l鈴鐺剌ERF轉錄因子(/ftSF2)基因的分離、克隆1材料與方法1.1材料1.1.1植物材料培養(yǎng)及脅迫處理鈴鐺刺(/feh'ffloctendro/7haJoctenciron)種子采集于新疆塔里木河流域。用250mM的NaCl將水培4周的鈴鐺刺幼苗進行浸根處理3h、6h，采集葉片立即用液氮處理，保存于-8(TC超低溫冰箱中備用。材料的不同脅迫處理分別用250mM的NaCl、20%PEG6000、100nM的ABA溶液、100uM的GA3溶液、100uM的BA溶液、100uM的NAA溶液對水培4周的鈴鐺刺幼苗進行浸根脅迫處理，以及置于4'C培養(yǎng)箱中進行低溫處理，分別在處理0、1、3、6、12和24小時取材；分別用100ixM的SA溶液、100yMMeJA溶液對水培4周的鈴鐺刺幼苗進行浸根脅迫處理，分別在處理0、12、24、48、72小時取材，將處理后的材料迅速用液氮冷凍，于-80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.2菌株與質(zhì)粒'大腸桿菌(foc/3eriohiacoh'):DH5本室保存pMD19-T克隆載體購自TaKaRa生物公司1.1.3酶與試劑TRIzol總RNA提取試劑購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；S叩erScript111111ReverseTranscriptase及GeneRacerkit購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、Taq酶等常用酶類購自寶生物公司;EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均購自北京全式金生物技術有限公司。1.1.4溶液1.TE(pH8.0):10mmol/LTris-HC1;lmmol/LEDTA(pH8.0)2.50XTAE(1L):Tris242.0g;冰醋酸57ml;0.5mMEDTA100ml(pH8.0)3.1MTris-HCl(pH8.0，500ml):Tris60.6g;水400ml;濃HC121.0ml1.1.5培養(yǎng)基1.1.5.1LB液體培養(yǎng)基(1L,pH7.4):蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g1.1.5.2LB固體培養(yǎng)基(1L,pH7.4):蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,NaCl10.0g，瓊脂粉15.0g1.1.5.3B5培養(yǎng)基(1L，pH5.8)1.B5液體培養(yǎng)基(1L):貯備液I50ml貯備液II5ml貯備液m5mlje備液IV5mlCa鹽50ml鐵鹽5ml2.貯存液I(1L)NH巢33000mgKN0338000mgMgS047H207400mgKH2P043400mg3.貯存液II(IL)KI166mg貼031240mgMnS044H204460mgZnS047H201720mgNa2Mn042H2050mgCuS045H205mgCoCl26H205mg4.貯存液III(1L)FeS047H20Na2-EDTA2H205.貯存液IV(IL)肌醇煙酸VB6VB!甘氨酸6.轉鹽(IL)7460mg20000mg100mg100mg100mg400mgCaCl22H208800mg1.2實驗方法1.2.1鈴鐺刺總RNA的提取(TRIzol法)按照TRIzol法提取鈴鐺刺總RNA;1.2.2第一鏈cDNA的合成(按Invitrogen公司反轉錄試劑盒說明書進行)1.預變性以鈴鐺刺總RNA為模板，以01igo-dT為引物(工作濃度為lOpmol/ul)反應體系如表l，混勻后，65。C變性5rain，立即置于冰上卜2min;_表1RNA預變性體系_成分總RNA-Oligo-dTPrimer(lOpmol/ii1)dNTPs(10mMeach)DEPCftO總計lOng-1ygl.Oull.Ou1X13u12.反轉錄向上述離心管中加入表2中所列成分后混勻，42°Clh;70。C下15min滅活反轉錄酶；表2反轉錄體系成分5X緩沖液DTT(O.1M)RNaseOUT(10mMeach)ReverseTranscriptase(20011/ii1)總計4u1l.Oyll.Ou1l.On17ul3.RNaseH消化向反應液中加入1u1(2U/u1)的RNaseH，37。C20min，消化與cDNA結合的單鏈RNA,-2(TC冰箱保存反轉錄產(chǎn)物。1.2.3ERF轉錄因子家族基因同源片段的克隆1.2.3.1引物的設計與合成利用DNAMAN軟件對GENBANK中已公布的相關科屬植物S^類基因的氨基酸和核苷酸序列進行同源分析，然后，根據(jù)^F基因DNA結合域保守區(qū)設計合成一對簡并引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成(表3)。_表3簡并PCR中使用的引物_引物編號引物序列SP15'-C(A/C)(G/A)(A/T/C)GG(A/C/G)ATMGGATG(A/C)GGMGTC-3，ASP25'-(G/A)(T/C)(T/C)TGGAG(C/A)GCGTCGACT-3'QT_5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTMCGGCATGACAGTG(T)24-3'_1.2.3.2RT-PCR根據(jù)植物中朋F2基因DNA結合域保守區(qū)設計的一對簡并引物SP1和ASP2，以用250mMNaCl處理3h和6h的葉片為材料提取總RNA進行RT-PCR，PCR條件為94°C5min;94。C30sec,50°C30sec,72°C30sec,30個循環(huán)；72°C10min。反應結束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。1.2.3.3PCR產(chǎn)物的回收采用北京全式金生物技術有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照試劑盒說明書的方法進行操作。'1.2.3.4目的片段與克隆載體的連接將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，連接反應體系如表4，16'C連接過夜。表4連接反應體系成分用量回收的PCR產(chǎn)物(200-300ng/u1)4ti1pMD19-T載體(50ng/n1)l.On1LigationMix5.On1總計10u11.2.3.5大腸桿菌感受態(tài)的制備參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.6大腸桿菌的轉化(熱激法)參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.7菌落PCR鑒定以含有Amp的LB平板上挑取的白色單菌落，轉入lmlLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖菌2h,分別吸取1U1菌液作為模板，進行菌落PCR鑒定，引物為SP1和ASP2，擴增條件為94°C5min;94°C30sec，50。C30sec，72°C30sec，30個循環(huán);72°C10min。反應結束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。1.2.3.8重組質(zhì)粒的核苷酸序列測定將菌落PCR陽性的菌落轉入含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37。C下200rpm過夜培養(yǎng)，制備成甘油菌，送中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序。1.2.4鈴鐺刺0F基因的3'cDNA的克隆1.2.4.1引物的設計與合成根據(jù)已獲得的SF基因的同源片段，設計1對3'RACE的巢式基因特異引物，見表5。_表53'RACE反應中使用的引物_引物編號引物序列3HEGSP15'-CTCTCCGCCAACAGAGCACATCT-3'-3HEGSP25'-ATCAGACTAGCTCCCAGGACAGC-3'QT5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTMCGGCATGACAGTG(T)24-3'Ql5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTAACG-3'__5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'_1.2.4.2鈴鐺刺總RNA的提取以鈴鐺刺葉片為材料采用TRIzol法提取總RNA。1.2.4.3第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.4.4巢式PCR擴增3'-端cDNA1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，用基因特異引物3HEGSP1與通用引物Q1進行第一輪PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，60°C45sec,72°Clmin，30個循環(huán)；72°C10min;4。C保存。2.將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物3HEGSP2與通用引物Q2進行第二輪巢式PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，63°C45sec,72。Clmin，30個循環(huán)；72°C10min;4。C保存。3.0.8。/。的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5ot，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所重大工程開放13實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.5巢式PCR擴增5'端cDNA1.2.5.1引物的設計與合成根據(jù)己獲得的3'-端cDNA序列設計1對巢式基因特異引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成，見表6。_表65'RACE反應中使用的引物_引物編號引物序列5HEGSP15'-GTTGAAAGTTCCGAGCCAGACACGA-3'5HEGSP25'-GAGCCAGACACGMCACCCTTG-3'GeneRacer5'pri匿5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'GeneRacer5'Nestedprimer5'-GGACACTGACATGGACTGMGGAGTA-3'1.2.5.2第一鏈cDNA的合成(按照Invitrogen公司GeneRacerkit試劑盒說明進行)1.去磷酸在PCR管中加入表7所列成分混勻，離心，5CTC條件下處理lh后，離心，置于冰上l-2min。_表7去磷酸化反應體系_成分總RNA(l-5嗎)10XCIP緩沖液RNaseOut(40U/nl)ClP(麗4d)總計7[ill単i.owl単lOpl2.RNA純化參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。3.去帽在PCR管中加入表8所列成分混勻，瞬間離心，37。C條件下處理lh后，瞬間離心，置于冰上l-2min。'表8去帽反應體系成分用量去磷酸化的RNAIOXTAP緩沖液1.0^1RNaseOut(40U/nl)l単TAP(0.5U/nl)l単總計10|ol4.RNA純化5.RNA接頭序列的連接1)將經(jīng)去磷酸化和去帽處理的RNA轉入另一PCR管中，加入RNA接頭片段，輕輕混勻，離心；2)65°C,5min，冰浴2min，離心；3)在PCR管中加入表9所列成分混勻，離心，37'C條件下處理lhr后，離心，置于冰上l-2min。表9RNA片段連接反應體系成分用量去磷酸化和去帽的RNA和RNAOligo7.On110XLigase緩沖液l.Oy1RNaseOut(40U,/u1)1.OulATP(10腸1/L)l,Ou1TAP(O.5U/u1)l.Oy1總計llu16.RNA純化7.反轉錄—方法同1.2.2。1.2.5.3巢式PCR擴增5'端cDNA1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，分別用基因特異引物5HEGSP1與GeneRacer5'primer進行第一輪PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72。Clmin,30個循環(huán)；72°C10min;4"C保存。2.將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物5HEGSP2與GeneRacer5，Nestedprimer進行第二輪巢式PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C30sec,62°C30sec，72°Clmin，30個循環(huán);72°C10min;4。C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5oc，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.6E/F基因cDNA全長擴增1.2.6.1引物的設計與合成拼接已知的3'-端和5'-端cDNA序列，獲得cDNA全長序列，據(jù)此，設計基因特異引物，擴增S^基因的cDNA全長序列，所用引物見表IO。1.2.6.2第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。15表IOcDNA全長序列擴增所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1.2.6.3SF基因cDNA全長序列的克隆及生物信息學分析1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，利用基因特異引物HERF1與HERF2配對，進行PCR擴增，反應參數(shù)94°C5min;94°C30sec,60。C30sec，72°C2min,30個循環(huán)；72°C10min。2.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5oc，利用oc互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。3.利用DNAMAN軟件進行序列比對和分析；利用SMART(http:〃coot.embl-heidelberg,de/SMART/)分析油EiK2基因的結構域；利用CPHmodels-2.0服務器分析預測HhERF2蛋白的三維空間結構(http://genome,cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm);利用ScanProsite服務器(111^口//麗界.expasy.org/cgi—bin/prosite)分析ZftSF2基因的結構功能位點。1.2.7DNA序列的擴增及分析1.2.7.1引物的設計與合成同表10。1.2.7.2鈴鐺刺基因組DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法提取鈴鐺刺基因組DNA。.1.2.7.3PCR擴增以鈴鐺刺基因組DNA為模板，以基因特異引物HERF1與HERF2進行PCR擴增，反應參數(shù)分別為94°C5min;94°C30sec，60°C30sec，72°Clmin,30個循環(huán);72°C10min;0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5oc，利用oc互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.8HF基因的組織特異性表達1.2.8.1總RNA提取分別提取水培鈴鐺刺幼苗的根、莖、葉的總RNA，提取方法為TP、lzol法。I.2.8.2引物的設計與合成利用DNAMAN軟件對GENBANK中已公布的豆科植物肌動蛋白基因的保守區(qū)進行同源性分析，以大豆Actin(U60506)為內(nèi)標基因，設計肌動蛋白基因特異引物Actin-F和Actin-R;根據(jù)已得到的朋F基因cDNA序列，在基因的非保守區(qū)設計基因特異引物，所用引物見表II。表11SF基因組織特異性表達分析所使用的引物引物編號引物序列HE-RT(F)5'-CGCTACTTCC嵐CAGTCACC_3'HE-RT(R)5'-GCTGAGGCAACGCTTCTTAG--3'Actin-F5'-CMCCTTAATCTTCATGCTG--3'Actin_R5'-AGCMCTGGGATGACATGGAG-3'1.2.9ERF基因在不同脅迫條件下的表達譜分析1.2.9.1引物的設計與合成同1.2.8.2。1.2.9.2ERF轉錄因子基因對不同激素條件脅迫的應答將水培4周的鈴鐺刺幼苗分別插入含有100uM的生長素萘乙酸(NAA)溶液、lOOuM的細胞分裂素6—芐基氨基嘌呤(BA)溶液、lOOuM的赤霉素(GA3)溶液以及100uM的脫落酸(ABA)溶液中進行不同激素脅迫處理；分別提取處理0、1、3、6、12和24小時的葉片總RNA，反轉錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以肌動蛋白基因為內(nèi)標基因，利用基因的特異引物HE-RT(F)和HE-RT(R)進行RT-PCR擴增，Actin擴增參數(shù)94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72°C45sec，28個循環(huán)；72°ClOmin;基因非特異片段擴增參數(shù)94°C5min;94°C30sec，58°C30sec，72°C30see,28個循環(huán)；72°ClOmin;檢測/ftSF2基因的表達量變化。1.2.9.3ERF轉錄因子基因對干旱、高鹽及低溫脅迫條件的應答將水培4周的鈴鐺刺幼苗分別插入含有250mM的NaCl溶液、20%PEG6000溶液以及置于4'C培養(yǎng)箱中進行高鹽、干旱以及低溫脅迫處理。分別提取處理0、1、3、6、12和24小時的葉片總RNA,反轉錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以肌動蛋白基因為內(nèi)標基因，利用基因特異引物HE-RT(F)和HE-RT(F)進行RT-PCR擴增，反應參數(shù)同1.2.9.2;檢測池SF2基因的表達量變化。1.2.9.4ERF轉錄因子基因對不同激素條件模擬病害脅迫的應答將水培4周的鈴鐺刺幼苗分別插入含有100iiM水楊酸(SA)、100pM的茉莉酸甲酯(MeJA)溶液進行不同的脅迫處理；分別提取處理0、12、24、48、和72小時的葉片總RNA，反轉錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以肌動蛋白基因為內(nèi)標基因，利用基因特異引物HE-RT(F)和HE-RT(R)進行RT-PCR擴增，反應參數(shù)同1.2.9.2,檢測他朋F2基因的表達量變化。2實驗結果與分析2.1SF基因同源片段的獲得對己報道的ERF蛋白序列進行了同源比對分析，發(fā)現(xiàn)ERF蛋白的DNA結合域的氨基酸序列在不同植物、不同ERF家族中都呈現(xiàn)出高度保守的特性，因此利用該保守區(qū)域進行了簡并引物的設計，以葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，通過簡并PCR擴增出約280bp的目標帶(圖1)，與預期大小一致。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5oc，利用oc互補及菌落PCR篩選出6個陽性克隆，測序后得到1條282bp的序列。序列檢索結果顯示，與大豆、陸地棉及擬南芥的SF基因核苷酸序列具有較高的一致性，初步判斷該片段為鈴鐺刺fiF基因保守區(qū)。2.2iiF基因cDNA3'序列和5'序列的獲得經(jīng)序列比對，利用已獲得的SF基因同源片段，設計基因特異引物；利用基因特異引物3HEGSP1和3HEGSP2分別與3，通用引物Ql、Q2進行3'RACE擴增，電泳檢測，得到1條約300bp擴增產(chǎn)物(圖2)，測序結果表明，該片段為276bp,且5'端序列分別有52bp與原同源片段部分重疊，判斷為目標^F基因的3'端序列。利用特異引物5HEGSP1和5HEGSP2分別與GeneRacer5'Primer和5'NestedPrimer進行5'RACE擴增，電泳檢測得到l條約400bp的擴增產(chǎn)物(圖3)，測序結果表明，該片段為416bp，且3'端序列有67bp與原同源片段部分重疊，判斷為目標HF基因的5'端序列。2.3SF基因cDNA全長序列的獲得利用基因全長特異引物HERF1和HERF2分別與3'通用引物Q1、Q2，巢式PCR獲得1條約800bp擴增產(chǎn)物條帶(圖4)。測序結果表明，其全長序列為855bp，序列比對結果顯示，與多種植物KF家族的基因有較高相似性，推斷為新的HF基因，命名為他KF2(GenebankAccessionnumber:FJ032362)。2.4鈴鐺刺cDNA全長序列分析2.4.10F基因的序列特征分析及編碼蛋白的結構功能預測利用DNAMAN軟件對油朋F2基因的全長cDNA序列進行分析，結果表明他朋F2基因序列全長為855bp，完整開放閱讀框738bp，編碼245個氨基酸。該蛋白含有一個典型的AP2/EREBP結構域，該結構域由58個氨基酸組成，其中第14位為保守的丙氨酸，而第19位為天冬氨酸，屬于ERF基因家族，并且發(fā)現(xiàn)在其序列中存在一個絲氨酸富集區(qū)和一個谷氨酰胺富集區(qū)，推測這段區(qū)域可能通過磷酸化和去磷酸化的作用調(diào)控該蛋白的活性，具有一定的轉錄激活功能，經(jīng)PSORT分析預測該蛋白定位于細胞核，判斷為典型的ERF轉錄因子。2.4.2ERF蛋白的三維空間結構預測利用CHPmodels-2.00ittp:〃genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)服務器來預測ERF2蛋白的三維空間結構(圖5)，結果顯示ERF2蛋白的空間結構中具有1個a-螺旋，3個(3-折疊組成，這是一個典型的ERF轉錄因子所具有的空間結構，這從蛋白所具有的空間結構的角度證明了該基因所編碼的蛋白可能是ERF類轉錄因子。2.4.3HhERF2蛋白與其它ERF2類蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析植物中的ERF類基因可以分為四大類，Tournier等(2003)根據(jù)氨基酸序列的同源性和結構特征，將ERFs分成四個class。分析表明ERFclassIV具有典型的特征，即在5'端有一個高度保守的未知功能的氨基酸基序(MCGGAII/L)。ERFclassIV還包括其它的成員，例如Arabidopsis的AtEBP、Ly卿e:rsi，escuJe自ffl的LeERF2禾卩JERF1、0.satira的OsEREBPl、OsEBP-89和Capsic咖anntrnffl的CaERFLPl。通過DNAMAN軟件對鈴鐺刺朋SK2基因與其它已經(jīng)克隆的SF基因進行系統(tǒng)進化樹分析，結果表明///^/F2屬于ERFclassIV亞家族，主要與Sf2類轉錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的Sf2類轉錄因子的親緣關系更近。因此，將克隆到的ERF轉錄因子基因朋SF2與植物中的ERF2類轉錄因子進行同源性比對分析。序列比對結果(見圖6)顯示該轉錄因子基因全序列在蛋白水平上與其它植物ERF2類蛋白的同源性不高，一致性約為27.28%，僅在AP2/EREBP結合域中有高度保守性。并且發(fā)現(xiàn)^F類轉錄因子第14位的丙氨酸(A14)和第19位的天冬基酸(D19)非常保守。進一步證明在ERF相關蛋白中決定DNA結合特異性方面，A14與D19都具有非常重要的作用。2.5鈴鐺刺ffl朋/^基因的基因組DNA結構分析以鈴鐺刺基因組cDNA和DNA為模板，以HERF1和HERF2為引物進行PCR擴增，分別為約800bp與約2000bp的擴增產(chǎn)物；經(jīng)回收測序表明，這2個條帶均為811bp、1992bp。測序結果分析顯示，該基因含有一個1137bp的內(nèi)含子(圖7)。2.6SF基因的組織特異性表達分析分別提取鈴鐺刺的根、莖、葉的總RNA，提取方法同1.2.1。利用半定量RT-PCR對池fiiF219基因在不同組織中的表達情況進行了檢測，結果該基因在根、莖、葉中表達量幾乎相同，由此可見該基因的表達無明顯的組織特異性(圖8)。2.7SF基因在不同脅迫條件下的表達模式分析對他S/^基因在不同脅迫條件下進行表達模式分析(圖9)，結果顯示他SF2對高鹽、干旱和低溫均有應答。用250mMNaCl高鹽溶液處理后在3小與6小時ZftSF2基因均有較高的表達量，隨后又逐漸減弱；模擬干旱處理lh/ftSF2基因開始表達，6h后表達量達到最高，隨后逐漸減弱；由實驗結果可以明顯看出，該基因對低溫也具有應答反應，并且低溫處理6h時達到峰值，而用激素處理時發(fā)現(xiàn)，NAA、GA3、SA和BA對他fiF2基因的表達無明顯影響，此基因對外源ABA無明顯應答反應，但是MeJA的處理后該基因在12小時表達量已有明顯增加，在24小達到最高；綜上所述，他EiF2基因能被高鹽、干旱和低溫所誘導表達，并且這種誘導作用并不依賴于ABA信號調(diào)節(jié)途徑，同時該基因可能還參與了茉莉酸甲酯調(diào)控的病程相關基因的信號傳導過程。利用生物信息學軟件對拙SF2基因進行分析，發(fā)現(xiàn)HhERF2蛋白含有一個典型的AP2/EREBP結構域，該結構域由58個氨基酸組成，其中第14位為保守的丙氨酸，而第19位為天冬氨酸，屬于ERF基因家族,此區(qū)域能與兩個順式作用元件GCC-box特異結合，而絕大多數(shù)PR基因的啟動子區(qū)都含有非常保守的核心序列AGCCGCC，另一個是DRE/CRT基序，該基序與干旱、低溫等非生物脅迫誘導的基因表達有關。研究表明，在ERF轉錄因子的C-端一般存在一個轉錄激活域，它們以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或絲氨酸和蘇氨酸為特征，此結構域是激活目標基因轉錄所必須的。在/ftSF2轉錄因子基因C-端具有明顯的轉錄激活域，推測該轉錄因子蛋白應該具有轉錄激活功能，其生物學功能有待進一步深入研究。同時推測HhERF2蛋白中的絲氨酸富集區(qū)可能通過位點的磷酸化作用分別調(diào)控蛋白的DNA結合域對DRE元件或GCC-box的結合能力和酸性激活域的轉錄激活能力。試驗例1鈴鐺刺他朋F2基因植物高效表達載體的構建及在擬南芥中的相關功能驗證2材料與方法2.1材料2.1植物材料擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Columia-0)，由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所梁華老師贈送。2.1.2菌種及載體大腸桿菌(focheric/n'acoh')DH5a，由本實驗室保存；農(nóng)桿菌G4grobacteriuffltufflefaciens)菌株C58C1，由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所馬有志研究員贈送；雙子葉植物表達載體pCAMBIA-1302(說明pCAMBIA1302為實驗室常用植物表達載體，在NCBI上可以査到其全序列及其說明)由中國科學院植物研究所沈世華研究員贈送。pMD19-T克隆載體，購自TaKaRa。2.1.3試劑盒EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均購自北京全式金生物技術有限公司；SUPERSCRIPTIIlReverseTranscriptase購自Invitrogen公司。2.1.4培養(yǎng)基1.YEB培養(yǎng)基:參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法；2.LB細菌培養(yǎng)基參照《分子克隆實驗指南》(第三版)丄薩姆布魯克一書中所列的具體方法；3.MS培養(yǎng)基:參見實用植物組織培養(yǎng)技術教程(甘肅科學技術出版社)曹孜義主編所列的具體方法；4.MS選擇培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基中加入潮霉素(30mg/L)2.2實驗方法2.2.1引物設計與合成設計合成含有酶切位點feiII和￡st￡II的引物pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)，序列見表12。表12構建植物表達載體所用引物引物編號引物序列PC1302-HhERF2(F)5'-嵐GATCTACCATGTGTGGAGGCG-3'pC1302-HhERF2(R)5'_GGGTGACCCTAGT嵐CCMGCGAC-3'2.2.2植物表達載體的構建2.2.2.1植物高效表達載體pC1302-HhERF2的構建利用引物pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)從連接有池欣K2cDNA全長的pMD19-T載體上擴增出完整的開放閱讀框。擴增產(chǎn)物和pCAMBIA-1302載體均經(jīng)相應的酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶連接得到植物高效表達載體pC1302-HhERF2。2.2.2.2重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5ot及菌落PCR鑒定參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法；2.2.2.3重組質(zhì)粒的小量提取及酶切鑒定質(zhì)粒提取參照北京全式金生物技術有限公司EasyPureMiniPlasmidPurificationKit所列的具體方法；酶切鑒定參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法。2.2.3擬南芥的遺傳轉化2.2.3.1農(nóng)桿菌C58C1電擊感受態(tài)細胞的制備2.2.3.2電擊轉化2.2.3.3含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的PCR鑒定挑取LB平板上的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基(含50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)中，28'C培養(yǎng)l-2d，以未轉化的農(nóng)桿菌作對照，進行菌落PCR鑒定。2.2.3.4擬南芥的培養(yǎng)1.種子處理取適量種子于1.5ml離心管中用70。/。的乙醇洗3min，無菌水洗3次，0.5%次氯酸鈉(NaClO)洗10min，無菌水洗3次，均勻撒播于MS培養(yǎng)基平板上，注意每次洗脫用Vortex充分混勻；2.播種后MS平板于4'C春化3天；3.將MS平板放置于22光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；4.待小苗長出四片真葉后移栽至用MS液體培養(yǎng)基澆灌過蛭石中生長，保濕2-3—天；2.2.3.5Floral-dip法轉化擬南芥植株1.挑鑒定過的農(nóng)桿菌單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中28。C、250rpm培養(yǎng)24h;2.按1:50轉接，28°C、250rpm繼續(xù)培養(yǎng)至0D二1.53.0;3.室溫離心，5000rpm、15min;4.用懸浮液懸浮菌體，180rpm慢慢將菌體搖勻；5.將已經(jīng)交足水開花的擬南芥倒置，使花蕾朝下侵染液中42s;6.取出轉化后的擬南芥植株平放，蓋好保鮮膜，低光照強度下生長24h后置于正常光照條件下直立生長培養(yǎng)；附懸浮液(滅菌蒸餾水，10函gCl"5%蔗糖，0.3%Silwelt-77)。222.2.4轉基因擬南芥的篩選2.2.4.1Hyg抗性苗的篩選將To代收獲的種子消毒(參考本實例2.2.3.4)，均勻撒播于含有Hyg抗性的MS平板上進行抗性篩選。2.2.4.2轉基因擬南芥的DNA水平鑒定利用CTAB法小量提取在含有Hyg培養(yǎng)基中生長的擬南芥總DNA，通過PCR檢測進一步篩選陽性擬南芥植株。若擴增出了目標片段，而陰性對照中沒有擴增出片段，即初步證明目的基因整合到擬南芥基因組中。2.2.4.3轉基因擬南芥的RT-PCR檢測選擇PCR確定的陽性轉化株，剪取葉片，TRIzol提取總RNA,反轉錄獲得cDNA作為模板，RT-PCR檢測篩選陽性轉化苗。方法參照實例1中的1.2.6.1-1.2.6.1,PCR反應參數(shù)94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72°C2min,30個循環(huán)；72°C10min;0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。。2.2.5轉基因擬南芥的耐脅迫分析2.2.5.1轉基因擬南芥的非生物脅迫抗性鑒定用生長2周左右的的擬南芥植株進行非生物脅迫抗性鑒定，設三個重復1.耐旱鑒定將野生型植株與轉基因型植株置于22°C光照培養(yǎng)箱中，控水處理4周；分別在0d、7d、14d取樣，液氮處理后，置于-8(TC保存；待處理4周之后，復水觀察其生長狀況。2.耐鹽鑒定將250mM的NaCl溶液澆于栽有野生型和轉基因型擬南芥的盆中，22°C光照培養(yǎng)箱中處理4周；分別在0d、7d、14d取樣，用液氮處理后，置于-80'C保存；待處理4周后復水觀察植株的生長情況。3.耐低溫鑒定把轉基因植株與野生型植株置于-6'C處理12h，轉到4'C適應2h后，轉移到正常的生長條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，觀察植株的生長情況。4.抗病性鑒定細菌培養(yǎng)假單胞菌(Psueobinnoassyri/Jgae)，離心收集菌體，用lOmMMgCl2重懸，稀釋濃度至106colnOy/ml,用懸浮液侵染擬南芥6min，觀察擬南芥植株發(fā)病情況，具體方法可參見有關文獻(ChakravarthyS.,etal,ThetomatotarnscriptionfactorPti4reuglatesdefensed-relatedgeneexperssionviaGCCboxandnonGCC-boxciselements.PlnatCell15:3033-3050.2003.)2.2.5.2轉基因擬南芥脅迫相關基因的RT-PCR分析以擬南芥Actin(Accessionnumber:AF494804)為內(nèi)標基因檢測擬南芥脅迫相關基因23表達量變化清況。根據(jù)已發(fā)表的擬南芥中脅迫相關基因的序列，分別設計擬南芥corl5a(Accessionnumber:1101377)、rd29A(Accessionnumber:NM—124610)、kinl(Accessionnumber:NM—121601)、PDF1.2(Accessionnumber:NM—123809)、PR3(Accessionnumber:NM一112085)等脅迫相關基因的特異引物，見表13。表13轉基因擬南芥中脅迫相關基因表達分析所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>選取經(jīng)過抗性篩選、DNA水平及RNA水平檢測為陽性且分別經(jīng)干旱、MeJA脅迫處理0d、2d、4d、6d、8d的轉基因擬南芥植株葉片，TRIzol提取總RNA，反轉錄獲得cDNA作為模板，分別使用表13中配對引物半定量RT-PCR檢測脅迫相關基因的表達量變化，反應參數(shù)為94°C5min;94°C30sec，53°C30sec,72°C30sec，28個循環(huán)；72°C10min;做3個重復。2.2.6轉基因擬南芥在干旱和高鹽脅迫條件下的生理生化指標測定2.2.6.1脅迫處理后植株含水量的測定脅迫處理完畢后，收取整株植株，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分。每個處理取6棵單株，并迅速測其鮮重，之后放入12(TC烘箱中烘烤30min，80°C烘烤48h至恒重，稱量其干重。對上述測得的干、鮮重，采用公式組織含水量(占鮮重％)=(鮮重-干重)/鮮重進行含水量的計算。2.2.6.2丙二醛(MDA)及可溶性糖的測定丙二醛的提取稱取經(jīng)逆境脅迫處理的植株葉片0.5g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸4mL，研磨至勻漿，然后以4000rpm離心10min，其上清液即為丙二醛提取液，每個處理取6棵單株。2顯色反應及測定取若干干凈試管并編號，各加入1mL的提取液，對照加lmL蒸餾水；然后再加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液；搖勻，將混合液在沸水浴中反應15rnin，迅速冷卻后低速離心；然后取上清液分別在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值?？扇苄蕴羌癕DA含量的計算C(糖)=11.71*A柳(咖ol/L)C(MDA)=6.45*(A532_A600)—0.56*A450(nmol/L)公式中A頓一在450nm波長下測得的吸光度值A532—在532nm波長下測得的吸光度值A60。一在600nm波長下測得的吸光度值C糖、C(MDA)分別是反應混合液中可溶性糖、MDA的濃度。2.2.6.3轉基因植株脯氨酸含量分析脯氨酸的提取用液氮迅速研磨經(jīng)不同處理的待測植株葉片，并轉移至大試管中快速稱重約0.3g(差量法)，然后向各管分別加入5mL3%的磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，在沸水浴中提取10min，提取過程中要經(jīng)常搖動，冷卻后低速離心，上清即為脯氨酸提取液，將上清轉移至干凈的試管中待測。脯氨酸含量的測定采用日立835-0200氨基酸自動分析儀對脯氨酸含量進行分析3實驗結果與分析3.1植物表達載體的構建3.1.1表達載體pC1302-HhERF2的構建利用引物pC1302-HhERF2(F)、pC1302-HhERF2(R)從連接有基因全長的pMD19-T載體上擴增出其的全長。擴增產(chǎn)物pCAMBIA-1302空載體均經(jīng)相應的酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶將/ffiSF2連接至pCAMBIA-1302相應的酶切位點，構建植物表達載體pC1302-HhERF2。構建過程見圖10。3.1.2重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定在重組質(zhì)粒的轉化LB(Kan+)平板上，分別挑取三個白色單菌落，進行菌落PCR鑒定，結果均為陽性，見圖ll。3.1.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定將PCR檢測的陽性菌落轉入LB(Kan+)液體培養(yǎng)基，37。C搖菌過夜，EasyPureMiniPlasmidPurificationKit試劑盒小量提取重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定。pC1302-HhERF2重組質(zhì)粒被切出目標帶，酶切結果正確，見圖12。3.2含有表達載體的農(nóng)桿菌PCR檢測將重組質(zhì)粒pC1302-HhERF2轉化農(nóng)桿菌C58Cl，以轉化后的農(nóng)桿菌的菌液作模板，未轉化的農(nóng)桿菌作陰性對照，質(zhì)粒做陽性對照，進行菌落PCR鑒定。檢測結果表明，該重組質(zhì)粒已成功轉入農(nóng)桿菌中，見圖13。3.3轉基因擬南芥的篩選與鑒定3.3.1Hyg抗性苗的篩選采用Floral-dip法轉化擬南芥，收集轉基因當代植株的種子(L代)，在Hyg-MS培養(yǎng)基上篩選(如圖14)。野生型植株為黃化苗，不能正常生長，轉基因植株在Hyg-MS培養(yǎng)基上能正常生長。播種后十三天將綠苗轉入蛭石草炭土=3:1的培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。3.3.2轉基因擬南芥的DNA水平鑒定選取正常生長Hyg抗性苗，剪取其葉片，采用CTAB法提取其DNA，以擬南芥DNA為模板，以構建植物表達載體時設計的pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)引物為引物，釆用PCR技術，對Hyg抗性苗進行DNA水平的檢測。結果表明，檢測pC1302-HhERF2轉化的Hyg抗性苗22株，18株為陽性，陽性率81.8%，部分植株PCR檢測見圖15，證明他SF2已經(jīng)整合到擬南芥基因組中。3.&3轉基因擬南芥的RT-PCR檢測分別選取DNA水平鑒定的18株陽性擬南芥植株葉片為材料，提取總RNA，以反轉錄獲得的cDNA為模板，RT-PCR對陽性苗作進一步的檢測。結果表明，18株pC13rd29A-HhDREB2轉化的擬南芥植株葉片中，15株檢測為陽性，陽性率83.3%，部分植株RT-PCR檢測見圖16。3.4轉基因擬南芥的耐脅迫分析3.4.1轉基因擬南芥的脅迫抗性鑒定耐旱性分析結果轉基因植株和野生型植株在正常生長條件下培養(yǎng)，但不澆水，4周后，發(fā)現(xiàn)野生型植株全部死亡，而他SF2轉基因植株有72呢存活，復水后繼續(xù)生長，并正常結實，見圖17。耐鹽性分析結果轉基因植株和野生型植株用250mM的NaCl溶液處理，4周后野生型植株全部死亡，統(tǒng)計結果表明/ftHF2轉基因植株，仍有42%存活下來，轉移至生長條件下仍能生長，見圖18。耐低溫分析結果轉基因植株和野生型植株在-6r處理12h，發(fā)現(xiàn)野生型植株的葉片多數(shù)凍傷萎蔫，而轉基因植株大多數(shù)仍然正常。轉到4'C適應2h后，再轉移到正常生長條件下培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計成活率，野生型植株仍有部分存活下來，然而表型出現(xiàn)生長緩慢，植株矮小；而朋朋F2轉基因植株有,37y。存活下來，并有部分植株正常開花結實，見圖19?？共⌒苑治鼋Y果用假單胞菌(PsuedoM7oasS3^i/igae)懸浮液侵染擬南芥，結果表明轉HhERF2基因的擬南芥植株抗病性明顯增強，統(tǒng)計植株的孢子數(shù)，在假單胞菌侵染擬南芥7-10天左右抱子數(shù)量最多，發(fā)病最重，此后孢子數(shù)量逐漸減少，20天后發(fā)病植株逐漸恢復正常生長，病癥減輕，見圖20。3.4.2轉基因擬南芥脅迫相關基因的RT-PCR分析以擬南芥Actin基因(Acessionnumber:AF494804)為內(nèi)標引物，半定量RT-PCR檢測擬南芥脅迫相關基因coW5a、r必ft4、AiW、2、Pi3的表達量變化。結果(圖21)顯示corJfe、rd29丄Ai/L三個基因在干旱處理的隨后4天內(nèi)其表達量均有增加但不顯著，但第六天時增加比較顯著，可能是隨處理時間的延長脅迫增強，HhERF2調(diào)控了上述三個基因的表達，以此來增強轉基因植株抗非生物脅迫的能力。用MeJA噴灑轉基因擬南芥植株，隨著處理時間增加，已證實的抗病相關基因PDF1.2與PR3的轉錄表達均增強，以增加轉基因植株的抗病性。該實驗結果從轉錄水平解釋了轉基因擬南芥耐脅迫性增加的原因。3.5轉基因擬南芥在逆境條件下的生理生化指標測定3.5.1脅迫處理對植株含水量的影響、/表14轉基因植株與對照干旱脅迫下植株含水量差異o天7天14天野生型植株含水量平均值92.5%87.6%82.3%轉基因植株含水量平均值92.3%90.5%86.8%表15轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株含水量差異o天7天14天野生型植株含水量平均值92.5%89.4%88.2%轉基因植株含水量平均值92.4%90.7%89.8%已有研究表明，干旱和高鹽逆境都可造成植物體的滲透脅迫，導致細胞失水，嚴重的可造成細胞膨壓喪失，導致死亡。本實例通過測定脅迫條件下野生型與轉基因型植株含水量的變化，從而在個體水平上獲得轉基因植株較野生型植株抗逆性有顯著提高的直接證據(jù)。結果顯示，干旱(表14、圖22)和高鹽(表15、圖23)處理后野生型和轉基因植株27的含水量都呈下降趨勢。在脅迫處理前，轉基因植株的含水量與野生型植株的含水量沒有明顯差異；當脅迫處理達到7d和14d時，轉基因型植株的葉片含水量明顯高于野生型植株的葉片含水量。這表明插入的外源基因/ft^F2,對干旱和高鹽脅迫下的細胞失水有了一定的緩解作用，從而提高了轉基因擬南芥在脅迫條件下的耐逆性。3.5.2脅迫處理對植株MDA含量的影響表16轉基因植株與對照干旱脅迫下植株MDA含量的差異單位^mol/g0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0130.0210.022轉基因植株MDA含量平均值0.0140.0160.018表17轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株MDA含量的差異單位umol/gu乂、<乂^乂乂野生型植株MDA含量平均值0.0150.0230.038轉基因植株MDA含量平均值0.0150.0220.021植物器官衰老或遭受逆境脅迫傷害時，往往會發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，它的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。表16、圖24結果顯示，隨著干旱處理時間的增加，轉基因和野生型植株的MDA含量都呈上升趨勢，這表明干旱脅迫對轉基因和野生型植株均造成了一定程虔的傷害。但隨著脅迫處理時間的增加，野生型植株MDA含量增加更為顯著。其中干旱脅迫處理14d后，野生型植株的MDA含量比沒有經(jīng)過干旱處理的植株增加69.2%，而轉基因型植株的MDA含量僅增加28.5%。T-test統(tǒng)計分析結果表明，干旱處理下轉基因型植株的MDA含量顯著低于野生型植株的MDA含量(p〈0.05)。從表17、圖25可以看出，鹽脅迫處理可以極顯著提高野生型植株的MDA含量(p<0.01)。轉基因型植株經(jīng)7d鹽脅迫處理后，MDA含量有所提高，但14d鹽脅迫處理的植株的MDA含量反而要低于7d脅迫處理下植株的MDA含量。這可能是由于ERF轉錄因子的下游與鹽脅迫以及抗氧化有關的信號分子產(chǎn)生了應答，從而降低了MDA含量。野生型和轉基因型植株的MDA含量分析結果表明，ZftHF2轉錄因子在逆境脅迫下能夠降低脂膜過氧化作用從而保證細胞內(nèi)脂膜的完整性。這可能是由于fflSF2下游信號與過氧化自由基抗性分子(如谷胱甘肽，過氧化氫酶，過氧化物酶等)相偶聯(lián)，從而保護了細胞膜。3.5.3脅迫處理后植株可溶性糖含量的變化表18轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株可溶性糖含量的差異單位mol/g0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0800.1170.141轉基因植株可溶性糖含量平均值0.0750.1240.162表19轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株對溶性糖含量的差異單位mmol/go天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0800.0850.123轉基因植株可溶性糖含量平均值0.0760.1030.132在脅迫的環(huán)境中，植物為了減緩由脅迫造成的生理代謝不平衡，細胞內(nèi)大量積累一些小分子有機化合物?？扇苄蕴潜闶敲{迫誘導的小分子溶質(zhì)之一，通過滲透調(diào)節(jié)來降低水勢，維持較高的滲透壓，保證細胞的正常生理功能。從表18、圖26和表19、圖27可以看出，干旱脅迫和鹽脅迫都能夠使植株內(nèi)可溶性糖含量增加。這說明植株在脅迫條件下會自發(fā)的產(chǎn)生相應的應答機制來抵抗逆境脅迫。但隨著處理時間的增長，轉基因植株可溶性糖含量的增加要高于野生型植株可溶性糖含量的增加。在干旱脅迫處理14d后，野生型植株可溶性糖含量是未經(jīng)處理的1.76倍，而轉基因型可溶性糖含量是未經(jīng)處理的2.12倍。鹽脅迫處理下可溶性糖含量也要顯著高于野生型可溶性糖含量(p<0.05)。植株的可溶性糖含量分析結果表明，在逆境脅迫條件下，植物可以自發(fā)產(chǎn)生可溶性糖從而保證細胞體內(nèi)正常的代謝過程。插入池SF2轉錄因子的轉基因植株，可以在逆境條件下產(chǎn)生更多的可溶性糖來抵抗逆境脅迫。3.5.4脅迫處理后脯氨酸含量變化表20轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株脯氨酸含量的差異單位mmol/go天7天14天野生型植株脯氨酸含量平均值4.812.26,2轉基因植株脯氨酸含量平均值5.216.735.3表21轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株脯氨酸含量的差異單位mmol/go天7天14天舒生型植株脯氨酸含量平均值4.914.120.8轉基因植株脯氨酸含量平均值5.320.531.4脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很強的水和能力，其疏水端可和蛋白質(zhì)結合，親水端可與水分子結合，使蛋白質(zhì)可以借助脯氨酸束縛更多的水，從而防止?jié)B透脅迫下蛋白質(zhì)的脫水變性。因此，脯氨酸在植物的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用。在正常的條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量并不高，但當遭受干旱、鹽害等脅迫時，游離脯氨酸便會大量積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關，在一定程度上反映植物受水分和鹽脅迫的情況，可作為植物抗逆性的一項生理指標。從表20、圖28可以看出經(jīng)7d干旱脅迫處理后野生型植株的脯氨酸含量有所上升，29但是當14d干旱處理的植株的脯氨酸含量卻低于7d處理。這可能是由于14d干旱處理后，野生型植株的代謝調(diào)控機制已經(jīng)紊亂，不能夠產(chǎn)生出抵抗干旱脅迫的相應應答。而轉基因型植株的脯氨酸含量隨著處理時間的增長而提高。這表明轉基因型植株對干旱脅迫有更好的適應能力。從表21、圖29可以看出，在鹽脅迫處理下，野生型植株和轉基因植株的脯氨酸含量都有所增加，但是轉基因型植株的脯氨酸含量顯著高于野生型(p〈0.05)。這一結果表明，他SF2轉錄因子在擬南芥體內(nèi)過量表達后，其下游信號的放大會導致脯氨酸大量合成，從而提高轉基因植株對逆境脅迫的耐受性。植物對滲透脅迫、干旱和病菌等的抗性可以從三方面進行考察第一，表現(xiàn)在逆境下的形態(tài)特征，第二，轉錄水平脅迫相關基因的表達量變化，第三，植物生理生化的變化也高度適應逆境抗性。脅迫相關基因轉錄水平的變化可以從分子水平提供植物抗性增強的佐證；脯氨酸的含量作為植物抗旱指標，成為衡量植物是否抗旱的生化依據(jù)，可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在滲透脅迫下的積累，有助于植物細胞降低滲透勢和水勢，減少滲透脅迫對植物的危害，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量也成為植物抗?jié)B透脅迫的重要指標；而丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，它的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。本試例通過測定野生型和轉基因型植株在不同時間干旱、鹽脅迫及病害處理下的相關基因表達量變化與各項生理指標，來研究野生型植株和轉基因型植株對干旱、鹽脅迫及病菌的耐受性。半定量RT-PCR研究結果表明，轉基因植株脅迫相關基因CaHfe、rc^a4、ifi/L、P"W.2和Pi3均隨脅迫處理時間的增加而增加，這給轉基因擬南芥抗性增強提供了轉錄水平的證據(jù)。通過生理生化指標研究得出，轉基因植株的植株含水量、可溶性糖和脯氨酸含量高于對照，而丙二醛含量低于對照，此四項指標均成為轉基因植物抗?jié)B透能力和抗旱能力提高的重要生化證據(jù)，也進一步說明過表達/ftSF2基因可能通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量從而提高轉基因擬南芥的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。ERF轉錄因子對一系列抗逆功能基因的轉錄以及對脯氨酸和糖含量的促進作用說明ERF因子在植物抗逆反應中起著重要作用。.序列表<110>中國.農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所<120>鈴鐺刺ERF轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用<130>xuliebiao012<1§0〉2<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211>855<212〉DM<213>HalimodendronhalodendronV.<400〉1ggggatgttc"tctctcacttcctcccaat"tattatattttctgtttc"tctaaagaagctg60tg肪aatgtgtggaggcgctatcatttcagacttcattggtgtgaagggtggccgg卿g120ttgCtCCgCELggacttctggtctgagcttgacccttattctgatctccttggctttgatg180taaccaccgctacttccaaacagtcaccaccacccctcccctttgataacaaa幼agtgg240aagcatgtgacaaagcggagaagaaaag犯gcctggtaactgcagagaagaagagtgggg300g聊gggtaagcg鄉(xiāng)tcgaacccgca^g3acgtgtacagaggaatcaggc犯aggccat360ggggcaagtgggccgctgaga/taagggacccacacaagggtgttcgtgtctggctcggaa420ctttcaacacagccgaagaagcagcc卿gcctacgacgccgccgccaagcgcatccgcg480gtgataaggccaaactcaatttccctgtttccaccgccaccgctgctcctccctctccg6540caacagagcacatctctaagaagcgttgcctc'agccctgatcagactagctcccaggaca600gctcg肌gcccatcgggcttgaggagatcgacctgaagcagcaaatctcagaccttgaat660ggtttcttggcttagagaatgagcaggcccaggcccaggccgtgccgctgcctggcgaag720ctgactgggacaac3Eictacatgaacctgtggatgcttgacgacgtcgttatgatgccct780acggtagtcgcttggtttactagggatttgcaaaaaa/tggaacaactttcgtgttttata840ttctcggttaattta855<210>2<211>245.<212>PRT<213>HalimodendronhalodendronV.<柳>2MetCysGlyGlyAlalielieSerAspPhelieGlyValLysGlyGly151015ArgLysValAlaProGinAspPheTrpSerGluLeuAspProTyrSer202530AspLeuLeuGlyPheAspValThrThrAiaThrSerLysGinSerPro354045ProProLeuProPheAspAsnLysl_ysValGluAlaCysAspLysAla505560GluLysLysArgSerLeuValThrAlaGluLysLysSerGlyGlyGlu65707580GlyLysArgGlyArgThrArgLysAsnValTyrArgGlylieArgGin3185ArgProTrpGlyLysTrpAlaAlaGlulieArgAspProHisLysGly100105110ValArgValTrpLeuGlyThrPheAsnThrAlaGluGluAlaAlaArg115120125AlaTyrAspAlaAlaAlaLysArglieArg'GlyAspLysAlaLysLeu130135140AsnPheProValSerThrAlaThrAlaAlaProProSerProProThr145150155160GluHislieSerLysLysArgCysLeuSerProAspGinThrSerSer165'170175GinAspSerSerLysProlieGlyLeuGluGlulieAspLeuLysGin180185190GinlieSerAspLeuGluTrpPheLeuGlyLeuGluAsnGluGinAla195200205GinAlaGinAlaValProLeuProGlyGluAlaAspTrpAspAsnAsn210215220TyrMetAsnLeuTrpMetLeuAspAspValValMetMetProTyrGly225230235240SerArgLeuValTyr2453權利要求1、從鈴鐺刺(HalimodendronhalodendronV.)中所分離的編碼乙烯反應因子的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列為以下(a)或(b)所示的堿基序列(a)SEQIDNO1所示的堿基序列；或(b)將SEQIDNO1所示的堿基序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有乙烯反應因子的功能或活性。2、按照權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列的堿基序列為SEQIDNO:l所示。3、由權利要求l或2所述cDNA序列編碼的乙烯反應因子，其特征在于該乙烯反應因子的氨基酸序列為(a)或(b)所示-(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有乙烯反應因子功能或活性的氨基酸序列。4、按照權利要求3所述的乙烯反應因子，其特征在于該乙烯反應因子的氨基酸序列為SEQIDNO:2所示。5、含有權利要求1或2所述cDNA序列的植物表達載體。6、按照權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于該植物表達載體是PC1302-HhERF2;其中，所述HhERF2的堿基序列為SEQIDNO:1所示。7、包含權利要求5所述植物表達載體的植物細胞。8、權利要求1或2所述cDNA序列在提高植物抗逆性中的應用。9、按照權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的應用包括構建含有權利要求1或2所述cDNA序列的植物表達載體；將該植物表達載體轉化到植物細胞中，使所述cDNA序列在植物中表達。10、權利要求3所述的乙烯反應因子在提高植物抗逆性中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了鈴鐺刺ERF轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用，屬于植物基因工程領域。本發(fā)明通過RACE-PCR技術從沙生植物鈴鐺刺中分離、克隆到新的ERF2轉錄因子基因HhERF2(SEQIDNO1)。組織特異性表達結果顯示，本發(fā)明基因在鈴鐺刺的根、莖、葉中均有表達；脅迫反應檢測結果顯示，本發(fā)明基因的表達受干旱、高鹽和低溫環(huán)境逆境的誘導，并且其表達不依賴于ABA的調(diào)控。將本發(fā)明cDNA序列轉化到擬南芥進行過表達，對轉基因擬南芥進行干旱、高鹽、低溫及病害等抗逆性分析并且對其相關生理生化指標進行測定，實驗結果表明，本發(fā)明cDNA序列可有效地提高植物的抗旱性、滲透脅迫抗性和抗病性。文檔編號C12N5/10GK101503693SQ20091007903公開日2009年8月12日申請日期2009年3月3日優(yōu)先權日2009年3月3日發(fā)明者吳燕民,唐益雄,陰翠翠申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所